נתמך על ידי מענקים מכוני הקנדי לחקר בריאות, לוקמיה לימפומה וחברה של קנדה וקרן לימפומה של קנדה.

הכן ריאגנטים הערה: כל PBS מכיל Ca 2 + ו - Mg 2 + <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איתור מגיב הוסף 20μM 7-amino-4-chloromethyl coumarin, t-BOC, לאוצין, מתיונין אמיד (BOC-LM-CMAC) לטמפרטורת החדר PBS. כל השעיה תא ידרוש מגיב איתור 2ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Paraformaldehyde 1% (תאים קבוע) מדולל של 4% מניות paraformaldehyde פתרון בטמפרטורת החדר PBS. Aliquot paraformaldehyde 1mL 1% ל צינור אחד FACS. שלושה צינורות FACS נדרשים עבור כל תנאי הניסוי (דוגמה 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 צורך 9 צינורות FACS) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PD150606 (מעכב calpain) מחדש PD150606 ב DMSO לריכוז סופי של 100 מ&quot;מ. הגן הזה מגיב וכל תאים שטופלו בו מן האור למשך הניסוי הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PD98059 (MEK1 מעכב) מחדש PD98059 ב DMSO לריכוז סופי של 50mm. </li></ol> הכן תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים 32Dkit ב 5 x אוקטובר 05-01 x 10 6 תאים לכל מ&quot;ל Opti-ממ התקשורת בתוספת 5% בסרום שור עוברית, WEHI-3 supernatant כמקור של IL-3 (או כל מקור אחר של IL-3 כאלה כמו חלבון רקומביננטי), 0.1% 2-mercaptoethanol ואנטיביוטיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף 12 x 10 6 תאים 32Dkit לשלושה צינורות פלקון 15 מ&quot;ל (4 x 10 6 תאים לכל צינור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים ב 1000 סל&quot;ד למשך 5 דקות בשעה 15 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant. Resuspend התאים 2ml בטמפרטורת החדר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התייחס one ההשעיה תא עם 50μM PD150606. ודא המדגם מוגן מפני אור על ידי כיסוי הצינור פלקון עם רדיד אלומיניום. וורטקס דגירה קצר לאחר מכן עבור 20-30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו את ההשעיה התא השני עם 20μM PD98059. פלייט התאים צלחת תרבות 35mm רקמות דגירה עבור 2 שעות 37 ° C. </li></ol> Calpain Assay בתוך תאים קבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד דגימות הם דוגרים עם PD150606, להתחיל את assay calpain על דגימות מטופל. בגין על ידי הוספת מגיב איתור 2ml להשעיית כל תא. מיד להוסיף 1mL של ההשעיה תא / מגיב תערובת זיהוי צינורות FACS הכין בעבר עם paraformaldehyde 1% (0 דקות נקודת זמן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השעיות תא מגיב עם זיהוי במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. ואז להוסיף 1mL ההשעיה לתא צינור FACS עם paraformaldehyde 1mL 1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך דוגרים השעיות תא בתערובת גילוי 5 דקות נוספות בטמפרטורת החדר. ואז להוסיף 1mL ההשעיה לתא צינור FACS עם paraformaldehyde 1mL 1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור assay calpain על תאים 32Dkit כי טופלו במעכבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים לילה בחושך ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום גלולה הבא התאים ב 1800 סל&quot;ד למשך 5 דקות בשעה 15 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant. Resuspend התאים 750uL PBS. המקום התאים על קרח ולשמור בחושך. </li></ol> רוכשת את הנתונים עבור תאים קבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את התאים באמצעות II LSR (BD Bioscience). מסננים מוגדרים עבור Xcyte Lightwave (UV) לייזר, קו עירור 355nm לייזר 25mW כוח, פליטה של ​​405 ו - 450 ננומטר במשך המצע ואת המוצר בהתאמה. לעבור בנד מסננים עבור המצע ואת המוצר הם 405/20 ו - 450/50. מסננים לעבור לונג על המצע ואת המוצר הם 405 ו 450. מתח PMT נקבע על 350-375 ו 325-350 על מצע עבור המוצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת ניסוי BD FACSDiva עם הפרמטרים הבאים: פיזור קדימה, פיזור צד; ההודו-1 כחול (יומן); ההודו-1 ויולט (יומן). בגליון העבודה להגדיר את הגרפים הבאים: פיזור קדימה לעומת פיזור נקודה בצד המגרש עם שער על תאים חיים (איור 1 א), הודו-1 היסטוגרמה כחול, הודו-1 היסטוגרמה ויולט, הודו-1 כחול מול הודו-1 ויולט העלילה נקודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל את השנייה עם LSR AlignFlow ו AlignFlow בתוספת חרוזי ניאון (Invitrogen). מתח PMT צריך להיות מותאם למקום השיא של ההיסטוגרמה