Este protocolo permite o isolamento axoplasma com minimização de contaminação dos tecidos gliais e vasculares. O método rende aproximadamente 70-100 mg de proteína total por um axoplasma 10/08 ratos Wistar semanas de idade. 1. Dissecar nervo ciático <ol><li> Euthanize dois ratos por inalação de CO 2 seguido por deslocamento cervical. Confirmar a morte pela palpação por falta de batimentos cardíacos antes do início dissecção. </li><li> Swab a área de dissecção com etanol 70%. </li><li> Cortar a pele, músculos separar e isolar do nervo isquiático com tesoura e pinça com cuidado, sem danificar os vasos sanguíneos. Dissecar ambos os nervos ciático (cerca de 1,5 cm cada) de cada animal e recolher todos os quatro nervos em um eppendorf com 500 mL PBS 0,2 X + inibidores, conservados no gelo. </li><li> Transferir os segmentos nervosos para pratos de plástico contendo pelo menos 2 mL de PBS + 0,2 X inibidores da protease. </li><li> Remover o epineuro dos nervos usando uma pinça fina no âmbito binocular. Separar os fascículos com muito cuidado até que se tornem nublado e começar a flutuar na superfície da solução. Esta etapa deve ser praticado até que possa ser realizada com rapidez e precisão (não tendo mais de 10 min por nervo). </li></ol> 2. Lavar incubação, e eluição <ol><li> Transferência de fascículos separados para um novo tubo Eppendorf com 500 mL de PBS contendo inibidores da protease de 0,2 para a incubação por 2 horas em temperatura ambiente. </li><li> Lavar pelo menos 3 vezes com 1 mL do mesmo tampão, transferindo os fascículos a partir de tubo eppendorf para tubo eppendorf e agitação por 5 min após a transferência. </li><li> Para remover o excesso de líquido colocar os fascículos em um tubo eppendorf novo vazio e depois transferir os fascículos para um tubo eppendorf novo com 300 mL de PBS 1X contendo inibidor da protease para a incubação por 20-30 min em temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar 10 min a 10.000 xg, a 4 ° C. </li><li> Leve o sobrenadante e concentração de proteína medida. Esta é a sua preparação axoplasma. </li></ol> 3. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2087/2087fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Ocidental axoplasma blot comparando isolados pelo método de aperto manual com amostras axoplasma isolado como mostrado neste protocolo. Observe a redução dos níveis de albumina e GFAP, representando proteína do sangue e contaminações de células gliais, respectivamente. Em contraste, axonal tubulina b3 é enriquecida nesta preparação, o que indica um alto nível de proteínas axonal.

<ol>
	<li>Hanz, S., Perlson, E., Willis, D., Zheng, J. Q., Massarwa, R., Huerta, J. J., Koltzenburg, M., Kohler, M., van-Minnen, J., Twiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axoplasmic+importins+enable+retrograde+injury+signaling+in+lesioned+nerve.">Axoplasmic importins enable retrograde injury signaling in lesioned nerve.</a> Neuron. 40, 1095-1104 (2003).</li><li>Michaelevski, I., Medzihradszky, K. F., Lynn, A., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+proteomics+reveals+mobilization+of+translation+machinery+to+the+lesion+site+in+injured+sciatic+nerve.">Axonal transport proteomics reveals mobilization of translation machinery to the lesion site in injured sciatic nerve.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (5), 976-987 (2010).</li><li>Rishal, I., Michaelevski, I., Rozenbaum, M., Shinder, V., Medzihradszky, K. F., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axoplasm+isolation+from+peripheral+nerve.">Axoplasm isolation from peripheral nerve.</a> Dev Neurobiol. 70, 126-133 (2010).</li><li>Twiss, J. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomes+in+axons--scrounging+from+the+neighbors.">Ribosomes in axons--scrounging from the neighbors.</a> Trends Cell Biol. 19, 236-243 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Análises bioquímicas e proteômica confirmaram que este procedimento reduz a contaminação de células gliais soro e 3 em relação aos métodos descritos anteriormente para o isolamento por axoplasma espremer mecânica 1. Nós temos usado esse protocolo de isolamento axoplasma para explorar dineína baseado sinalização retrógrada após a lesão do nervo ciático 2, e esperar que ela tenha utilidade na exploração de muitos outros processos no nervo periférico de adultos, incluin...

<ul><li> Ratos Wistar (80-10 semanas) </li><li> PBS 0,2 X e PBS 1X soluções contendo inibidores da protease (Roshe) 2 comprimidos por 50 ml </li><li> Eppendorfs por 1,5 ml </li><li> Pratos de plástico esterilizado 35 milímetros </li><li> Ferramentas de dissecação, incluindo: uma tesoura e uma pinça fina </li><li> Luz binocular e tabela </li></ul> Anticorpos Clone de rato anti-GFAP GA-5 foi da Sigma (G6171). Coelho anti-albumina foi de Cedarlane (CLAG5140). Β3 rato anti-tubulina e coelho anti-Gerk eram da Sigma (T2200 e M5670, respectivamente).

axoplasm isolation from rat sciatic nerve

Isolamento do citoplasma axonal puro (axoplasma) de nervo periférico é fundamental para estudos bioquímicos de muitos processos biológicos. Neste artigo, vamos demonstrar e descrever um protocolo para o isolamento axoplasma do nervo ciático de ratos adultos com base nas seguintes etapas: (1) dissecção dos fascículos do nervo e separação do tecido conjuntivo, (2) de incubação de pequenos segmentos de fascículos nervosos em meio hipotônico a liberação de mielina e lise não-axonal estruturas, e (3) extração do material axônio enriquecido restantes. Caracterização proteômica e bioquímica desta preparação confirmou um alto grau de enriquecimento para componentes axonal.

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Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

Demonstramos um protocolo para o isolamento axoplasma do nervo ciático de ratos adultos com base na dissecação de fascículos do nervo e incubação em meio hipotônico para liberar mielina e lise não-axonal estruturas, seguida de extração dos restantes materiais axônio enriquecido.

Isolamento axoplasma de nervo ciático do rato

Isolation of pure axonal cytoplasm (axoplasm) from peripheral nerve is crucial for biochemical studies of many biological processes. In this article, we ...

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13.5K visualizações.  Weizmann Institute of Science. Demonstramos um protocolo para o isolamento axoplasma do nervo ciático de ratos adultos com base na dissecação de fascículos do nervo e incubação em meio hipotônico para liberar mielina e lise não-axonal estruturas, seguida de extração dos restantes materiais axônio enriquecido.