Os autores gostariam de agradecer a Joseph Loturco e Dennis Selkoe para discussões úteis sobre esta técnica. Os autores agradecem os doadores da Fundação Americana de Assistência à Saúde, para apoio a esta pesquisa.

O protocolo básico para eletroporação no útero tem sido descrito em detalhe em outro artigo JOVE do laboratório Kriegstein 1, 2. Esta técnica foi descrita originalmente no laboratório Osumi 3 e nosso protocolo é baseado em uma desenvolvido no laboratório Loturco 4. Nós iremos fornecer uma visão geral do protocolo no nosso eletroporação útero de embriões de ratos, focando os detalhes mais importantes, seguido por uma descrição do nosso protocolo que se aplica em eletroporação utero ao estudo da função do gene em conseqüência processo neuronal. 1. Em Eletroporação utero <ol><li> Preparando-se agulhas de DNA e de carga O primeiro passo no electroporations útero é a concepção de seu experimento para determinar o DNA construções que você quer injetar. Este método é útil tanto para misexpressing ou derrubando genes de interesse. Se você está pensando em misexpressing ou superexpressão de um gene, não se esqueça de usar um promotor que atua em células precursoras neuronais. Recomendamos o promotor CAGGS, que consiste do frango promotor beta-actina eo enhancer CMV 5. Uma vez que apenas um pequeno subconjunto de células são transfectadas usando em eletroporação utero, é fundamental a inclusão de um plasmídeo uma proteína fluorescente GFP, como de modo que você pode seguir as células que foram sucesso electroporated. Para a GFP plasmídeo, recomendamos preparar o DNA em uma concentração de 0,5 mg por microlitro. Para construções shRNA, descobrimos que 0,5-1,0 mg por mL em resultados eficientes knock down de seu gene de interesse. Para superexpressão ou misexpression, usamos entre 1,0 e 3,0 mg por microlitro, dependendo do tamanho do gene e do nível de expressão que o experimento exige. DNAs são preparados usando um kit Qiagen prep-endotoxina livre, e diluído em 1 x PBS. Nós injetar cerca de 0,5-1,0 mL por cérebro embrionário, assim, para uma ninhada de animais nos preparamos 10 L da mistura de DNA para a injecção. Nós adicionamos 1 mL de verde rápido até o DNA para que possamos seguir o DNA injetado. Puxar agulhas para a forma correta é uma etapa crítica. Walantus et al. Usa um sistema diferente para entregar o DNA e assim a sua preparação agulha também é diferente slighly 1,2 então a nossa. As configurações que você usa para puxar o seu agulhas vai depender do tipo de agulha extrator que você tem. Usamos Modelo 750 de David Kopf. As configurações que usamos são: Heat 1: 9,0, Heat 2: 0, Soleniod: 0, Filament tamanho 3,0 mm, Proximity Aquecedor: 3 mm, Tempo: 10 seg. Uma vez puxado, nós cortamos as nossas agulhas com uma lâmina de barbear em um ângulo de ~ 45 graus de tal forma que a distância entre a maior parte da abertura para a ponta é de 11 mm. Em seguida, carregar o DNA a partir do back-end da agulha. Em seguida, preencher o espaço restante na agulha com óleo de milho. Para a injecção de DNA, usamos um Picospritzer III. Dependendo do bisel exato em que é cortado para cada agulha, vamos definir o Picospritzer 4,0-6,0. Nós usamos um pedal para entregar o ar pressurizado que expele o DNA da agulha. </li><li> Preparar os animais para a cirurgia Usamos isentos de agentes patogénicos ratos Sprague Dawley exclusivamente para essas cirurgias. Vários outros laboratórios usam ratos de diferentes genótipos também. Aqui, descrevemos mostrar o nosso protocolo de eletroporação do E15 embriões de ratos, mas no útero eletroporação é rotineiramente realizados em ratos com idades entre E13 e E18. Enquanto eletroporação fase inicial alvos camadas profundas do córtex, electroporations fase posterior alvo as camadas mais superficiais. Animais recebem uma dose pré-operatória de buprenorfina (0,05-0,1 mg / kg) antes da cirurgia começa. Existem várias opções para anestesiar o animal. Walantus et al. Isofuorane utiliza inalação, enquanto que rotineiramente usam injeção intraperitoneal de cetamina (40-80 mg / kg) e xilazina (50-10 mg / kg) 1,2. Uma pitada pés devem ser sempre realizados para assegurar que os animais são completamente anestesiados e sem resposta. Animais são mantidos em uma almofada aquecida durante todo o procedimento cirúrgico. Pele do animal é raspada na região da incisão, e lavadas três vezes com etanol seguido por três vezes com iodo. É feita uma incisão na pele imediatamente lateral à linha média, seguido por uma incisão no músculo. Os cornos uterinos são expostos com muito cuidado. Eles são suavemente arreliado para fora da cavidade do corpo com o dedo. Manter embriões hidratados com PBS estéril, enquanto eles estão fora da cavidade do corpo. </li><li> DNA injetáveis ​​e eletroporação Quando você começa a realizar estas cirurgias, a parte mais difícil é se familiarizar com o local onde você precisa injetar o DNA para que você preencha os ventrículos laterais, e se acostumando com o quão profundo você injetar a agulha, a fim de atingir a região correta. Embriões são manipulados suavemente com os dedos para que você possa identverificam onde está a cabeça, e se você olhar atentamente você será capaz de ver a sutura mediana. Isto serve como um marco geral que você pode usar para determinar onde o ventrículo lateral está localizado. Nós injetar o DNA através da parede uterina e para o ventrículo lateral. Nós usamos um footpedal para controlar a injeção do DNA - pulsos múltiplos de DNA são realizados até o ventrículo lateral é preenchida com o DNA / mistura de corantes. Em seguida, coloque os eletrodos pá de cada lado da cabeça do embrião e usar outro footpedal para entregar o pulso do outro lado da cabeça do embrião. A colocação dos eletrodos é fundamental para determinar qual a região do córtex é electroporated. Uma vez que o DNA é negativamente carregado, o DNA vai viajar em direção ao eletrodo positivo, quando uma carga é dissipada através da pás. Dependendo da localização exata dos eletrodos, subconjuntos diferentes de células serão o alvo. Rotineiramente, coloque o eletrodo positivo perto as posições dorso-medial em todo o cérebro. No entanto, o laboratório Loturco bela mostrou que se você colocar os eletrodos em mais ventral regiões laterais do cérebro você pode direcionar as células das células córtico-estriatal de fronteira e hit do fluxo cortical lateral 6. Cada embrião pode ser electroporated, e diferentes combinações de construções de DNA pode ser usado em cada embrião. </li><li> Sutura e cuidados pós-operatórios Após a eletroporação de todos os embriões, os cornos uterinos são cuidadosamente voltou para a cavidade do corpo, e ambos a camada muscular ea pele são suturadas. A técnica para isso é descrito na Walantus et al 1,2. Os animais são monitorados continuamente, até que se recupera da anestesia, ea buprenorfina analgésico (0,05-0,1 mg / kg) é administrado a cada 8-12 horas. </li></ol> 2. Cultura Electroporated neurônios corticais <ol><li> Colheita cérebros electroporated e dissecando região electroporated Para análise in vivo seguintes eletroporação utero, os animais podem ser colhidas em qualquer ponto do tempo a partir de 24 horas após a eletroporação para logo após o nascimento à idade adulta. No entanto, quando os neurônios cultura primária colhemos 24 horas após a eletroporação em E16. Neste momento, os embriões electroporated estão expressando níveis detectáveis ​​de GFP. Os animais são sacrificados por inalação de dióxido