Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health EUA (NIH) e concede R01DK069403 P30DK079307.

Parte do protocolo que se segue é baseado em métodos publicados relatado por (Hentschel et al. 2005) e (Weinstein et al. 1995) com ligeiras modificações. Parte 1: Microinjeções Configurar com antecedência para microinjeção <ul><li> Os peixes são injetadas em dois dias pós-fertilização (DPF). Portanto, peixe-zebra adulto são criados três noites antes de um experimento planejado. Coletar embriões e colocá-los em uma placa de Petri com água E3 (NaCl 5mM, 0.17mm KCL, CaCl 2 0,33 mm, 0,33 mm MgSO 4) a 28,5 ° C. No final do primeiro dia remover embriões mortos da placa de Petri e embriões separados para que não haja 8-10 embriões por placa de Petri. </li><li> Prepare as agulhas de vidro puxando a partir de tubos capilares (4 centímetros de comprimento, 0,63 / 0,20 OD / ID milímetros (mm) R-6 Personalizado de vidro Tubulação Drummond sociedade científica, Broomall, PA 9-000-3000) com um puxador de eletrodo. O diâmetro da ponta deve ser de 10-20 mM. Sob um microscópio de dissecação (Leica S6E), com um marcador permanente desenhar cerca de 10 linhas de um milímetro ao longo da agulha, com a ajuda de uma régua, e armazenar as agulhas em um prato de Petri grande em rampas de barro. </li><li> Prepare a pipeta holding: Fire-polonês a ponta de um tubo de vidro de paredes finas borosilicato capilar (152 mm, 1 / 0,75 OD / mm ID TW100-6, Instrumentos de Precisão World, Inc.) com uma chama bico de Bunsen até que o diâmetro interno de a dica é 0,4-0,5 mm. Essa dimensão permite boa aderência do saco vitelino de larvas de peixe-zebra 2 dpf. Segure uma extremidade de um pedaço de vidro capilar usando uma pinça longa, eo calor da ponta oposta com do capilar com o bico de Bunsen, colocando-o verticalmente sobre o cone azul luz interior da chama, a parte mais quente, por 1-2 segundos, implantá-la para obter um mesmo derreter. Repita isso algumas vezes, em seguida, examinar o capilar sob o microscópio, em um micrômetro de estágio (94 de Ward W 9910). Esta é uma etapa crítica, pode ser necessária para disparar um polonês-pipetas segurando poucos e selecione o tamanho apropriado mais tarde, enquanto você está manipulando as larvas. Se você é cuidadoso, segurando uma pipeta tem a duração de sessões de microinjeção múltiplas. </li><li> Encha a bomba Microsseringa Manual (MMP, Precision Mundial Instruments, Inc.), com óleo mineral, seguindo as instruções dadas pelo fabricante. O titular da pipeta é inserido em um manipulador joystick (Narishige, MN-151), ligado com um suporte magnético (Narishige, MN 151) a uma chapa de ferro (Narishige, IP). </li></ul> Microinjeção <ul><li> Prepare 20μl da mistura de injecção:. 2.4μl gentamicina (Sigma-Aldrich G8648, 50mg/ml em solução salina) e 10 kDa 17.6μl-lucifer amarelo dextran (Invitrogen D1825, (1mg/ml em solução salina) No peixes controlar o gentamicina é substituído por solução salina. O dextran fluorescente (muitas cores diferentes podem ser usados) é suficiente para verificar a precisão da injeção e selecione larvas que foram injetados com a nephrotoxicant. </li><li> Prepare duas placas de Petri 30 milímetros com óleo mineral 2ml para colocar a mistura de injeção e mistura sob controle, para evitar a evaporação das soluções. </li><li> Prepare o anestésico: 400 mg tricaina pó (etil-m-aminobenzoato metanossulfonato SIGMA A-5040) 97,7 ml de água DD, 2,1 ml 1M Tris (pH 9). Ajustar a pH 7. Conservar a solução estoque no freezer, em alíquotas de 4,2 ml. Para usar tricaina como um anestésico diluir a 4,2 ml solução estoque tricaina em 100 ml de água E3 (Westerfield 1993) e deixar à