Este trabalho foi financiado pelo Centro de terapias regenerativas, a Faculdade de Medicina da TU Dresden, ea DFG Collaborative Research Center SFB655 (A20 subprojeto). BA foi apoiado por uma bolsa do programa CAVE-BB, Dresden. Agradecemos os drs. Noriko Osumi, Tadashi Nomura, Dieter Lie Chichung e Ravi Jagasia para o conselho precioso durante a criação de no útero eletroporação e injeção viral estereotáxica.

Nota preliminar A cirurgia deve ser realizada por pesquisadores treinados totalmente após a aprovação das autoridades locais para o bem-estar animal. Todas as precauções devem ser tomadas para minimizar a dor eo estresse causado ao animal, incluindo anestesia profunda, a administração de analgesia pós-operatória e, para operações que duram mais de 10 minutos, a aplicação de um lubrificante ocular para evitar a desidratação da córnea e cegueira. Ratinhos anestesiados deve ser mantido constantemente aquecido a 37 ° C até à recuperação completa e cada ferramenta cirúrgica e solução tem de ser estéril. Embora o uso de uma capa biológica não é estritamente necessário, o operador deve tomar todas as precauções razoáveis ​​para minimizar a possibilidade de infectar o animal durante a operação, vestindo um jaleco, máscara e luvas. Da mesma forma, cada passo sobre a geração e utilização de vírus deve ser autorizado e deve ser realizada em áreas S2 de acordo com os regulamentos das autoridades locais.Finalmente, uma descontaminação completa de todas as ferramentas e superfícies que poderiam ter estado em contacto com o vírus deve ser realizado de acordo com as práticas de instalações aprovadas de desinfecção (por HIV, limpando com 70% Et-OH e / ou autoclavagem). Parte 1: Expansão do embrionário NSC 1. Em electroporação utero <ol><li> Após a clonagem (isto é, os transgenes cdk4/cyclinD1) em PCMS-EGFP (Clontech) ou pDSV-mRFPnls vetores 16, purificar os plasmídeos utilizando kit EndoFree e ressuspender em PBS estéril a uma concentração de 3-5 ug / uL. Logo antes da cirurgia, misturar os plasmídeos com FastGreen 0,05% em PBS a uma razão final de ca. 4:04:01 e centrifugar a mistura durante 2 min a 16000 xg para remover todo o precipitado. </li><li> Coloque a mistura de DNA em um vidro de borosilicato anteriormente puxado capilar. Parâmetros puxando usando um P-97 pipeta extrator são: tração: 200; vel: 140; tempo: 140. O calor é determinada por um teste de rampa e depende da especificaçãoific lote de capilares a ser utilizado. Montar o tubo capilar sobre o bocal do PicoPump que está perto do in utero eletroporação plataforma (Figura 1A) e, sob um microscópio estereoscópico, e dobrar a ponta nick-a no ponto de inflexão. </li><li> Esterilizar todos os instrumentos de cirurgia em uma conta de vidro seco esterilizador e profundamente anestesiar um rato grávida no dia 12-15 de gestação usando um vaporizador isoflurano. Colocar o animal na posição supina sobre uma plataforma de aquecimento regulado a 37 ° C e manter sob administração de isoflurano constante por meio de um cone de nariz. </li><li> Raspar a pele do abdómen, desinfectar, com tempos de Betaisodona múltiplas, eventualmente limpando em meio com 70% de etanol, e injectar a buprenorfina (diluído em PBS) por via subcutânea, a 0,1 mg / kg de concentração como preventivo analgésico. Com uma tesoura fina, fazer um corte longitudinal 2 centímetros da pele e, em seguida, a parede de base muscular para aceder à cavidade peritoneal. Dispense na ca cavidade peritoneal. 2ml de solução IUE (D-PBS contendo 100 U / ml de pen / strep) previamente aquecida a 37 ° C e manter a solução em um bloco de aquecimento. </li><li> Cobrir o rato com drap estéril contendo uma fenda a partir do qual os úteros serão removidos. Retrair a incisão com afastador de tungstênio, identificar o útero e puxe-o segurando-o com uma pinça entre embriões adjacentes (Figura 1B; esquerda) e finalmente colocá-lo para baixo no drap estéril. Durante toda a operação, lavar o útero com IUE solução para hidratar a cavidade do corpo e órgão e evitar a desidratação do animal. </li><li> Lidar com o útero cuidadosamente segurando-o entre o polegar eo indicador e rode um embrião até a sua cabeça é visível e orientada para o operador. Identificar os hemisférios telencefálicos e injetar um deles do lado dorso-lateral. Libertar 1-2 ul da solução de ADN, utilizando o interruptor de pé de um PicoPump