de carbono usando a decapitação e rápida. Embriões são dissecados fora do útero e colocado em HBSS com cátions bivalentes, mantendo a par de que os embriões foram electroporated com que plasmídeos DNA. É fundamental usar HBSS filtrado, tubos estéreis e placas, e ferramentas de autoclavado para dissecção. Os córtices são dissecados e as meninges removidas usando um microscópio em uma capa. Estes são, então, córtices observado sob um microscópio de dissecação com a capacidade de visualizar GFP. GFP positivas regiões do córtex são identificados, e nós ue um par de Vanna tesoura para cortar as regiões GFP positivos a partir do córtex. Estas peças são colocadas em HBSS sem cátions divalentes em um tubo de 15 ml. </li><li> Dissociar e revestimento neurônios Uma vez que todas as regiões GFP positivos são dissecados, HBSS é substituído com tripsina 0,25%, e incubadas a 37 graus por 5 minutos. Tripsina é removido, substituído por placas de mídia (DMEM + 5% de SFB + Penn / strep glutamina +), e triturado 5-7 vezes a dissociar as células. Volumes utilizados dependem da quantidade de tecido presente. Células dissociadas são então semeadas em CC2 slides câmara revestido. Por dois slides de câmara, de placas nós 200,000-350,000 células por câmara em um volume de 1,5 mL dos meios de comunicação em placas. Após 4 horas, a mídia chapeamento é aspirado e substituído por 1,5 mL meio de cultura Neuronal (Neurobasal media + B27 + suplemento Glutamax + gentamicina) por câmara. </li></ol> 3. Analisando conseqüência Processo Neuronal <ol><li> Fixação e imunocoloração culturas , A fim de medida de curto prazo effecs de manipulação genética dessas células, colhemos os neurônios primários depois de três dias in vitro. Se neurônios primários estão a ser cultivadas mais tempo para análises adicionais, a metade dos media deve ser substituído a cada três dias. Para a fixação de culturas, que aspire a media das câmaras, e corrigir os neurônios em paraformaldhyde 4% por 15 minutos. Fixação seguintes, as células são lavadas duas vezes em PBS e depois colocar em solução de bloqueio (soro burro 2% com 0,1% Triton X-100 em PBS) por uma hora. Células são então incubados em anticorpo primário por 1 hora. Para as análises de conseqüência processo neuronal, usamos anti-beta tubululin anticorpos para identificar neurônios - beta tubulina imunocoloração II rotula a neruonal célula do corpo, dendritos e axônios. Células são então lavadas três vezes em PBS por cinco minutos, e depois incubadas em Cy3 anti-mouse para uma hora, seguido por mais três lavagens PBS, contracoloração núcleos com DAPI e montagem. </li><li> Medição necomprimento urite Imagens da GFP positivos, os neurônios beta-tubulina III positivas são adquiridas em um Axioskop Zeiss com um sistema de câmera MC100. Diversas variáveis ​​podem ser examinados nestas células GFP positivas incluindo o comprimento de todas as neurites, comprimento da maior neurite, a ramificação de neurites, o tamanho da soma das células, etc Temos utilizado este método para analisar processo de crescimento neuronal sobre derrubar ou superexpressão de genes relacionadas com o neurodesenvolvimento e neurodegeneração, com foco na duração do processo neuronal. Para medir conseqüência de processos neuronais, usamos Axiovision LE 4,4 software (de Zeiss). Dentro deste software, há uma opção para selecionar o &quot;esboço&quot; da ferramenta. Usando esta ferramenta, você pode usar o mouse do computador para rastrear a duração de cada processo neuronal. É fundamental definir o objetivo que você está usando a fim de obter uma medida precisa do seu neurites. Por essas análises, geralmente usamos um objetivo 20x. </li></ol> 4. Resultados representante Descobrimos que o tamanho da leitegada Sprague Dawley varia entre 6 e 14 embriões. Nós geralmente electroporate todos os embriões. Cada embrião pode ser electroporated com uma combinação diferente de DNAs. Porém, nós normalmente electroporate pelo menos quatro cérebros com a mesma condição e piscina estes cérebros antes de dissociar e revestimento. Descobrimos que com esta técnica cerca de 75% dos cérebros electroporated são direcionados para a região desejada do córtex, seja córtex medial dorsal ou ventral lateral (Figura 1). Além disso, temos encontrado electroporations cedo, E13-14 neurônios alvo camada profunda como a camada de neurônios Tbr1 positiva VI, enquanto electroporations mais tarde alvo CTIP2 positivo, TBR1 células V negativo camada, e ainda mais tarde alvo electroporations Brn2 positiva camada II / III células. Uma excelente descrição de marcadores diferentes e explicação de especificação subtipo de neurônios no córtex no encontrei um artigo por Moleneaux et al 7. A Figura 2 mostra cortes coronais do cérebro electroporated em cada dia embrionário 15,5 ou 17,5 e colhida no dia pós-natal 5. Mostrado em vermelho é imunomarcação para Oct6. Você pode immunostain para marcadores na cultura para confirmar o que as populações camada de células que você escolheu. Nós descobrimos que você pode esperar para a população-alvo mesma camada das células em cada embrião da mesma ninhada (em outras palavras, o direcionamento depende da timepoint embrionárias em vez de em outras variações técnicas). Na cultura, a porcentagem de células que são GFP positivas pode variar amplamente, dependendo de como você é conservador quando dissecando a região GFP positivos (Figura 3). No entanto, mesmo quando somos muito conservadores e dissecar apenas corrigir o GFP positivas de células, a porcentagem mais alta que observamos é 5-10% - embora você seja dissecar a região do córtex que foi electroporated, células em apenas uma camada irá ser alvo. Este efciência transfecção baixa é útil na identificação de processos que pertencem à célula electoporated que você está analisando. Células chapeamento neste densidade mais alta contribui para que as culturas heathier, no entanto, é difícil discernir qual o processo pertence a qual corpo celular nas células GFP negativo (Figura 3). Se você tiver problemas para ver todos os processos de multa de células electroporated, você pode aumentar a concentração de DNA GFP que você está electroporating para aumentar a expressão da GFP, ou você pode immunostain as células dissociadas usando um anticorpo anti-GFP (da Invitrogen ), juntamente com um anticorpo Cy2 secundário. <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. E15.5 Sprague-Dawley foram electroporated com GFP plasmídeo e colhida três dias depois. Com base na colocação dos eletrodos, diferentes regiões do córtex serão o alvo. AF mostram GFP fluorescência em cérebros inteiros. <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. E15.5 (A) ou E17.5 (B) Sprague-Dawley foram electroporated com GFP plasmídeo e colheita no dia pós-natal 5. Cérebros foram fixados, seccionados coronalmente usando um vibratome (100 seções micron), e histoquímica para Oct6 (vermelho). A e B mostram imagens confocal de seções imunocoradas. <img src="/files/ftp_upload/2103/2103fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. E15.5 Sprague-Dawley foram electroporated com GFP plasmídeo. 24 horas após a eletroporação, os cérebros foram colhidas e GFP-positivo, regiões electroporated foram dissecados e dissociadas, como descrito no vídeo. Depois de três dias in vitro, as células foram fixadas e histoquímica para BIII-tubulina (vermelho) e coloração núcleos com DAPI (azul) (A, C). O comprimento da maior neurite foi medida utilizando software Axiovision(B, D).