temperatura ambiente. </li></ul> As seguintes etapas são realizadas sob um microscópio de dissecação <ul><li> Remover manualmente qualquer córions restantes com uma pinça fina e anestesiar o peixe-zebra transferindo-os em um prato de Petri com tricaina aquecido em temperatura ambiente. Peixe-zebra deve ser exposto a tricaina pelo menos 15 minutos antes de iniciar o microinjeções. </li><li> Abra a ponta da agulha de injeção usando uma lâmina de barbear (VWR científica 55411-050). Segure a lâmina com uma ligeira inclinação para criar um chanfro e cortar a ponta, como para obter uma abertura de cerca de diâmetro de 10 20Hm. </li><li> Ligue vácuo de poder, e suprimento de ar do aparelho de microinjeção (World instrumentos de precisão Inc., PV820 pneumáticos picopump). Inserir a agulha no porta-agulha montada sobre a base de micromanipulador e inclinação (Instrumentos Palavra Precision, Inc., Modelo M3301R, TB-1). </li><li> Para preencher a agulha, coloque uma gota (10μl) da solução a ser injetado na placa de Petri 30 milímetros preenchido com óleo mineral (Fisher Chemicals, 0121-1). Vire o micromanipulador manual de forma a submergir a ponta da agulha na gota de solução, defina o picopump &quot;hold / vent&quot; mudar para &quot;desabafar&quot; (&quot;vent&quot; equivale a vácuo no PV820), e preencher a agulha, puxando solução através da ponta da agulha. Isso levará alguns minutos, se a solução entra na agulha muito rápido,isso significa que o diâmetro da ponta é muito grande, e as injeções não serão precisos. Após a agulha é preenchido, defina a picopump para &quot;hold&quot; (&quot;hold&quot; equivale a injetar no PV820). </li><li> Para calibrar a agulha, defina o picopump &quot;gated / timed&quot; mudar para &quot;gated&quot;, pressione o pedal para descarregar a agulha, e gravar o tempo que leva (segundos) para o menisco para viajar de uma marcação para o próximo (1 distância total mm). Repita 3 vezes, o tempo médio (em segundos), e dividir o valor por 30 (volume em nanolitros (nl) correspondente a 1 mm de distância linear) para determinar o número de milissegundos necessários para entregar um nl de solução. Ajuste o botão período de intervalo para este número e mover o &quot;gated / timed&quot; mudar para &quot;cronometrado&quot;. Agora, o picopump está definido para entregar um pulso 1nl de solução. </li><li> Retire o prato de óleo mineral ea posição do prato de Petri com as larvas sob o microscópio. Grupo o peixe no centro da placa de Petri e foco. </li><li> Coloque a pipeta holding na bomba de micro-manual (MMP, instrumentos de precisão Mundial) no lado oposto do microinjetor, antecipadamente sua ponta para a placa de Petri, e no plano de foco do microscópio. Dobrá-lo com um ângulo bastante superficial, de modo que a ponta da pipeta holding é tocar o fundo da placa de Petri e está perto de horizontal. Certifique-se de não ter qualquer bolha de ar no sistema, o que poderia retardar o tempo de resposta e diminuir a precisão da MMP. </li><li> Mudar para uma maior ampliação no microscópio e usar um cílios superfino com alça (Ted Pella 113) para posicionar o lado dorsal das larvas de peixes para baixo com a gema muito perto da pipeta holding. Segure o peixe larval sugando a gema na pipeta holding girando anti-horário na unidade micrômetro controlar a bomba micro manual. Tome cuidado para não transformar o micrômetro longe demais, como a gema pode estourar se puxou muito profundo para a pipeta holding. Foco na veia cardinal comum, formando, que se encontra sobre a gema, logo abaixo da periderme e é o local do fluxo sanguíneo muito elevado. Com o micromanipulador do aparelho de injeção, guiar a