O NETUNO permite a segmentação e a manipulação genética do sistema nervoso embrionário do camundongo a partir do dia 7.5 e permite a geração de modelos de knockdown ou rastreamento de linhagem em dias. Este protocolo é adaptável, flexível e rápido. Podemos fornecer bibliotecas virais shRNA, cdRNA ou códigos de barras para abordar diferentes questões em dias e não meses ou anos.
Esperamos que o NETUNO forneça insights sobre neurociência, mas também possa ser adaptado a outros sistemas de órgãos. Identificar a cavidade amniótica pode ser bastante desafiador, então aproveite para olhar a imagem do ultrassom e talvez tenha um livro didático ou outro recurso de anatomia em mãos. Para começar a carregar a agulha, deslize a agulha de vidro sobre o êmbolo de metal, mantendo o collett preso, mas ligeiramente solto.
Em seguida, empurre a agulha capilar junto com o êmbolo metálico através da junta dianteira até atingir o espaçador. Pressione esvaziar para empurrar o êmbolo na agulha e expulsar o óleo da ponta da agulha. Em seguida, pressione Encha para criar uma bolha de ar, dividindo o óleo e a solução.
Por fim, abaixe a agulha, mergulhe a ponta na solução e pressione Encha novamente para carregar a agulha. Depois de fixar um camundongo fêmea anestesiado com cavidades amnióticas de tamanho ideal na mesa de aquecimento, aplique gel ocular em ambos os olhos para evitar a profanação da córnea e injete um analgésico subcutânea. Em seguida, esterilize o abdômen inferior limpando com um pano encharcado com 0,5 miligramas por solução de clorexidina mililitro e seque a pele.
Em seguida, usando uma tesoura cirúrgica, faça uma incisão vertical de pele média de 1,5 a 2 centímetros no abdômen inferior. Em seguida, levante a pele suavemente e liberte-a da camada muscular subjacente aproximadamente um centímetro ao redor do ponto de incisão para facilitar a sutura após a cirurgia. Em seguida, faça uma incisão vertical de um centímetro na camada muscular.
Usando um par de fórceps, levante um lado da pele e camada muscular, e com outro par, procure os chifres uterinos. Em seguida, usando fórceps, segure o tecido entre os embriões e puxe cuidadosamente os dois chifres uterinos do abdômen. Conte e numerar os embriões, seja do ovário ao colo do útero ou do colo uterino para o ovário, em ambos os lados.
Em seguida, com um cotonete úmido, empurre suavemente todos os embriões de volta para a cavidade abdominal, exceto os três primeiros a serem injetados. Em seguida, coloque uma gota de PBS sobre uma membrana elástica colada à abertura central redonda de uma placa de Petri modificada comercialmente disponível e segure-a imediatamente acima dos embriões. Insira fórceps fechados na incisão do elástico e solte os fórceps para abrir a incisão elástica, deixando cair o líquido nos embriões.
Usando fórceps, puxe a seção do útero correspondente aos três embriões através do elástico e gentilmente empoleirar a placa de Petri no abdômen do rato. Usando quatro pés de argila, fixe e fixe a placa de Petri acima do abdômen para reduzir a pressão sobre o mouse, e também reduzir a sensibilidade da imagem à respiração e batimentos cardíacos do rato. Em seguida, usando fórceps e um cotonete úmido, ajuste o útero e o elástico para garantir que o elástico seja selado ao redor da pele do rato, evitando o vazamento de PBS.
Em seguida, para fixar o útero, pressione o cilindro de argila modelando para baixo à direita dos embriões ou útero e adicione PBS à placa de Petri até que os embriões e útero estejam inteiramente cobertos com o PBS. Para facilitar o registro das injeções, mergulhe a sonda de ultrassom no PBS e ajuste o mouse ou a mesa cirúrgica para que o primeiro embrião esteja alinhado com a sonda de ultrassom. Escaneie os três embriões e inspecione as cavidades amnióticas.