הקרינה חרוז באותו ערוץ לפני כל ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין רכישת נתונים באמצעות תאים 32Dkit בנקודת זמן 0 דקות. התאם את מתח הפרמטר לפי הצורך. רוכשת ולהקליט 10,000 אירועים לדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הרכישה עבור כל דגימה, שטיפה במכונה עם FACS חיץ בין צינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצוא הנתונים. ודא LSR II הוא ניקה על פי הנחיות המכון. </li></ol> Calpain Assay בתאים חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המתלים תא כאמור לעיל, ללא PD150606. תביאו את דגימות את השנייה LSR ולהקים מסננים הפרמטרים לעיל. הגדר את גליון לעיל. כלול מזימה נקודה גדולה מראה ההודו-1 כחול נגד הזמן. הגדר את תוכנית לרכוש את num מקסימליתבער של אירועים (אין שער להפסיק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50μM PD150606 אחד ההשעיה התא של תאים 32Dkit. שמור על מדגם בחושך דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20-30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין רכישת מידע על ההשעיה תא 32Dkit ללא PD150606. השתמש ספיקה נמוכה של 200-300 אירועים בשנייה. לאחר 30 שניות עד דקה 1 להסיר את הצינור מהמכונה. הוסף 20μM BOC-LM-CMAC אל התאים. וורטקס בקצרה ולאחר מכן להמשיך לרכוש את הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת את הנתונים עבור 10-20 דקות או עד מישורים את הפעילות calpain. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3 ו - 4 עם תאים 32Dkit שטופלו PD150606. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצוא הנתונים. ודא LSR II הוא ניקה על פי הנחיות המכון. </li></ol> Calpain Assay ב (מעורב) אוכלוסיות מורכבות Cell * ניסוי זה יהיה לזהות תאים 32Dkit ההשעיה תא שנקטפו מן הטחול עכבר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר את הטחול מהעכבר כל אחד. Lyse תא דם אדום עם NH 4 Cl במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיות תא יחיד 2ml PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים כל השעיה התא לשניים. פנקו 1 ההשעיה תא עם 50μM PD150606 עבור 20-30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לעיל עבור Assay Calpain בתוך תאים קבוע (שלבים 1-6) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant. לשטוף את התאים 500μL PBS. לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים חיץ מכתים 200μL עם BSA 2%. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הנוגדן הראשוני (FITC אנטי עכבר CD117). הנוגדן אמור לשמש בדילול 1:200 ב מכתים חיץ. ודא את הנוגדן נשמרת בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נוגדן ראשוני 200μL אל התאים. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 400μL PBS להגדיל את היקף עבור cytometry הזרימה. מניחים את התאים על הקרח ולשמור בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך כמתואר רוכשת את הנתונים עבור תאים קבוע. הוסף FITC את הפרמטרים כוללים היסטוגרמה עבור FITC בגליון העבודה. </li></ol> ניתוח תוצאות נציג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח נתונים באמצעות FlowJo (Treestar). שער על תאים חיים המבוסס על פרופיל פיזור קדימה בצד (איור 1 א). קבע את הקרינה מתכוון הודו כחול מהשער תא קיימא (איור 1b). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> א) אוכלוסיית תאים משולבים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש FITC הקרינה על מגרשים histograms ו נקודה כדי לזהות את האוכלוסייה 32Dkit </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הקרינה מתכוון הודו כחול של האוכלוסייה 32Dkit </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ב-Microsoft Excel כדי הגרף הקרינה אומר (איור 2 א). חשב את השיפוע של הקו בין 5 ל 10 דקות. שיפוע גרף בצורת תרשים עמודות כדי לקבוע פעילות calpain בתאים (איור 2b). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1a.jpg" alt="איור 1a" /> איור 1a. קביעת תאים חיים המבוסס על פרופיל פיזור קדימה בצד. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1b.jpg" alt="איור 1b" /> איור 1b. שינוי ממוצע הקרינה לאורך זמן 10 דקות. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2a.jpg" alt="איור 2a" /> איור 2 א. נציג גרף של הקרינה מתכוון. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2b.jpg" alt="איור 2b" /> איור 2b. Calpain פעילות בתאים 32Dkit עם מעכבי.