agulha para o desenvolvimento comum veia cardinal. É tipicamente necessário retirar a agulha um pouco para trás após a inserção, como a veia cardinal comum é muito superficial. Injetar 1nl de solução pressionando o pedal, em seguida, solte as larvas da pipeta holding e devolvê-lo à água embrião. Esta é uma etapa crítica, especialmente pela primeira vez, porque requer uma certa quantidade de prática no posicionamento do peixe e controlar a sucção e pressão do equipamento. Se a gema do embrião é adequadamente realizado, com a pipeta de holding, que não vai rolar como a agulha entra. </li><li> Para verificar o sucesso da microinjeção, monitorar a presença do amarelo lucifer dextran no coração do peixe zebra em um microscópio fluorescente. O amarelo lucifer permanece visível no coração durante aproximadamente 20 minutos antes de se dissipar para o sistema circulatório Se a solução é injetada nefrotóxicos corretamente, dentro de 2 horas da injeção você vai ver muito pouco lucifer amarelo dextran restantes no local da injeção. Se a solução é injetada no saco vitelino, um ponto de lucifer amarelo dextran permanecerá no local da injeção. (Fig. 1). Devolver o peixe ao meio E3. </li><li> Dois dias após a injecção, as larvas se desenvolvem edema de pericárdio como conseqüência da diminuição da função renal (Fig. 2). </li></ul> Parte 2: Fixação e imunofluorescência com Na + / K + ATPase de anticorpos (α-6F) <ul><li> Em 4 dpf, coloque entre 10 e 15 zebrafish larval em frascos de vidro 4ml (Weathon, 225.012) e corrigi-los em 1ml Dent (80% MeOH DMSO 20%) por 4 horas à temperatura ambiente. </li><li> Hidratar os embriões em um MeOH classificados / PBT (PBS com 0,5% Tween20) série, 75:25 50:50, 25:75, PBT 100%, pipetagem a solução para fora e adicionando nova solução para o frasco do mesmo (1 ml de solução por frasco), 20 minutos em cada solução. Larvas nunca deve ser exposto ao ar, deixe uma solução pouco cobrindo as larvas quando mudar soluções. </li><li> Remover e substituir PBT 1ml com solução de bloqueio (PBS com DMSO 1%, 0,5% Tween20, soro de cabra 10% normal) durante 3 horas a 4 ° C em um nutator. </li><li> Transferência das larvas em uma microcentrífuga 2ml. Remova o bloqueio de soro e substituir com o anticorpo primário 300 ul em solução de incubação (PBS com DMSO 1%, 0,5% Tween20, 2% soro de cabra normal) durante a noite a 4 ° C em um nutator. Nós usamos um anticorpo monoclonal Na + / K + ATPase de anticorpos (α-6F, sobrenadante, Estudos de Desenvolvimento Hibridoma Bank, Iowa) na diluição de 1:25 </li><li> Remover o anticorpo primário e lavar 3 x 30 minutos com solução de incubação à temperatura ambiente. </li><li> Incubar com anticorpo secundário (cabra anti-camundongo Cy3, Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc. 155-165-003) diluído 1:500 em solução de incubação por 2 horas aRT. </li><li> Lavar 3 x 30 minutos com PBT. </li></ul> Parte 3: incorporação de plástico com JB-4 <ul><li> Desidratar tecidos através de uma série de etanol classificados (50%, 75%, 95%, 100% x 2), 10 minutos por etapa. </li><li> Preparar a solução de infiltração: 25 ml de JB-4 Solução Incorporação A (Polysciences 0226A) e 0,24 g de catalisador (Polysciences 02.618). Demora um tempo para o catalisador para dissolver, cerca de 20-30 minutos. A solução pode ser armazenada a 4 ° C até 1 mês. </li><li> Decantar o etanol 100% e substituir com a solução de infiltração de plástico. Colocar os tubos a 4 ° C em um rotador e permitir a infiltração de prosseguir até que o dissipador de larvas para o fundo do frasco de vidro. Este processo geralmente leva cerca de 30 minutos. </li><li> Incorporação de protocolo: Coloque a