até o ventrículo está delineada por FastGreen (Figura 1B; direita). </li><li&gt; Local ânodo dos eléctrodos no local da injecção e o cátodo no lado contralateral (Figura 1C) e entregar 6 impulsos de 30 V para 50 ms com 950 ms de intervalo entre cada pulso usando um electroporador de forma quadrada gerar campos eléctricos operados através de um pedal. Evite colocar os eletrodos perto da placenta, pois isso pode causar hemorragia e danos ao embrião. </li><li> Quando todos os embriões são injetadas e eletroporadas, coloque o útero de volta para a cavidade abdominal e fechar as paredes musculares com um fio de sutura sutura cada 3-4 mm. Os nós deve ser confortável para o músculo, mas não demasiado apertado para permitir que um pouco de inchaço do tecido. Finalmente, feche a pele sobrejacente usando clipes de metal. Desinfectar a pele com Betaisodona, retire o rato da máscara de isoflurano e transferi-lo em uma gaiola habitação quando totalmente acordado. Monitorizar a recuperação do rato até que o comportamento locomotor é normal. </li></ol> 2. Processamento da samsoas <ol><li> Um ou mais dias após a electroporação, o sacrifício do rato, recolher os embriões e identificar aqueles correctamente electroporação usando um estereomicroscópio fluorescente (Figura 1D). Dissecar os cérebros em PBS gelado, e fixá-los durante a noite, em PFA a 4% (de paraformaldeído em tampão fosfato pH 7,4). Eventualmente, BrdU pode ser administrado antes sacrifício de acordo com diferentes paradigmas para investigar cinética do ciclo celular e proliferação celular 3. </li><li> Os cérebros são então processados ​​para seccionamento e coloração imunológica para os vários marcadores de células gliais radiais, progenitores basais e neurónios (PAX6, nestina, Tbr2, Tbr1, TUJ1 etc), para avaliar o efeito dos transgenes funcionais no NSC-alvo e sua progénie que são identificado pela expressão do gene repórter co-electroporated. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1.Em eletroporação utero. (A) Representação esquemática de uma plataforma no útero eletroporação. (B) Desenhos mostrando o posicionamento do rato prenhe durante a cirurgia (direito) e a injecção da mistura de DNA / FastGreen (azul), no hemisfério telencefálica de um embrião de rato (à esquerda). (C) Esquema mostrando a colocação dos eléctrodos em contacto com as paredes do útero, com o ânodo (+) adjacente ao sítio de injecção (azul). As setas indicam a migração de DNA para o ânodo. (D) Imagem de um rato hr 24 embrião após a eletroporação com plasmídeos GFP no dia embrionário 13. A linha tracejada demarca o hemisfério telencefálico. Esquema em A modificado a partir Calegari et al., 2004 17. Parte 2: Expansão do Adulto NSC 1. A produção de derivados de HIV-partículas virais <ol><li> Dia 1: placa de 5 x 10 6 293T células numa cm 10prato com 8 ml de D-MEM contendo 10% de soro fetal inactivado pelo calor de bovino e 100 U / ml de pen / strep (meio de cultura). Usar 15 pratos para uma preparação viral e cultura durante a noite a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Dia 2: para cada prato, dilua em 1 ml de D-MEM sem formatação de 5 ug de cada um dos três plasmídeos codificando para i) proteína de envelope VSVG (tipo vírus da estomatite vesicular G), ii), gag / pol (grupo antigénio específico / polimerase) e iii) uma construção policistrónica expressando os transgenes funcionais e repórter (ou seja, cdk4/cyclinD1/GFP) previamente clonado num vector de transferência do VIH-based (p6NST90) 9. Misturar a solução com 1 ml de D-MEM contendo 45 ul de polietilenimina que tenha sido previamente dissolvido em PBS a 1 mg / ml de solução concentrada, e incuba-se durante 15-30 minutos à temperatura ambiente. Enquanto isso, remova a mídia a partir de células e adicionar 4 ml por prato de doce D-MEM contendo 15% de calor soro fetal bovino inactivado e 100 U / ml de pen / strep. Adicionar a m 2l da mistura de transfecção e cultura durante a noite. </li><li> Dia 3: adicionar 120 ul de 500 mM Na-butirato por prato para aumentar a expressão dos transgenes, misturar suavemente e cultura durante 6-8 horas após o qual substitui o meio de transfecção com 5 ml de meio de cultura. </li><li> Dia 4: recolhem-se os sobrenadantes (total ml ca. 70), passar através de um filtro de 0,22 ^ M e de transferência, em 2 tubos de centrífuga de polialómero (35 x 89 mm). Ultracentrífuga