<ol>
	<li>Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).</li><li>Niapour, M., Berger, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometric+Measurement+of+Calpain+Activity+in+Living+Cells.">Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells.</a> Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).</li><li>Leloup, L., Daury, L., Maz&#233;res, G., Cottin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+ERK/MAP+kinase+signalling+pathway+in+milli-calpain+activation+and+myogenic+cell+migration.">Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration.</a> The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הפעילות calpain בתאים 32Dkit קבוע וחיים נקבע בפרוטוקול הווידאו הזאת. טיפול קו התא עם מעכב calpain PD150606 הביא עיכוב מלא של פעילות calpain בתאים. בנוסף, טיפול מעכב MEK1 PD98059 הביא עיכוב מלא של פעילות calpain בתאים. ERK הוא activator העיקריים של calpain-2 3. התוצאות מראות כי calpain-2 הפעילות העיקרי בתא...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>PD150606</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition.</td>
</tr>
<tr>
<td>PD98059</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cell Signaling Technology</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LSR II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth. </td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

measuring calpain activity in fixed and living cells by flow cytometry

Calpains נמצאים בכל מקום תאיים, סידן רגיש, פרוטאזות ציסטאין נייטרלי<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpains ממלאים תפקידים מכריעים תהליכים פיזיולוגיים רבים, כולל איתות, שיפוץ cytoskeletal, רגולציה של אפופטוזיס ביטוי גנים התקדמות מחזור התא<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpains היו מעורבים רבים, כולל מחלות dystrophies שרירים, סרטן, סוכרת, אלצהיימר וטרשת נפוצה<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpain תקנה מורכב מובנת. רמות ה-mRNA וחלבון לתאם היטב עם פעילות, הגבלת שימוש בטכניקות של גן או חלבון הביטוי כדי למדוד את פעילות calpain. פרוטוקול זה מפרט וידאו assay תזרים cytometric שפותחו במעבדה שלנו למדידת פעילות calpain בתאים חיים קבוע. שיטה זו משתמשת המצע פלורסנט BOC-LM-CMAC, אשר ביקע במיוחד על ידי calpain, כדי למדוד את פעילות calpain.<sup&gt; 2</sup&gt; בסרטון הזה, פעילות calpain ב קבוע וחיים Murine לוקמיה תאים 32Dkit, לבד או כחלק אוכלוסייה splenocyte נמדדת באמצעות LSRII (BD Bioscience). תאים 32Dkit הם הראו פעילות גבוהות לעומת splenocytes נורמלי.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

מאמר זה יפרט את הפרוטוקול למדידת פעילות calpain בתאים קבועים חי באמצעות cytometry הזרימה.

מדידת פעילות Calpain בתוך תאים חיים קבוע על ידי זרימת cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

measuring-calpain-activity-in-fixed-and-living-cells-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.7K Views.  University of Toronto. מאמר זה יפרט את הפרוטוקול למדידת פעילות calpain בתאים קבועים חי באמצעות cytometry הזרימה.

Video: Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

מדידה מצורף והפנמה של שפעת וירוס בתאי A549 על ידי cytometry הזרימה

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

מדידת פאיגוציטוזה של אספרגייוס מחטאים מחט על ידי האדם לוקיולוציטים באמצעות זרם ציטוטוטרי

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Measuring Erythrocyte Complement Receptor 1 Using Flow Cytometry

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, transports immune complexes, and participates in humoral and cellular immune responses. CR1 is present on the surface of many cell types, including erythrocytes, and exhibits polymorphisms in length, structure (Knops, or KN, blood group), and density. The average density of CR1 per erythrocyte (CR1/E) is 500 molecules per erythrocyte. This density varies from one individual to another (100&#8211;1,200 CR1/E) and from one erythrocyte to another in the same individual. We present here a robust flow cytometry method to measure the density of CR1/E, including in subjects expressing a low density, with the help of an amplifying immunostaining system. This method has enabled us to show the lowering of CR1 erythrocyte expression in diseases such as Alzheimer&#39;s disease (AD), systemic lupus erythematosus (SLE), AIDS, or malaria.