bandeja de copo de plástico de moldagem (Polysciences, Inc. 16643A) sob um microscópio de dissecação. Transferir as larvas, junto com a solução de infiltração para cobrir, para os copos. A mídia incorporação de plástico é preparado em um pequeno tubo de plástico. Nós normalmente incorporar 4-5 peixes de cada vez, um peixe para cada xícara. Prepare 5-6 ml de plástico incorporação (1,2 ml de solução de incorporação para cada copo) a adição de 35 mL de JB-4 Incorporação Solução &quot;B&quot; (Polysciences Inc. 0226B) para cada ml de solução de infiltração. Adicionar 35 mL de JB-4 Solução Embedding &quot;B&quot; (Polysciences Inc. 0226B) para cada ml de solução de infiltração. Misture bem, pipetando para cima e para baixo com um plástico vezes pipeta Pasteur diversas. Isto é importante porque se não for bem misturada o JB-4 não irá polimerizar adequadamente. Depois de 5ml de plástico incorporação foi preparado, retire a infiltração de plástico de cerca de amostras com uma pipeta Pasteur. Encha o copo com a incorporação de plástico. O plástico deve sair fora do copo, para garantir uma boa pega do titular bloco para o espécime. Para detectar zebrafish túbulos renais, as seções transversais são as melhores. Para este fim, os peixes são incorporados na vertical, cabeça para baixo. Com a ajuda de um cílio com alça fina ou fórceps, periodicamente a posição do peixe na vertical, até que o plástico é duro o suficiente para que eles não se movem a partir de sua posição. Demora cerca de 20-30 minutos. Então, coloque o Titular EBH-2 Block (Polysciences Inc. 15.899) sobre os copos e deixe a bandeja a 4 ° C durante a noite. Quando polimerização em completa, você pode sair como os blocos de cubos de gelo. </li><li> Protocolo de incorporação de múltiplas alternativas para as larvas: Encha até a metade com moldes completa JB-4 e deixe-a polimerizar. Para os 15 milímetros quadrados moldes usamos o volume JB-4 em 700μl para encher o molde pela metade. Em seguida, adicione as larvas JB-4 embebido com endurecedor para a pré-polimerizado meio-cheio moldes. Orientar as larvas com a cabeça apontando para o lado mais longo do molde e alinhar as larvas para que o line up olhos (você pode colocar 10 peixes em um único molde em uma linha). Depois que o bloco é polimerizado você pode cortar as bordas do bloco, transformá-lo de modo que o lado está a enfrentar a faca e super cola-lo para um plástico &quot;chuck&quot; que se encaixa no micrótomo. Com este método você pode posicionar um grande número de larvas no mesmo bloco, centrado no plástico, e pronto para seções transversais. O cuidado deve ser tomado orientar o bloco para a faca de modo que as seções equivalentes de cada peixe são tomadas em uma única seção. Isso pode ser feito enquanto o corte através dos olhos, ou seja, orientar o bloco de modo que as seções equivalentes dos olhos são tomadas para cada peixe. O resultado final é que você pode analisar muitos peixes concomitantemente em uma única lâmina de microscopia. </li></ul> Parte 4: Seccionamento <ul><li> Definir a amostra no suporte chuck do micrótomo (usamos um Shandon Finesse Thermo Electro Corporação micrótomo) </li><li> Definir o slide mais quente a 45 ° C. </li><li> Despeje a água DI, para um copo e coloque-o perto do micrótomo </li><li> Antes de seccionamento, certifique-se o bloco é orientada de modo a se obter perfeita secções transversais do peixe. A orientação alavancas de ajuste de cabeça pode ser girada permitindo que a posição do cabeçote da amostra com precisão para a faca. Iniciar o corte de espessura através da cabeça do peixe. Enquanto o corte através dos olhos, orientar o bloco de modo que as seções