a 110.000 xg durante 90 min a 4 ° C utilizando um rotor oscilante. Rejeitar o sobrenadante, adicionar 6 mL de PBS a cada tubo e incubar em gelo durante 1 hr. Ressuspender o sedimento e transferi-lo para um tubo de centrífuga polialómero (14 x 95 mm). Ultracentrífuga a 110.000 xg durante 90 min a 4 ° C utilizando um rotor oscilante. Rejeitar o sobrenadante, ressuspender o sedimento em 50 ul de PBS, fazer alíquotas de 5 ul e armazenar a -80 ° C. Título virai irá estar no intervalo de 10 8 -10 9 cfu / ml. (Nota: os vírus são muito sensíveis à temperatura e armazenamento, avoID de recongelamento, manter em gelo seco durante o transporte e descongelar logo antes do uso.) </li></ol> 2. Injeção estereotáxica <ol><li> Anestesiar um rato 6-10 semanas de idade com isoflurano e colocar o animal em decúbito ventral sobre uma estrutura estereotáxica (Figura 2A), utilizando as barras de orelha e o suporte paladar para fixar correctamente a cabeça. O animal é mantido quente sobre uma almofada de aquecimento regulado a 37 ° C e sob administração de isoflurano constante. </li><li> Injectar por via subcutânea 100 ml de solução buprenorfina trabalhando como preventivo analgésico, raspar uma faixa de pele sobre a cabeça do rato, e desinfectares como descrito em 1.4. Usando um bisturi, faça uma ca. 1,5 centímetros longa incisão longitudinal na pele, cabeça expor o crânio no nível da sutura sagital. Retrair a pele e limpe cuidadosamente a superfície do osso com um cotonete estéril. </li><li> Half-encher um copo capilar (especificações 1.2) com óleo de parafina e montá-lo na bomba injetora inserindoo capilar até ao segundo anel (Figura 2B). Mover o suporte do capilar no eixo x, y e z, até a ponta do capilar é posicionado sobre a bregma, o ponto de articulação entre as suturas sagital e lateral (Figura 2C) (a ser determinado com a ajuda de um estereomicroscópio), e re set-x, y, z e os valores para 0. </li><li> Mova o capilar de ± 1,6 mm no eixo médio-lateral (x) e -1,9 mm no eixo ântero-posterior (y) e marcar o osso usando uma caneta marcador cirúrgico. Fazer um buraco de ca. 0,5 mm de diâmetro sobre o crânio, usando um furador eléctrico prestar atenção para não danificar o cérebro. </li><li> Colocar uma gota de 5 ul de suspensão viral (uma aliquota) sobre um pedaço de parafilm colocada nas barras de ouvido e mergulhar a ponta do capilar na gota. Sugar ca. 3,5 ul de suspensão viral utilizando um injector nanolitro fixado em 55 nl / seg. Executar este passo rapidamente como a gotícula irá evaporar-se. </li><li> Mover o capilar para o local of injeção e movê-lo para baixo até a ponta toca a superfície pial. Redefinir o valor do eixo dorso-ventral (z) a 0. Neste ponto, penetram no tecido com o capilar para -1,9 mm e libertar 1,5 ul de suspensão virai a uma taxa de 4 nl / seg. Esperar durante 2-3 minutos, para minimizar o refluxo de suspensão viral através da pista capilar e, em seguida, retirar o tubo capilar. Uma segunda injecção pode ser realizada no hemisfério controlateral. </li><li> Sutura da pele, desinfectar, e permitir que o animal recuperar da anestesia, como descrito anteriormente para in utero de electroporação (1,8). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Injecção estereotáxica viral. (A e B) Representação esquemática dos componentes necessários para a realização da injecção estereotáxica (A) e um suporte de capilar desmontada mostrando a inserção de uma capillary até que o segundo anel (B). (C) Imagem da cabeça de rato imobilizada por as barras de suporte do ouvido e palato com a pele cortada para expor o crânio (à esquerda). A ampliação da caixa a tracejado (direita) mostra as suturas sagital e laterais, a bregma, e do local de injecção (círculo). 3. Processamento da amostra <ol><li> Uma a três semanas após a infecção, perfundir o rato com ca. 100 ml de PFA 4%, dissecar o cérebro e pós-corrigi-lo durante a noite em PFA 4%. Eventualmente, BrdU e / ou tamoxifeno pode ser administrado antes do sacrifício de acordo com diferentes paradigmas para investigar cinética do ciclo celular e para interromper a expressão dos transgenes virais flanqueadas por locais loxP, respectivamente 9. </li><li> O cérebro pode então ser processado para imunocoloração utilizando vários marcadores de células tronco e progenitoras e neurónios (eg Sox2, GFAP, nestina, Tbr2, doublecortin, etc). </li></ol>