Em seguida, utilizando a máquina de ultrassom, meça o diâmetro da cavidade amniótica para determinar o volume de injeção adequado. Usando o controlador de injeção, defina os volumes de injeção determinados e a velocidade de injeção para diminuir, com uma taxa de injeção de 23 nanoliters por segundo. Depois de baixar a agulha para dentro do PBS, usando as rodas principais do sistema ferroviário, pressione Esvaziar no controlador de nanoinjetor até que o líquido atinja a ponta da agulha.
Em seguida, levante a agulha para fora do PBS e pressione Injete para verificar se uma gota de volume aproximado desejado é descarregada. Abaixe a agulha para dentro do PBS novamente e mova o nanoinjetor com a roda do plano Y no micromanipulador para alinhar a agulha com a sonda de ultrassom e o embrião. Ajuste o ângulo da agulha com a roda de ângulo de injeção para garantir um ângulo de injeção quase perpendicular em relação à parede uterina.
Em seguida, usando a roda de injeção no micromanipulador, insira a agulha na cavidade amniótica em um movimento. Se a ponta da agulha desaparecer da imagem do ultrassom, mova a sonda para frente ou para trás para trazer a agulha de volta ao foco. Em seguida, injete o volume desejado pressionando Inject para o número apropriado de vezes.
Após o volume necessário ter sido injetado, espere de 5 a 10 segundos antes de retirar a agulha em um movimento suave. Mova o palco para o próximo embrião e repita a injeção para os outros dois embriões como demonstrado. Em seguida, levante a sonda de ultrassom e a agulha do PBS usando o micromanipulador, afastando a agulha do operador para evitar danos e ferimentos.
Usando fórceps, coloque o primeiro e o segundo embriões de volta ao abdômen empurrando-os suavemente através do elástico. Em seguida, segure suavemente o tecido adjacente ao terceiro embrião e puxe o útero para a extremidade superior da incisão elástica. Puxe suavemente o quarto para o sexto embriões com fórceps e permita que o terceiro embrião reentre no abdômen.
Depois de todos os embriões com cavidades amnióticas ideais terem sido injetados, empurre suavemente os embriões e o útero de volta para o abdômen do camundongo. A transdução bem sucedida da placa neural resulta em embriões com forte expressão de um repórter fluorescente no cérebro e outros tecidos derivados do ectoderme, como a pele. Injetar volumes excessivamente altos pode resultar em defeitos no tubo neural, como exencefalia.
As injeções bem sucedidas no dia embrionário 7.5 resultam em transdução uniforme do cérebro para o cérebro traseiro, incluindo o plexo coroide. Injeções de baixa tíclica resultam na transdução de clones unicelulares, enquanto o vírus de alta tíces transduze quase 100% de todo o cérebro. As seções coronais durante o dia embrionário 13,5 embriões mostraram transdução alta e uniforme do tecido neural do olho, lente, córnea e mesenquime.
Após a injeção no dia embrionário 9.5, glândulas salivares e dutos se desenvolvem em torno do dia embrionário 11,5 do epitélio oral. O epitélio lingual da língua é bem transduzido, enquanto o mesenquime subjacente é negativo. Além disso, os clusters positivos dentro do epitélio lingual são separados por seções negativas, sugerindo a transdução da superfície papilar.
As injeções no dia 7.5 embrionário resultam em transdução generalizada da língua mesenquime no dia embrionário 13.5, sugerindo que as injeções precoces visam células de crista neural, contribuindo para o mesenquime na língua. As injeções lentivirais também levam a um direcionamento generalizado do sistema nervoso central e periférico, transduzindo neurônios e progenitores na medula espinhal, bem como o gânglio raiz dorsal. Uma boa preparação é essencial.
Certifique-se de que não há vazamento e que os embriões estão bem fixos, para que você possa se concentrar inteiramente nas injeções na cavidade do rato. Após o NETUNO, a análise pode ser feita por vários métodos, como análise imunofluorescente do cérebro, sequenciamento de RNA unicelular, ou permitir que os embriões injetados nasçam para análise comportamental.