equivalentes dos olhos são tomadas para cada peixe. Quando as barbatanas peitorais aparecem nas seções, que é quando os túbulos pronephric começar. A partir deste ponto, cortar cerca de 32 hm 4 seções do bloco. </li><li> Recolher as seções com uma pinça e deixe-as cair no copo com água, sem tocar a água com a pinça. A seção vai expandir assim que atinge a superfície da água, agora você pode cobrá-lo em um slide. Inserir o slide para a água em um ângulo de 45 ° e abordagem a seção com a ajuda de um cílio com alça, tocando só as fronteiras da seção. </li><li> Incubar as lâminas em um slide mais quente até que esteja completamente seco. </li><li> Seções imagem usando microscopia de epifluorescência ou confocal. </li></ul> Parte 5: Representante Results Quando realizada corretamente, peixes injetados aparecer como na figura 1, com pouco fluorescentes dextran (neste caso, Lucifer Yellow) visível no coração e no sistema circulatório. Se a injecção é muito profundo, material injetado pode ser visto concentrada no saco vitelino, ou o coração pode ser perfurada causando sangramento excessivo. Se a pipeta holding é feita corretamente, o peixe não vai rolar ou mover quando injetado, e isso vai permitir uma injecção mais precisas. Além disso, é importante certificar-se de não ter qualquer bolha de ar no PDM, o que poderia retardar o tempo de resposta e diminuir a precisão do sistema. Geralmente, como conseqüência de nefrotoxicidade gentamicina, 80% dos peixes injetados desenvolver edema de pericárdio (Fig. 2). Usamos um sistema de classificação baseado fenótipo, em que os peixes com edema moderado mostrar edema de pericárdio evidente, mas os outros não observáveis ​​fenótipos, enquanto que os peixes severamente edematoso mostrar edema pericárdico e tronco, com ligeira a moderada curvatura do eixo. Usando um anticorpo contra o túbulo renal Na + / K + ATPase (α-6F) podemos visualizar os túbulos danificado em seções transversais, com uma perda evidente de polaridade celular e interrupção tubular nos túbulos danificado em comparação aos controles (Fig. 3). Este padrão é consistente através de múltiplos cortes transversais. A fim de obter perfeita secções transversais dos túbulos renais é importante para posicionar o peixe corretamente durante a incorporação. Ao comparar seções, nadadeiras peitorais e túbulos proximal convoluted são usados ​​como marcadores anatômicos. <img src="/files/ftp_upload/2079/2079Fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Microinjeção nefrotoxina. (A) de injeção de sucesso de um dextran 10kDa conjugado com lucifer amarelo, com expressão fraca na veia comum cardinal, seta branca. (B) a injeção incorreta, resultando em um depósito de 10kDa dextran conjugado com amarelo lucifer que não se dissipa para o sistema circulatório, seta vermelha. <img src="/files/ftp_upload/2079/2079Fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Gentamicina mediado edema. (A) Controle injetado zebrafish larval. Gentamicina injetado zebrafish larval com (B) ou moderada (C) edema grave. Todas as larvas são menos 4 dpf com anterior para a esquerda e dorsal é para cima. Setas pretas apontam para edema pericárdico em B e C. <img src="/files/ftp_upload/2079/2079Fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. AKI imuno-histoquímica. α-6F coloração de anticorpos para ATPase Na + + / K-48 horas após a injecção de gentamicina (4 larvas dpf) no controle (A, B) e injetados gentamicina (C, D) larvas. A, C estão em 20X de ampliação e de B e D são 3X ampliações digitais dos túbulos direito em A e C. Nota perda de polaridade basolateral e ruptura dos túbulos, seta branca, em D, em comparação com B.