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BA e FC apresentaram um pedido de patente que descreve a expansão condicional de células-tronco adultas somáticas por cdk4/cyclinD1 vírus (PE 10.160.288,6).

Um passo crítico para electroporação em útero é a qualidade ea pureza do ADN, desde a sua migração direccional durante a entrega dos campos eléctricos depende da sua carga. Os protocolos para a purificação de ADN que não incluem a remoção de outras moléculas carregadas, tais como endotoxinas, pode levar ao mascaramento das cargas negativas de ADN naturais que levam a entrega pobre. Claramente, tocar nas paredes uterinas com os eléctrodos de tão perto quanto possível da área a ser alvo irá melhorar a eficiência de electroporação. Igualmente importante é a qualidade dos eléctrodos utilizados uma vez que esta é fundamental para a entrega de óptimos campos eléctricos. Micro-arranhões nem sequer visíveis a olho nu e / ou resíduos orgânicos, tais como traços de soro, lípidos, e assim por diante, vai inevitavelmente se acumulam ao longo do tempo que conduz a eléctrodos de perder as suas propriedades. Electropes velhos e / ou suja são a causa mais provável de uma queda repentina na eficiência electroporação e, portanto, deve ser replaced logo que este é notado. Embora relativamente simples, em eletroporação utero normalmente exige algumas semanas de treinamento, a fim de atingir de forma satisfatória e reprodutibilidade dos resultados. Esta técnica é muito versátil uma vez que podem ser aplicadas, virtualmente, a qualquer órgão e tecido do embrião em desenvolvimento. Certamente, os órgãos que contêm uma cavidade, tal como o cérebro, são particularmente fáceis de orientar e permitir uma elevada percentagem de células transfectadas devido à facilidade de injectar um volume relativamente grande de DNA. Um problema comum encontrado na criação de injecção estereotáxica viral é ter poucas células infectadas e / ou para definir áreas indesejadas. O primeiro problema está principalmente relacionado com a injecção de vírus de título baixo. As células 293T com menor número de passagens em cultura de crescer mais rapidamente e levam a maiores títulos virais. Utilizando células com mais de ca. 20 passagens não é recomendado e meios de transfecção com menos de 80% de eficiência não permitem assegurar uma boaprodução viral. Ressuspender o sedimento viral é também crítico, a suspensão viral tem a aparecer tufos homogéneos e virais que poderiam obstruir os capilares têm que ser evitadas. Os vírus são muito sensíveis à temperatura cai e armazenamento a longo prazo. Por estes motivos, as alíquotas de ser permanentemente armazenado a -80 ° C e não pode ser novamente congelado. Mesmo sob estas condições, uma diminuição na infecciosidade pode ser observada depois de 6-12 meses de armazenamento. Nas fases de aprendizagem, sugere-se a testar o título virai de cada preparação viral e para fazer de novo após armazenamento a longo prazo. A presença de células infectadas em áreas não desejadas do cérebro pode depender de um posicionamento suboptimal da cabeça do rato sobre a armação estereotáxica, que requer alguma prática. Além disso, é essencial para não danificar a superfície do cérebro enquanto que a abertura do orifício no crânio, porque de outro modo não será possível para restaurar o 0 correctamente na superfície pial, resultando em injecção imprecisa. As coordenadasque no presente Protocolo são referidos C57/BL6 6-10 semanas de idade e fêmeas sugerimos otimizando-as para diferentes cepas / idade / sexo. Aquisição desta técnica pode exigir mais tempo do que no útero devido à electroporação as fases mais longos necessários para preparar os vírus e analisar as amostras. Recomendamos fortemente que os vírus só são utilizados após a cirurgia do mouse e injeção estereotáxica tornaram-se confiável e reprodutível. O primeiro passo para alcançar este objectivo é injectar células permeantes corantes de ADN, tais como a Hoechst 33342, em ratos submetidos a eutanásia e analisar os cérebros imediatamente. In utero eletroporação e injeção viral estereotáxica são dois sistemas poderosos para aguda e tecido-específica manipular a expressão de genes dentro do SNC durante o desenvolvimento dos mamíferos e idade adulta. Apesar da sua limitação em alvejar apenas uma sub-população de células, esses sistemas proporcionam uma velocidade sem precedentes e facilidade, em comparação com métodos mais convencionais, in particular a geração laborioso e demorado de ratinhos transgénicos. No entanto, apesar dessa semelhança, existem várias diferenças entre as duas técnicas que merecem destaque. Em primeiro lugar, no que respeita à orientação dos diferentes tipos celulares, de electroporação utero conduz inicialmente para a transfecção de células estaminais adequadas (também chamado de células da glia radial), porque estas são as únicas células que delimitam o ventrículo, onde o DNA é injectada. Como resultado de divisões celulares, plasmídeos vai subsequentemente ser herdado de alvo, as células estaminais da mãe para a sua progenitora e / ou células filhas neuronais levando a redistribuição de células transfectadas em todo o córtex como uma função do tempo. Em contraste, o uso dos lentivírus HIV no cérebro adulto leva à infecção simultânea de qualquer tipo de células, incluindo as células estaminais, progenitoras, bem como neurónios maduros células gliais. De notar, no que diz respeito ao uso de lentivírus HIV em oposição a retrovírus mais vulgarmente utilizados é o factoque a integração lentiviral iria ocorrer independentemente do estado mitótico das células, permitindo assim que a segmentação também de adultos, as células estaminais quiescentes. Em segundo lugar, uma outra diferença importante entre a electroporação e infecção viral é a de que uma expressão transitória episomal é conseguido pelo primeiro, em oposição à integração irreversível de ADN no genoma das células infectadas obtidos por este último. Como resultado das divisões celulares sucessivas, a diluição dos plasmídeos electroporadas e degradação da proteína cyclinD1 ectópica, poderia advir em cada ciclo celular. Assim, a expansão da NSC durante o desenvolvimento embrionário foi demonstrado que apenas é de aproximadamente dois dias 15, enquanto no cérebro adulto este efeito foi encontrado para a duração de vários meses (resultados não publicados). Terceiro, uma vez que i) cdk4/cyclinD1 tem um forte efeito sobre as células com um longo G1 e ii) cometidos progenitores neurais durante o desenvolvimento tem um ciclo celular maisdo que as células-tronco, enquanto o oposto é verdadeiro na vida adulta, os nossos dois manipulações foram encontradas para desencadear a expansão, principalmente, de progenitores neurais durante o desenvolvimento e células-tronco durante a vida adulta. Em ambos os casos um aumento nos neurónios tem sido alcançada por ambos os métodos. Injecção, quarta viral pode ser facilmente realizado, de forma fiável e reprodutível, em muitas regiões diferentes do cérebro adulto, simplesmente mudando as coordenadas estereotáxicas. Em contraste, o direccionamento preciso de certas regiões do sistema nervoso central, tais como o tronco cerebral, hipocampo, ou da medula espinhal, por electroporação em utero pode ser mais difícil de conseguir de forma reprodutível. Além disso, enquanto que a injecção estereotáxica podem ser realizadas em ratos de qualquer idade, o desempenho óptimo de electroporação no útero está limitado de cerca de E11 a E16. Estágios antes de E11 exigiria a utilização de um microscópio de backscatter de ultra-som 18,19 ou um culto todo embriãoure sistema 17,20. Recentemente, um crescente interesse em biologia celular básica de células-tronco somáticas foi promovido porque o seu estudo e manipulação são considerados fundamentais para o desenvolvimento de novas terapias baseadas em células regenerativas. Em particular, para a superexpressão de cdk4/cyclinD1, o nosso protocolo fornece os meios para aumentar transitoriamente a expansão da NSC in vivo (Figura 3B e 4B e C e C), a fim de aumentar o número de neurónios gerados no cérebro adulto. Acreditamos que estas manipulações podem ser importantes em vários contextos diferentes para melhor compreender o papel da NSC no desenvolvimento do cérebro, evolução e homeostase, bem como a sua contribuição para a função cognitiva ou recuperação a partir de degeneração neural ou lesão.

