Para começar, coloque um tubo de 50 mililitros no gelo e adicione uma solução de colágeno junto com outros componentes sequencialmente. Agite o tubo para misturar bem. Usando uma pipeta P10, adicione uma solução molar de hidróxido de sódio gota a gota enquanto agita a solução de mistura para ajustar o pH para 7,3.
Adicione 1,25 mililitros de matriz de membrana basal à mistura de colágeno de cinco mililitros e misture a solução suavemente. Em seguida, coloque um prato de 12 poços no gelo por dois minutos. Usando pontas de furo largo, adicione a mistura de matriz de membrana basal de colágeno lentamente à placa de 12 poços.
Coloque a placa de 12 poços na incubadora de 37 graus Celsius por duas horas para solidificar a primeira camada de hidrogel. Mantenha a mistura restante de colágeno e matriz de membrana basal no gelo para uso posterior. Em seguida, transfira aproximadamente 60 agregados de células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
E deixe esfriar o tubo no gelo por cinco minutos. Usando uma ponta de pipeta P200, remova cuidadosamente o meio do tubo. Adicione 1,5 mililitros da mistura de colágeno de uma membrana basal, gota a gota aos agregados celulares, e misture-os suavemente usando uma ponta de pipeta P200 de diâmetro largo para ressuspender.
Transfira a placa com a primeira camada de hidrogel da incubadora para o gabinete de biossegurança. Adicione 1,5 mililitros da suspensão de agregados na camada de hidrogel curado e agite suavemente a placa para distribuir os agregados uniformemente. Incube a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por duas horas.
Pré-aqueça o meio de diferenciação vascular dois em banho-maria a 37 graus Celsius por 20 minutos. Adicione dois mililitros de meio a cada poço e cultive as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Troque o meio a cada três dias com o meio de diferenciação vascular dois pré-aquecido fresco.
Os organoides expressaram CD31, ERG1 e PDGFR beta, indicando a presença de células endoteliais vasculares e parasitas. As redes vasculares foram visualizadas por meio de microscopia de imunofluorescência de montagem total após a limpeza do tecido. Organoides maduros corados no dia 17 mostraram redes vasculares encapsulando os esferoides dentro do bloco de gel.
Os organoides recuperados no dia 28 tinham redes vasculares envolvendo os esferoides em vez de se expandirem radialmente.