<ol>
	<li>Hentschel, D. M., Park, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+renal+failure+in+zebrafish:+a+novel+system+to+study+a+complex+disease.">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).</li><li>Majumdar, A., Lun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+no+isthmus+reveals+a+role+for+pax2.1+in+tubule+differentiation+and+patterning+events+in+the+pronephric+primordia.">Zebrafish no isthmus reveals a role for pax2.1 in tubule differentiation and patterning events in the pronephric primordia.</a> Development. 127 (10), 2089-2098 (2000).</li><li>Weinstein, B. M., Stemple, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gridlock,+a+localized+heritable+vascular+patterning+defect+in+the+zebrafish.">Gridlock, a localized heritable vascular patterning defect in the zebrafish.</a> Nat Med. 1 (11), 1143-1147 (1995).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (1993).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste artigo de vídeo demonstramos uma técnica de microinjeção intravenosa por um modelo de LRA, através da criação de gentamicina danos proximal mediada tubular em larvas do peixe. Este dano resulta na formação de pericárdio e / ou edema bruto, refletindo uma incapacidade de regular o equilíbrio hídrico. Nós também descreveu um experimento imuno-histoquímica com um anticorpo que marca túbulos renais diferenciados (Majumdar et al. 2000), mostrando a perda da polaridade celular e uma interrupção do túbulo proximal nos rins danificados. Microinjeções intravenosa representam um método eficiente para a entrega de uma substância solúvel na corrente sanguínea de larvas de peixe-zebra. Esta técnica é uma excelente ferramenta para a introdução de uma variedade de substâncias e com a ajuda de uma injeção uniforme marcador fluorescente pode ser repetido muitas vezes permitindo a resultados consistentes.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>&alpha;6F mouse monoclonal </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Developmental study Hbridoma Bank</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Block Holder EBH-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>15899</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, INC</td>
<td>TW100-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillary tubes R-6 Custom Glass Tubing </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific Company, Broomall PA</td>
<td>9-000-3000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catalyst Powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>02618</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cy3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.</td>
<td>155-165-003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran 10k Lucifer yellow, lysine fixable</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular probes</td>
<td>D1825</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D8418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eyelash</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ted Pella</td>
<td>113</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich </td>
<td>G8648</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass vials 4ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Weathon</td>
<td>225012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Iron plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nariscige</td>
<td>IP</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>JB-4 Embedding Solution A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences Inc.</td>
<td>0226A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>JB-4 Embedding Solution B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>0226B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Joystick micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige</td>
<td>MN 151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnetic stand</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige</td>
<td>MN-151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Manual microsyringe pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection apparatus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>PV820</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>M3301R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microtome</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Electro Corporation</td>
<td>Shandon Finesse</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mineral oil, light</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Chemicals</td>
<td>0121-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kopf</td>
<td>720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic molding cup tray</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>16643A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Razor blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WVR Scientific</td>
<td>55411-050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slide warmer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lab line</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stage micrometer </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wards </td>
<td>94 W 9910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tilting base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>TB 1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tricaine powder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A-5040</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>P7949</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>S6F</td>
<td>Dissecting microscope</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>M205FA</td>
<td>Fluorescent microscope</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