<table border="1"><tbody><tr><td> Material / equipamento </td><td> Fornecedor </td><td> Catalogo </td><td></td></tr><tr><td> Endofree kit maxi plasmídeo </td><td> Qiagen </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> FastGreen </td><td> Sigma </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> P-97 Flaming / Brown pipeta extrator </td><td> Sutter Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Borosilicato capilares com filamento </td><td> Sutter Instruments </td><td> BF120-69-10 </td><td></td></tr><tr><td> Mesa de laboratório sistema de anestesia de animais </td><td> VetEquip </td><td> 901806 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> Baxter </td><td> HDG9623 </td><td></td></tr><tr><td> Germinador 500 contas de vidro esterilizador </td><td> Southpointe Cirúrgica </td><td> GRM5-1460 </td><td></td></tr><tr><td> Iris fórceps </td><td> WPI </td><td> 15917 </td><td></td></tr><tr><td> Solução Betaisodona </td><td> Mundipharma </td><td> 1931491 </td><td></td></tr><tr><td> Bomba Pico </td><td> WPI </td><td> PV820 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 electroporador onda quadrada </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 450052 </td><td></td></tr><tr><td> Rodada eletrodos pinça </td><td> NEPAGENE </td><td> CUY650P1 </td><td></td></tr><tr><td> Material de sutura </td><td> Ethicon </td><td> V493H </td><td></td></tr><tr><td> Reflexoaplicador de clipe para o fechamento da ferida </td><td> WPI </td><td> 500345 </td><td></td></tr><tr><td> Solução de injecção Temgesic </td><td> Essex Pharma AG </td></tr><tr><td> DMEM w / Glutamax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 31966021 </td><td></td></tr><tr><td> Soro Fetal Bovin </td><td> Invitrogen </td><td> 1027016 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> Placa de cultura de tecido </td><td> Falcão </td><td> 353003 </td><td></td></tr><tr><td> Polietilenimina 250 ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 40.872-7 </td><td></td></tr><tr><td> ácido n-butírico, sal de sódio </td><td> Sigma </td><td> B 5887 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Tube, thinwall, polialómero </td><td> Beckman </td><td> 326823/331374 </td><td></td></tr><tr><td> Modelo 900 instrumento estereotáxico de pequenos animais </td><td> Kopf Instruments </td><td></td><td></td></tr><tr><td> OPMI microscópio pico </td><td> Zeiss </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SYS-Micro4 controlador e Nanoliter2000 injetor </td><td> WPI </td><td> B203MC4 </td><td></td></tr><tr><td> Vidro de substituição 3,5 nanolitro </td><td> WPI </td><td> 4878 </td><td></td></tr><tr><td> SR broca aplicação geral </td><td> Foredam </td><td> K2272 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td><strong&gt; Anticorpo </td><td> Fornecedor </td><td> Catalogo </td><td> Diluição </td></tr><tr><td> Doublecortin </td><td> Santacruz </td><td> SC8066 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Chemicon </td><td> MAB3404 </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> Nestina </td><td> BD Biosciences </td><td> 556309 </td><td> 1:1000 </td></tr><tr><td> S100β </td><td> Abcam </td><td> Ab868 </td><td> 1:1000 </td></tr><tr><td> Sox2 </td><td> Millipore </td><td> AB-5603 </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> Tbr2 </td><td> Abcam </td><td> Ab23345 </td><td> 1:400 </td></tr><tr><td colspan="4"> Tabela de anticorpos. </td></tr></tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

