Para começar, navegue até o site do NCBI para recuperar o gene necessário da variedade Japonica Rice. Baixe e acesse o genoma de referência no software genético SNAP. Analise as inserções ou deleções e polimorfismos de nucleotídeo único dentro da sequência exônica de O-S-S-B-E 2B da variedade X134, comparando-a com o genoma de referência.
usando a ferramenta NCBI primer blasts, projete primers, flanqueando as regiões dos éxons. Para validar a sequência exon do gene O-S-S-B-E 2B em X134 por sequenciamento de Sanger, prepare a reação e execute o programa de PCR com as configurações apropriadas. Projete o RNA guia único, ou SGRNA na sequência do éxon OSB 2B de X134, aderindo ao protocolo, e certifique-se de que a sequência do motivo adjacente ao protoespaçador seja TTN.
Adicione um CAC OLIGOS nas cinco extremidades principais do primer direto e GGCC OLIGOS nas cinco extremidades principais do primer reverso. Depois de dissolver os primers, misture um microlitro de cada primer com oito microlitros de tampão de recozimento. Coloque a mistura na máquina de PCR e execute o programa de recozimento.
Monte o S-G-R-N-A no vetor de edição do genoma e execute o programa de montagem de PCR. Transforme o vetor resultante em células de escherichia coli e realize a amplificação por PCR em colônias individuais para rastrear inserções bem-sucedidas para confirmar a clonagem bem-sucedida usando o sequenciamento de Sanger.