intravenous microinjections of zebrafish larvae to study acute kidney injury

Neste artigo de vídeo descrevemos um modelo de zebrafish AKI utilizando gentamicina como o nephrotoxicant. A técnica consiste em microinjeções intravenosa em 2 zebrafish dpf. Esta técnica representa um método eficiente e rápido para entregar substâncias solúveis na corrente sangüínea de larvas de peixe-zebra, permitindo a injeção de peixes 15-20 por hora. Além AKI estudos, esta técnica de microinjeção também pode ser usado para outros tipos de estudos experimentais, como a angiografia. Nós fornecemos um protocolo detalhado da técnica de equipamentos necessários para medidas visuais da função renal diminuída. Além disso, também queremos demonstrar o processo de fixação imunohistoquímica montagem, toda com um marcador túbulos renais, a incorporação de plástico e secção do peixe-zebra larval. Nós demonstramos que larvas do peixe injetada com gentamicina mostram características morfológicas consistentes com AKI: edema, perda da polaridade celular em células epiteliais tubulares proximais e interrupção morfológica do túbulo.

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Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

Descrevemos uma técnica de microinjecting a aminoglicosídeos, gentamicina, em dois dias pós-fetilization (dpf) larvas de peixe-zebra para induzir lesão renal aguda (IRA). Nós também descrevem um método para montar toda a imunohistoquímica, plástico incorporação e secção de larvas de peixe-zebra para visualizar os danos mediados AKI.

Microinjeções intravenosa de larvas do peixe para o Estudo de lesão renal aguda

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

intravenous-microinjections-zebrafish-larvae-to-study-acute-kidney

Research

JoVE Journal

Biology

22.4K visualizações.  University of Pittsburgh. Descrevemos uma técnica de microinjecting a aminoglicosídeos, gentamicina, em dois dias pós-fetilization (dpf) larvas de peixe-zebra para induzir lesão renal aguda (IRA). Nós também descrevem um método para montar toda a imunohistoquímica, plástico incorporação e secção de larvas de peixe-zebra para visualizar os danos mediados AKI.

Vídeo: Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Teste de sensibilidade visual para a velocidade e direção do movimento em Lagartos

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Biologia

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Transplante de Medula Renal inteiro em Zebrafish Adulto

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Usando a resposta optocinético para estudar a função visual de zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Transplante de células diretamente no Rim de Adulto Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissecção do rim Zebrafish Adulto

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Ablação a laser da Pronephros Zebrafish para estudo da regeneração epitelial renal

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Laser-infligido Lesão de Zebrafish muscular esquelético embrionário

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Microgavage of Zebrafish Larvae

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe interactions17-25. Experimental approaches for studying intestinal biology often require the in vivo introduction of selected materials into the lumen of the intestine. In the larval zebrafish model, this is typically accomplished by immersing fish in a solution of the selected material, or by injection through the abdominal wall. Using the immersion method, it is difficult to accurately monitor or control the route or timing of material delivery to the intestine. For this reason, immersion exposure can cause unintended toxicity and other effects on extraintestinal tissues, limiting the potential range of material amounts that can be delivered into the intestine. Also, the amount of material ingested during immersion exposure can vary significantly between individual larvae26. Although these problems are not encountered during direct injection through the abdominal wall, proper injection is difficult and causes tissue damage which could influence experimental results. We introduce a method for microgavage of zebrafish larvae. The goal of this method is to provide a safe, effective, and consistent way to deliver material directly to the lumen of the anterior intestine in larval zebrafish with controlled timing. Microgavage utilizes standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment common to most laboratories that perform zebrafish research. Once fish are properly positioned in methylcellulose, gavage can be performed quickly at a rate of approximately 7-10 fish/ min, and post-gavage survival approaches 100% depending on the gavaged material. We also show that microgavage can permit loading of the intestinal lumen with high concentrations of materials that are lethal to fish when exposed by immersion. To demonstrate the utility of this method, we present a fluorescent dextran microgavage assay that can be used to quantify transit from the intestinal lumen to extraintestinal spaces. This test can be used to verify proper execution of the microgavage procedure, and also provides a novel zebrafish assay to examine intestinal epithelial barrier integrity under different experimental conditions (e.g. genetic manipulation, drug treatment, or exposure to environmental factors). Furthermore, we show how gavage can be used to evaluate intestinal motility by gavaging fluorescent microspheres and monitoring their subsequent transit. Microgavage can be applied to deliver diverse materials such as live microorganisms, secreted microbial factors/toxins, pharmacological agents, and physiological probes. With these capabilities, the larval zebrafish microgavage method has the potential to enhance a broad range of research fields using the zebrafish model system.

We present a novel method for microgavage of larval zebrafish utilizing standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment. We demonstrate that microgavage is a safe and efficient technique useful for delivering controlled amounts of diverse materials specifically into the larval zebrafish intestinal lumen.

Microgavage de larvas do peixe

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Medição de força durante a contração para avaliar a função muscular em larvas do peixe

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microinjeções de ouriço do mar zigotos

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...