Para começar, obtenha o RNA SG e transforme o Agrobacterium com o DNA plasmático. Transplante as plantas transgênicas em vasos e cultive-as por um mês em uma estufa. Para testar o tipo de mutação, colete dois a três miligramas de folhas frescas de cada perfilho de uma única muda como uma única amostra usando protocolos estabelecidos.
Extraia o DNA genômico das amostras de folhas coletadas. Projete primers de PCR para amplificar a região do gene SBEIIb ao redor do local alvo do RNA de guia único para obter um fragmento amplificado de 493 pares de bases de comprimento. Sequencie os fragmentos de PCR diretamente usando o método Sanger para identificar mutações.
Selecione as linhas E0 exibindo mutações de mudança de quadro homozigóticas e plante-as em uma estufa para obter sementes. Em seguida, colha folhas de mudas de duas semanas e extraia o DNA genômico da planta. Realize PCR genômico usando o programa apropriado para detectar a presença de higromicina, UBI e Cascoset no genoma da planta.
Analise os produtos de PCR usando eletroforese em gel para identificar linhas que não apresentam bandas indicando que são linhas E1 livres de transgenes. Colha as sementes dessas linhas selecionadas. As plantas mutantes exibiam uma aparência cerosa totalmente opaca em seus grãos, ao contrário da aparência translúcida dos grãos do tipo selvagem.
Não foram observadas diferenças significativas entre as mutantes SBEIIb e as plantas selvagens em termos de taxa de pega de sementes, grãos por panícula e produtividade por planta.