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	<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E16+rat+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos.">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70 (4-5), 155-1562 (2002).</li><li>Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+reveals+doublecortin+is+required+for+radial+migration+in+rat+neocortex.">RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex.</a> Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).</li><li>Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+the+developing+nervous+system+with+retrovirus+expressing+modified+green+fluorescent+protein.">Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein.</a> Exp Neurol. 156 (2), 394-406 (1999).</li><li>Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+DCX+and+LIS1+in+migration+through+the+lateral+cortical+stream+of+developing+forebrain.">The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain.</a> Dev Neurosci. , 144-156 (2008).</li><li>Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtype+specification+in+the+cerebral+cortex.">Neuronal subtype specification in the cerebral cortex.</a> Nat Rev Neurosci. , 427-437 (2007).</li><li>Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Function+for+-Amyloid+Precursor+Protein+in+Neuronal+Migration+Revealed+by+In+Utero+RNA+Interference.">A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference.</a> J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).</li><li>Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+APP+regulates+the+function+of+full-length+APP+in+neurite+outgrowth+through+interaction+with+integrin+beta1.">Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1.</a> Neural Develop. 3, 15-15 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Estudo in vitro de culturas primárias neuronais permitem análises quantitativas de crescimento de neuritos. A fim de estudar como as alterações genéticas afetam conseqüência processo neuronal, construções ou shRNA misexpression pode ser introduzida em neurônios primários via transfecção química ou transdução viral. No entanto, com células corticais primárias, uma piscina heterogêneo de tipos de células (neurônios glutamatérgicos de diferentes camadas, os neurônios inibitórios, c...

