Este protocolo nos permite criar uma complexa estrutura 3D que se assemelha muito ao coração humano em desenvolvimento de uma forma simples e econômica, que é reprodutível através das linhas celulares. Consiste em um único protocolo com três passos de diferenciação, o que dá origem a todos os tipos celulares do coração, incluindo câmaras e uma rede vascular. Essa técnica nos permite modelar uma ampla gama de doenças cardiovasculares humanas e testar tratamentos farmacológicos eficazes.
Graças à natureza de alto rendimento de seu design. Este método é útil para investigar o coração humano em desenvolvimento, bem como doenças comumente associadas a ele. Um deles é defeito cardíaco congênito.
Este protocolo requer habilidades básicas de cultura celular. Recomendamos tubos atentos e delicados, bem como manuseio suave dos organoides. Comece criando corpos embrionários ou EBs dois dias antes da diferenciação.
Lave HPSCs subconfluentes com DBPS por pelo menos 10 segundos. Em seguida, aspire o DPBS. Adicione um mililitro de ACUTA de temperatura ambiente e bata suavemente na placa aproximadamente cinco vezes por minuto durante três a cinco minutos para induzir o desprendimento, enquanto estiver verificando sob o microscópio.
Em seguida, adicione um mililitro de meio PSC e Thias Avin ou Thias para parar a reação. Pipeta a mídia para cima e para baixo no poço, duas a três vezes para gerar uma única suspensão celular e coletar as células. Em seguida, transfira a suspensão celular única para um tubo de centrífuga e gire por cinco minutos a 300 vezes G.Aspire o supernasce e repasse as células em um mililitro de meio PSC e Thias.
Diluir as células em DPBS. Conte as células usando um contador celular ou cistometro hemo e dilua as células em meio PSC com Thias a uma concentração de 100.000 células por mililitro. Adicione 100 microliters de suspensão de células diluídas a cada poço de uma placa de fundo ultra baixa 96.
Centrifugar a placa a 100 vezes G por três minutos e incubar por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após 24 horas remova cuidadosamente 50 microliters de médio de cada poço e adicione 200 ninhadas de tamanho baixo de PSC médio fresco, quente a 37 graus Celsius para um volume de 250 microliters por poço. Incubar as células por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Remova 166 microliters ou dois terços do meio de um lado de cada poço, e adicionar 166 microliters de RPMI 1640 contendo suplemento B27 livre de insulina, seis 990211 de animação micromolar, 0,875 nanogramas por mililitro de proteína morfogenética óssea quatro e 1,5 nanogramas por mililitro de Activin A.Incubar por 24 horas a 37 graus Celsius e 5%dióxido de carbono. Após 24 horas remova 166 microliters de meio de um lado de cada poço e adicione 166 microliters de RPMI fresco 1640 com suplemento B27 livre de insulina. Incubar por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Para induzir a especificação do mesoderm cardíaco no segundo dia, remova 166 microliters de médio de cada poço e adicione 166 microliters de RPMI 1640, contendo suplemento B27 livre de insulina e três micromolar Wnt-C59 e continue a incubação por 48 horas. No quarto dia, remova 166 microliters de médio de cada poço e adicione 166 microliters de RPMI fresco 1640 com suplemento B27 livre de insulina, depois incubar mais 48 horas. No sexto dia, remova 166 microliters de médio de cada poço e adicione 166 microliters de RPMI 1640 com suplemento B27.
Para isso e todas as alterações posteriores da mídia, use suplemento B27 com insulina, incubar por mais 24 horas. No sétimo dia, a cultura celular está pronta para diferenciação pro epicárardia. Remova 166 microliters de médio de cada poço e adicione 166 microliters de RPMI fresco 1640 contendo suplemento B27 e três micromolar cheer 99021.
Em seguida, incubar por uma hora, após uma hora remover a placa da incubadora, remover 166 microliters de meio de um lado de cada poço e adicionar 166 microliters de RPMI fresco 1640 contendo suplemento B27 continuar incubação por mais 48 horas. Repita este processo a cada 48 horas até a coleta. Organoides estão prontos para análises e experimentações no dia 15 Para transferir todos os organoides, corte a ponta de uma pipeta P200, de cinco a 10 milímetros da abertura com um diâmetro de aproximadamente dois a três milímetros.
Pressione o êmbolo da pipeta e insira a ponta verticalmente no fundo redondo bem com o organoide. Pegue aproximadamente 100 a 200 microliters de médio o suficiente para coletar os organoides e transferi-los para o destino alvo. Antes da diferenciação, o EBS aparece como massas esféricas dos negros, o processo de diferenciação começa no dia zero com uma ativação de via wnt e adição de fator de crescimento por exatamente 24 horas.
Além disso, a edição do WNT C59 no segundo dia resulta em ampliação do organoide de aproximadamente 200 micrômetros para um máximo de um milímetro. Os organoides do coração humano começaram a bater logo no sexto dia e 100% dos organoides mostraram batidas visíveis no dia 10. Imagens de alta ampliação do dia sete organoide revelaram que a maioria das células expressas de mãos eram cardiomiócitos de origem e duas mãos eram células não mísitas do segundo Heartfield, células progenitoras.
As transcrições de RNA para mão um e duas mãos foram expressas a partir do terceiro dia em dados de sequenciamento de RNA. Os marcadores FHF foram altamente expressos durante os dias três e 11, enquanto o marcador SF foi mais expresso após o dia 13. A mancha de imunofluorescência revelou a presença de várias linhagens do tipo células cardíacas humanas que compõem o coração humano.
Como tecido miocárdio e epicardial, células do endocárdio, células endoteliais e fibroblasto cardíaco. Os marcadores que expressam as linhagens celulares acima também foram observados nos perfis de expressão genética RNA SAC. A imagem viva de cálcio de células individuais em organoides inteiros foi usada para medir a função eletrofisiológica dos organoides.
A intensidade da fluorescência fluo-4 variou ao longo do tempo devido à saída de entrada de cálcio da célula revelando potenciais de ação regulares. Mapas de calor mostrando intensidades de cálcio sobre uma região de alta ampliação do organoide, mostram aumento da intensidade devido aos transitórios de cálcio e células individuais. Ao tentar este protocolo, tenha em mente que os EBs e organoides subsequentes não estão ligados à parte inferior da placa, e vamos nos mover com a remoção, além de mídia que exige mudanças atentas na mídia.
Organoides podem ser cultura por períodos mais longos de tempo introduzidos em técnicas de maturação, ou mesmo expostos a estímulos externos, como condicionamento mecânico ou elétrico, e até estressores como toxinas. Essa técnica permite, como acesso a estágios do desenvolvimento do coração fetal humano, que de outra forma são inacessíveis na pesquisa, abrindo caminho para novas percepções sobre o desenvolvimento cardíaco e etiologia de doenças.