expansion of embryonic and adult neural stem cells by in utero electroporation or viral stereotaxic injection

As células-tronco somáticas pode dividir para gerar células-tronco adicionais (expansão) ou tipos de células mais diferenciadas (diferenciação), o que é fundamental para a formação de tecido durante o desenvolvimento embrionário e homeostase do tecido durante a vida adulta 1. Atualmente, grandes esforços são investidos para o controle do interruptor de células-tronco somáticas de expansão para a diferenciação, porque este é pensado para ser fundamental para o desenvolvimento de novas estratégias para 1,2 medicina regenerativa. No entanto, um dos principais desafios no estudo e utilização de células somáticas com células-tronco é que a sua expansão foi provado muito difícil de controlar. Descrevemos aqui um sistema que permite o controlo das células estaminais / progenitoras neurais (completo referido como NSC) expansão do rato embrionário do hipocampo ou córtex adulto através da manipulação da expressão do complexo de cdk4/cyclinD1, um regulador importante da fase G1 do ciclo celular e da haste de células somáticas differentiation 3,4. Especificamente, duas abordagens diferentes são descritas pela qual o complexo é sobre-expressa em cdk4/cyclinD1 NSC in vivo. Por a primeira abordagem, a sobreexpressão dos reguladores do ciclo celular é obtido por injecção de plasmídeos que codificam para cdk4/cyclinD1 no lúmen do telencéfalo de rato seguido de in utero eletroporação para os fornecer aos NSC do córtex lateral, portanto, provocando a expressão episómico da transgenes 5-8. Pelo segundo método, altamente concentradas HIV derivadas de vírus são injectados estereotaxicamente no giro dentado do hipocampo de rato adulto, portanto, provocando a expressão constitutiva dos reguladores do ciclo celular após a integração da construção no genoma viral de células infectadas 9. Ambas as abordagens, cujos princípios básicos foram já descritas por outros protocolos de vídeo 10-14, foram aqui otimizado para i) reduzir danos nos tecidos, ii) porções alvo de largura de muito específico cérebro regions, iii) obter um número elevado de células manipuladas em cada região, e iv) accionar elevados níveis de expressão dos transgenes dentro de cada célula. Sobre-expressão transiente dos transgenes utilizando as duas abordagens é obtida por diferentes meios ou seja, pela diluição natural dos plasmídeos electroporadas devido a divisão celular ou a administração de tamoxifeno na Cre-expressando NSC infectado com vírus transportando cdk4/cyclinD1 flanqueadas por locais loxP, respectivamente 9,15 . Estes métodos proporcionam uma plataforma muito poderosa para agudamente e dos tecidos especificamente manipular a expressão de qualquer gene no cérebro do rato. Em particular, através da manipulação da expressão do complexo de cdk4/cyclinD1, o nosso sistema permite que o controlo temporal da expansão NSC e sua chave de diferenciação, assim, em última análise, o aumento do número de neurónios gerados no cérebro de mamíferos. Nossa abordagem pode ser muito importante para a pesquisa básica e uso de células-tronco somáticas para a terapiado sistema nervoso central de mamíferos, proporcionando uma melhor compreensão da i) conter contribuição para a formação de tecido de células durante o desenvolvimento, ii) a homeostase dos tecidos durante a fase adulta, iii) o papel da neurogénese adulta em funções cognitivas, e, talvez, iv) uma melhor utilização somática haste células em modelos de doenças neurodegenerativas.