<table><tbody><tr><td>10X Hanks&amp;rsquo; Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca&lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt; /Mg &lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt; free)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>10X Hanks&amp;rsquo; Balanced Salt Solution (HBSS) (with Ca&lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt; /Mg &lt;sup&gt;+2&lt;/sup&gt; )</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES pH 7.4</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm Petri Dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mm Petri Dishes</td><td>BD Biosciences</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical vial</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>62-547-205</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical vial</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>62-554-205</td><td></td></tr><tr><td>Scissors </td><td>Fine Science Tools</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>Standard Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Curved Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11273-20</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas spring scissors </td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>.25% Trypsin-EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Reichert Bright-Line Hemacytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Hand-Held Tally Counter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z169021</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium (D-MEM)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11960-051</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>NEUROBASAL Medium </td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Serum-Free Supplement </td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX -I Supplement</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin Reagent Solution </td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>beta-III tubulin antibody</td><td>Chemicon International</td><td>MAB1637</td><td></td></tr><tr><td>MAP2 antibody</td><td>Chemicon International</td><td>AB15452</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Cy3 anti-mouse</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-166-151</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Cy2 anti-chicken</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-226-155</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>CC2 Coated Two-Chamber Slides </td><td>Lab-Tek</td><td>154852</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Mounting Media</td><td>KPL Inc</td><td>71-00-16</td><td></td></tr><tr><td>24 x 60 mm Micro Cover Glasses</td><td>VWR international</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>Clear nail polish</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Henry Schein</td><td>4015809TV</td><td></td></tr><tr><td>buprenorphine</td><td>Henry Schein</td><td>1118217</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BTX square wave electroporator</td><td>Fisher Scientific</td><td>BTXECM830</td><td></td></tr><tr><td>Tweezertrodes, 7 mm, platinum</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450488</td><td></td></tr></tbody></table>

in utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons

Estudo in vitro de culturas primárias neuronais permite análises quantitativas de crescimento de neuritos. A fim de estudar como as alterações genéticas afetam conseqüência processo neuronal, ou construções shRNA cDNA pode ser introduzida em neurônios primários via transfecção química ou transdução viral. No entanto, com células corticais primárias, uma piscina heterogêneo de tipos de células (neurônios glutamatérgicos de diferentes camadas, os neurônios inibitórios, células da glia) são transfectadas com estes métodos. O uso da eletroporação no utero para introduzir DNA construções no córtex roedores embrionárias permite a determinados subconjuntos de células a ser alvo: enquanto eletroporação dos primeiros alvos do córtex embrionário camadas profundas do córtex, eletroporação na tarde timepoints embrionárias alvos camadas mais superficiais. Além disso, a colocação de eletrodos diferenciais entre as cabeças dos resultados individuais de embriões na segmentação de regiões dorsal-medial ventral contra-lateral do córtex. Após a eletroporação, as células transfectadas podem ser dissecados, dissociados, e banhado in vitro para a análise quantitativa do crescimento de neuritos. Aqui, nós fornecemos um método passo-a-passo para medir quantitativamente conseqüência processo neuronal em subconjuntos de células corticais. O protocolo básico para eletroporação no útero tem sido descrito em detalhes em dois artigos JOVE outros do laboratório Kriegstein 1, 2. Nós iremos fornecer uma visão geral do nosso protocolo para a utero eletroporação, focando os detalhes mais importantes, seguido por uma descrição do nosso protocolo que se aplica em eletroporação utero ao estudo da função do gene em conseqüência processo neuronal.

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In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

Na eletroporação utero é um método valioso para transfecting células progenitoras neuronal in vivo. Dependendo da colocação dos eletrodos e do ponto no tempo de desenvolvimento de eletroporação, certos subgrupos de células corticais podem ser alvo. Células-alvo podem então ser analisados ​​in vivo ou in vitro para efeitos da alteração genética.

