O objetivo geral deste procedimento, é explicado o uso de cisplatina como agente nefrotóxico em peixes-zebra adultos, analisando inflamação e morte celular no tecido renal. Para conseguir isso, o peixe-zebra adulto é anestesiado e pesado para injetar em uma dose específica de cisplatina na cavidade peritoneal. Após o monitoramento da mortalidade, o rim é dissecado e as células são isoladas para citometria de fluxo ou fixas e dissecadas para serem analisadas pelo ensaio TUNEL fluorescente.
Os seguintes procedimentos podem ajudar a responder a perguntas-chave no campo renal usando os efeitos nefrotóxicos da cisplatina como uma ferramenta para desenvolver um modelo de lesão renal aguda e peixe-zebra adulto. Este modelo pode ser usado para a exploração de novos alvos terapêuticos na proteção renal, bem como elucidar o mecanismo de regeneração no rim de peixe zebra. Cisplatina é um agente de quimioterapia usado para tratar uma variedade de câncer.
No entanto, pode facilmente se acumular no rim, gerando morte celular, inflamação e diminuição da função renal. O efeito da cisplatina é dependente de dose, então você pode diminuir nosso aumento de dosagem depender de seus objetivos. As técnicas utilizadas aqui para analisar inflamação e morte celular não são exclusivamente para disseminação do modelo da doença.
A citometria de fluxo em peixes-zebra pode ajudar a elucidar os estados inflamatórios do animal de forma quantitativa, enquanto na TUNEL dizemos que pode esclarecer a presença de células poptosed nos contextos fisiológico e patológico. Antes de iniciar o experimento, prepare a solução de trabalho cisplatina diluindo a solução de estoque para 820 microgramas por mil em cloreto de sódio de 0,9%. Em seguida, anestesiar outro peixe zebra e secar o excesso de água em algumas toalhas de papel.
Pesar o peixe colocando-os em uma balança, tomando nota do peso. Faça os cálculos para saber o volume exato para injetar. Para alcançar a dose de 120 microgramas por grama de peso, use a próxima fórmula.
Divida a dose final pela dose da solução de trabalho e converta esse número em microliters, multiplicando-se por 1000 para obter o volume de 120 microgramas de cisplatina. Em seguida, multiplique esse número pelo peso do peixe para obter o volume final a ser injetado. Coloque um peixe em uma esponja molhada, com um pouco de xícara para segurá-lo.
Com o lado ventral para cima e encher uma seringa de insulina com um volume calculado de cisplatina. Insira a agulha na linha média ventral em um ângulo raso, puxando suavemente a parede ventral para cima para evitar perfurar órgãos internos. E então injete a solução.
Após a injeção, coloque um peixe em um tanque para se recuperar da anestesia, e aguarde sinais de recuperação, como natação e movimentos apropriados. Monitore os peixes duas vezes por dia nos próximos dias. Nesta dose, a cisplatina induz cerca de 30% da mortalidade nas primeiras 24 horas.
Eutanize o peixe e seque o excesso de água em uma toalha de papel. Depois de remover a cabeça e os órgãos internos, use agulhas de dissecção para fixar as paredes do corpo. Localize o rim na parede dorsal do peixe, e use fórceps para desprender o rim.
Coloque o rim em uma placa de seis poços com uma solução legal de um PBS 1X, 2%FBS e mantenha no gelo. Em seguida, pegue o tecido com algum líquido e passe-o através de um coador de células de 40 mícrons, e macerar suavemente o tecido com um êmbolo de seringa. Lave duas vezes com um PBS 1X, 2%FBS.
E coletar as células em um tubo falcão de 50 mil. Em seguida, centrífugas por cinco minutos a 400 G.Cuidado pegar o supernatante com uma pipeta e descartá-lo. Adicione 500 microliters de PBS frio 1X para suspender as células e colocá-las em um tubo de citometria de fluxo de cinco mil.
Mantenha-os no gelo. Pegue 10 microliters da amostra e misture-a com 90 microliters de azul tripano em um tubo Eppendorf. Adicione 10 microlitros da mistura a uma câmara de Neobauer e conte células no microscópio.
Pegue as células para serem lidas por um citômetro e, em seguida, analise os resultados selecionando a população de seus interesses. Para este procedimento, eutanize um peixe e remova órgãos internos deixando o rim preso ao corpo. Em seguida, fixar as paredes do corpo em uma superfície de rolha e colocá-la para baixo sobre a solução de fixação.