<ol><li> No geral, em electroporação utero produz 60-80% de embriões electroporadas exibem forte expressão do gene repórter em uma ampla área do córtex lateral (Figura 3A). As proteínas fluorescentes pode ser facilmente detectado em embriões inteiros de montagem assim que 3-6 horas após a cirurgia, com o sinal de duração de mais de uma semana. Dentro da área de alvo, cerca de 30-50% de células normalmente expressam o transgene (s) com a proporção de células co-expressão de duas (ou mais) co-electroporadas transgenes sendo geralmente superior a 90% (Figura 3B, para a esquerda) 6,8 de 15. Embora um nível mínimo de apoptose (ca. 2,0-2,5%) pôde ser observada após cerca de 2 horas a partir de electroporação, este valor irá retornar para níveis fisiológicos (0,5-1,0% ca.) após cerca de 6 horas (FC, dados não publicados). A proporção de embriões ou camundongos prenhes morrer devido a cirurgia é geralmente insignificante (&lt;5%). Co-electroporação com cdk4/cyclinD1 sob estas condições, seguido por 48 horas de desenvolvimento desencadeia um aumento na expansão de células progenitoras neurais em 30% (Figura 3B, para a direita, e C) 15. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Expansão de células progenitoras neurais por cdk4/cyclinD1 superexpressão. (A) imagem de fluorescência de uma secção através da cortical lateral de um embrião de rato 24 horas após a electroporação com GFP e RFP plasmídeos no dia embrionário 13. (B) as imagens fluorescentes como em A 48 horas após a co-electroporação com cdk4/GFP e cyclinD1/RFP plasmídeos e imunomarcação para o marcador de células progenitoras Tbr2 basal. Repórteres fluorescentes com DAPI counterstainig (esquerda) e Tbr2 (direita) são mostrados. Linhas indica a superfície apical da zona ventricular (VZ; linha branca) e os limites da zona subventricular (SVZ; amarelos linhas tracejadas). Observe o aumento thickness da SVZ na porção electroporated do córtex (pontas de seta brancas), devido a um aumento da geração e da expansão de células progenitoras basais após sobre-expressão de cdk4/cyclinD1. (C) A quantificação do efeito mostrado na B. Barras = SD, p &lt;0,05, n = 3. Gráfico de barras em C é retirado de Lange et al., 2009 15. <ol start="2"><li> Após a injeção estereotáxica viral, ca. 80% dos ratos operados exibir forte expressão dos transgenes em todo o giro denteado todo. A expressão constitutiva de GFP pode ser facilmente detectado em 40 secções uM logo que 4 dias após a cirurgia. Ao longo do eixo rostral-caudal para o giro denteado, cerca de 10-30% de células (equivalente a um total de cerca de 10,000-30,000. Células) normalmente expressam o transgene (s) (Figura 4A) 9. A proporção de ratos que morrem devido a cirurgia é insignificante (&lt;5%). Três semanas a superexpressão de cdk4/cyclinD1 sob estas condições provoca um aumento no NSC por mais de doisdobras (Figura 4B), enquanto que diminuindo a neurogénese em 70% (Figura 4C) 9. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Efeitos da infecção viral. (A) reconstrução 3D de 7 imagens de fluorescência tomadas a partir de 40 um de espessura de série secções coronais (1 a cada recolha de 6) ao longo do eixo rostral-caudal para o hipocampo. GFP + células infectadas (verde) e DAPI coloração nuclear (azul) do giro denteado são mostrados (superior). Brilhantes imagens de campo dos cortes coronais correspondentes aos mostrados em A (meio) e representação em 3D (fundo) de todo o hemisfério cerebral com o hipocampo em destaque na verde pseudo (modificado a partir do Cérebro Allen Atlas; <a href="http://www.brain-map.org" target="_blank">www.brain-map.org</a> ) . Setas brancas apontar o local da injecção. Lateral (L), rostral (R), e dorSal (D) eixos (x, y, e z coordenadas estereotáxicas) são indicados (direita). (B e C) Proporção de nestina + NSC (B) e DCX + neurônios (C) dentro da população de células infectadas GFP + 3 semanas após a injeção estereotáxica de GFP (branco) ou cdk4/cyclinD1/GFP (preto) vírus. Bares = SD, p &lt;0,005, n = 3. Gráficos em B e C constante do Artegiani et al., 2011.