The aim of this method is to determine the CR1 density in the erythrocytes of any subject by comparing with three subjects whose erythrocyte CR1 density is known. The method uses flow cytometry after immunostaining of the subjects&#39; erythrocytes by an anti-CR1 monoclonal antibody coupled to an amplified system using phycoerythrin (PE).

מדידת קולטן אריתרופוציט 1 באמצעות שימוש בשיטת זרימה

CR1 (CD35, Complement Receptor type 1 for C3b/C4b) is a high molecular weight membrane glycoprotein of about 200 kDa that controls complement activation, ...

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by naturally acquired IgG antibodies specific for VAR2CSA. VAR2CSA is the parasite antigen that mediates the selective sequestration of IEs in the placenta that can cause a severe form of malaria in pregnant women, called placental malaria (PM). Protection from PM is mediated by VAR2CSA-specific antibodies that are believed to function by inhibiting placental sequestration and/or by opsonizing IEs for phagocytosis. The assay employs late-stage-synchronized IEs that have been selected in vitro to express VAR2CSA, plasma/serum-antibodies from women with naturally acquired PM-specific immunity, and the phagocytic cell line THP-1. However, the protocol can easily be modified to assay the functionality of antibodies to any parasite antigen present on the IE surface, whether induced by natural exposure or by vaccination. The assay offers simple and high-throughput evaluation, with good reproducibility, of an important functional aspect of antibody-mediated immunity in malaria. It is, therefore, useful when evaluating clinical immunity to P. falciparum malaria, a major cause of morbidity and mortality in the tropics, particularly in sub-Saharan Africa.

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The overall goal of this protocol is to provide instruction on how to measure the capacity of antibodies present in sera or plasma of individuals, naturally exposed to Plasmodium falciparum infection, to opsonize and induce phagocytosis of the parasite-infected erythrocytes (IEs).

מדידת נוגדנים הרום Phagocytosis-באופן טבעי כדי Plasmodium falciparum טפילי על ידי אסאי מבוסס ציטומטריה זרימה

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are widely used as a convenient cell system for analyzing SAMHD1 activity due to a low level of SAMHD1 RNA expression, leading to undetectable endogenous protein expression. Based on similar assays developed in the Stoye laboratory to characterize other retroviral restriction factors, the Bishop lab developed a two-color restriction assay to analyze SAMHD1 in U937 cells. Murine Leukaemia Virus-like particles expressing SAMHD1, alongside YFP expressed from an IRES, are used to transduce U937 cells. Cells are then treated with phorbol myristate acetate to induce differentiation to a quiescent phenotype. Following differentiation, cells are infected with HIV-1 virus-like particles expressing a fluorescent reporter. After 48 h, cells are harvested and analyzed by flow cytometry. The proportion of HIV-infected cells in the SAMHD1-expressing population is compared to that in internal control cells lacking SAMHD1. This comparison reveals a restriction ratio. SAMHD1 expression leads to a five-fold reduction in HIV infection, corresponding to a restriction ratio of 0.2. Our recent substitution of RFP for the original GFP as the reporter gene for HIV infection has facilitated flow cytometry analysis.
This assay has been successfully used to characterize the effect of amino acid substitutions on SAMHD1 restriction by transducing with viruses encoding altered SAMHD1 proteins, derived from site-directed mutagenesis of the expression vector. For example, the catalytic site substitutions HD206-7AA show a restriction phenotype of 1, indicating a loss of restriction activity. Equally, the susceptibility of different tester viruses can be determined. The assay can be further adapted to incorporate the effect of differentiation status, metabolic status, and SAMHD1 modifiers to better understand the relationship between SAMHD1, cell metabolic state, and viral restriction.

Described here is an established method to determine the extent of HIV-1 restriction by the cellular inhibitory protein SAMHD1. Human myeloid lineage U937 cells are transduced with a SAMHD1 expression vector co-expressing YFP, differentiated and then challenged with HIV-RFP. The level of restriction is determined by flow cytometry analysis.

ניתוח של הגבלת SAMHD1 על ידי ציטומטריה של זרימה בתאי מיאלואיד U937 אנושיים

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...