Mantenha-o a quatro graus durante a noite. No dia seguinte, disseca o rim com força fina. Tente não interrompê-lo.
Coloque-o em uma pequena placa de petri ou tubo Eppendorf com 1X PBS para enxaguar. Mude o PBS e prepare-se 2% de agarose para gerar uma matriz de apoio para o rim antes que eles processem solidamente. Descarte todos os PBS restantes e despeje a agarose lentamente.
Em seguida, posicione o rim com fórceps finos para evitar que ele dobre. Deixe agarose solidificar à temperatura ambiente. Após a solidariedade de agarose, use um bisturi para cortar Agarose ao redor dos rins formando um pequeno cubo.
Coloque os cubos de agarose dentro de uma fita histológica e envie-o para processamento histológico para incorporar o tecido em parafina. Os blocos de parafina, então cortaremos em cinco mícrons de espessura seções. Depilação desliza e mantê-los em água destilada.
Prepare uma câmara de incubadora escura, colocando toalhas de papel molhadas na parte inferior. Coloque os slides na câmara escura e adicione Proteinase K para permeabilização do tecido. Incubar por 30 minutos a 37 graus celsius.
Enquanto as amostras são incubadas, prepare a mistura de reação TUNEL, adicionando 50 microliters de solução enzimática em 450 microliters de solução de rótulo. E mantenha-se protegido da luz. Pegue a câmara escura e lave duas vezes com um PBS 1X.
Em seguida, seque os slides e na mistura de reação TUNEL. E incubar a 37 graus Celsius por duas horas. Após a incubação, lave este slides novamente com um PBS 1X.
E adicione DAPI para coloração de contador de núcleos. Incubando à temperatura ambiente por cinco minutos, protegido da luz. Enxágüe três vezes com um PBS 1X.
E então, molde os slides com um meio hidrofílico anti-fade. Coloque um recibo de cobertura. E selar com esmalte.
Visualize as amostras em um microscópio fluorescente. Neste gráfico, é possível ver que a cisplatina tem um efeito de resposta de dose na sobrevivência dos peixes, em comparação com um controle injetado apenas com cloreto de sódio de 0,9%. A linha vermelha neste gráfico representa uma dose de 120 microgramas por gramas utilizada neste vídeo.
Estas doses podem ser aplicadas a machos e fêmeas, pois não foi encontrada diferença estatística entre eles. A citometria de fluxo permite quantificar diferentes células presentes em um tecido. As populações de células hematopoiéticas são identificadas no rim de vários peixes pelo tamanho ou dispersão para a frente e granularidade ou dispersão de tamanho.
Dessa forma, é possível separar as populações em eritrócitos, linfócitos, granutócitos e precursores hematopoiéticos. Aqui, a estratégia atual do portão selecionando os granulócitos, singlets e células positivas mpo permitem encontrar a população dos neutrófilos no rim marcado pela expressão fluorescência da mieloperoxidase. Neste caso, a injeção de cisplatina induziu o aumento do percentual de neutrófilos presentes no rim.
O ensaio tunel permite detectar células apoptóticas em um tecido observando o deslizamento tecidual do rim por um microscópio de fluorescência, é possível ver sinal apoptético dentro dos núcleos de algumas células, aqui em vermelho. Contrastado por uma mancha nuclear em tal DAPI aqui em azul. A injeção de cisplatina aumentou a presença de células apoptóticas no rim, que são possíveis de quantificar manualmente ou usando um software de imagem.
No final deste vídeo você deve ser capaz de saber como injetar e ajustar a dose de cisplatina para induzir lesão renal aguda em peixes-zebra adultos. E como dissecar o rim para diferentes propósitos. A citometria de fluxo é uma excelente ferramenta que vai ajudá-lo a entender o perfil de diferentes tipos de células dependentes da disponibilidade de linhas tragenclave em seu laboratório.
Lembre-se de considerar a cor das linhas de transportadores se você quiser usar anticorpos para rotular todos os seus tipos de células. O ensaio TUNEL é uma ferramenta simples que nos permite detectar células e tecidos apoptóticos, e pode ser analisado não apenas por microscopia, mas também por citometria de fluxo. Lembre-se, use sempre equipamentos de proteção individual durante todo o procedimento.