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Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlar a expansão de células estaminais somáticas é um factor principal dificultando o seu estudo e a utilização em terapia. Aqui, descrevemos um sistema para controlar temporalmente neural haste de expansão de células durante o desenvolvimento e na vida adulta, o que pode ser usado para aumentar o número de neurónios gerados no cérebro do rato.

Expansão da embrionárias e adultas células-tronco neurais por<em&gt; In Utero</em&gt; Eletroporação ou injeção estereotáxica Viral

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

expansion-embryonic-adult-neural-stem-cells-utero-electroporation-or

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

16.7K visualizações.  DFG - Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies Dresden, Germany. Controlar a expansão de células estaminais somáticas é um factor principal dificultando o seu estudo e a utilização em terapia. Aqui, descrevemos um sistema para controlar temporalmente neural haste de expansão de células durante o desenvolvimento e na vida adulta, o que pode ser usado para aumentar o número de neurónios gerados no cérebro do rato.

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Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Isolamento e Expansão do Rato Adulto células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Neurociência

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

Geração de topicamente transgênicas Rats por<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação e<em&gt; In vivo</em&gt; Triagem Bioluminescência

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

Injeção estereotáxica de um vetor viral para manipulação genética condicional no Cabo de Rato Spinal

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

Um Método de Expansão cGMP-aplicável para Agregados de Neural Humano-tronco e células progenitoras derivadas de células-tronco pluripotentes ou tecido cerebral do feto

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Isolamento e Cultura de células estaminais adultas neurais do Subcallosal Zona Rato

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

Isolamento e cultura de células-tronco neurais embrionárias de rato

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative cell replacement therapies while also creating tools to study cell fate in situ. To date, it has been possible to obtain neurons via in vivo reprogramming, but the precise phenotype of these neurons or how they mature has not been analyzed in detail. In this protocol, we describe a more efficient conversion and cell-specific identification of the in vivo reprogrammed neurons, using an AAV-based viral vector system. We also provide a protocol for functional assessment of the reprogrammed cells&#8217; neuronal maturation. By injecting flip-excision (FLEX) vectors, containing the reprogramming and synapsin-driven reporter genes&#160;to specific cell types in the brain that serve as the target for cell reprogramming. This technique allows for the easy identification of newly reprogrammed neurons. Results show that the obtained reprogrammed neurons functionally mature over time, receive synaptic contacts and show electrophysiological properties of different types of interneurons. Using the transcription factors Ascl1, Lmx1a and Nurr1, the majority of the reprogrammed cells have properties of fast-spiking, parvalbumin-containing interneurons.

This protocol aims at generating directly reprogrammed interneurons in vivo, using an AAV-based viral system in the brain and a FLEX synapsin-driven GFP reporter, which allows for cell identification and further analysis in vivo.

In vivo reprogramação direta de células gliais residentes em interneurônios por injeção intracerebral de vetores virais

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian development. In utero electroporation is a key technique for the manipulation of gene expression in the embryonic mammalian brain in vivo. A protocol for in utero electroporation of the embryonic neocortex of ferrets, a small carnivore, is presented here. The ferret is increasingly being used as a model for neocortex development, because its neocortex exhibits a series of anatomical, histological, cellular, and molecular features that are also present in human and nonhuman primates, but absent in rodent models, such as mouse or rat. In utero electroporation was performed at embryonic day (E) 33, a midneurogenesis stage in ferret. In utero electroporation targets neural progenitor cells lining the lateral ventricles of the brain. During neurogenesis, these progenitor cells give rise to all other neural cell types. This work shows representative results and analyses at E37, postnatal day (P) 1, and P16, corresponding to 4, 9, and 24 days after in utero electroporation, respectively. At earlier stages, the progeny of targeted cells consists mainly of various neural progenitor subtypes, whereas at later stages most labeled cells are postmitotic neurons. Thus, in utero electroporation enables the study of the effect of genetic manipulation on the cellular and molecular features of various types of neural cells. Through its effect on various cell populations, in utero electroporation can also be used for the manipulation of histological and anatomical features of the ferret neocortex. Importantly, all these effects are acute and are performed with a spatiotemporal specificity determined by the user.

Presented here is a protocol to perform genetic manipulation in the embryonic ferret brain using in utero electroporation. This method allows for targeting of neural progenitor cells in the neocortex in vivo.

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...

Expansão da embrionárias e adultas células-tronco neurais por

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