No útero Eletroporação seguido por Cultura Neuronal primário para estudar a função do gene no subconjunto dos neurônios corticais

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

in-utero-electroporation-followed-primary-neuronal-culture-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

17.7K visualizações.  Brigham and Woman's Hospital and Harvard Medical School. Na eletroporação utero é um método valioso para transfecting células progenitoras neuronal in vivo. Dependendo da colocação dos eletrodos e do ponto no tempo de desenvolvimento de eletroporação, certos subgrupos de células corticais podem ser alvo. Células-alvo podem então ser analisados ​​in vivo ou in vitro para efeitos da alteração genética.

Vídeo: In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors lining the walls of the lateral ventricle. This technique is now widely used to study the processes involved in corticogenesis by over-expressing or knocking down genes and observing the effects on cellular proliferation, migration, and differentiation. In comparison to traditional knockout strategies, in-utero electroporation provides a rapid means to manipulate a population of cells during a specific temporal window. In this video protocol we outline the experimental methodology for preparing mice for surgery, exposing the uterine horns through laporatomy, injecting DNA into the lateral ventricles of the developing embryo, electroporating DNA into the progenitors lining the lateral wall, and caring for animals post-surgery. Our laboratory uses this protocol for surgeries on E13-E16 mice, however, it is most commonly performed at E15, as shown in this video. 

In Utero injeção intraventricular e eletroporação de embriões de camundongos E15

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

Biologia

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection e Cultura Primária de Neurônios do hipocampo do rato embrionárias e Cortical

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Neurociência

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

Entrega Gene eficiente em múltiplos territórios CNS Usando In Utero Eletroporação

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

Métodos de Estudo da morfogênese neuronal:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Eletroporação RNAi no Cortex Cerebral Murina embrionárias

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and associated extracellular matrix. Because they provide a suitable organotypic environment, cortical slice explants are often used to investigate those interactions that control neuronal differentiation and development. Although beneficial, the slice explant model can suffer from drawbacks including aberrant cellular lamination and migration. Here we report a whole cerebral hemisphere explant system for studies of early cortical development that is easier to prepare than cortical slices and shows consistent organotypic migration and lamination. In this model system, early lamination and migration patterns proceed normally for a period of two days in vitro, including the period of preplate splitting, during which prospective cortical layer six forms. We then developed an ex utero electroporation (EUEP) approach that achieves ~80% success in targeting GFP expression to neurons developing in the dorsal medial cortex.
The whole hemisphere explant model makes early cortical development accessible for electroporation, pharmacological intervention and live imaging approaches. This method avoids the survival surgery required of in utero electroporation (IUEP) approaches while improving both transfection and areal targeting consistency. This method will facilitate experimental studies of neuronal proliferation, migration and differentiation.

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

This protocol describes an improved explant procedure that involves ex utero electroporation, dissection and culture of entire cerebral hemispheres from the embryonic mouse. The preparation facilitates pharmacological studies and assays of gene function during early cortical development.

Ex utero Eletroporação e Explantes hemisfério inteiro: um método simples Experimental de Estudos do Desenvolvimento Cortical Precoce

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

In Utero Eletroporação Abordagens para estudar a excitabilidade neuronal subpopulações e Conectividade uma única célula

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Nocaute do gene CRISPR/Cas9 em organoides corticais humanos fatiados via eletroporação

Electroporation of Sliced Human Cortical Organoids for Studies of Gene Function

Human cortical organoids have become important tools for studying human brain development, neurodevelopmental disorders, and human brain evolution. Studies analyzing gene function by overexpression or knockout have been instrumental in animal models to provide mechanistic insights into the regulation of neocortex development. Here, we present a detailed protocol for CRISPR/Cas9-mediated acute gene knockout by electroporation of sliced human cortical organoids. The slicing of cortical organoids aids the identification of ventricle-like structures for injection and subsequent electroporation, making this a particularly well-suited model for acute genetic manipulation during human cortical development. We describe the design of guide RNAs and the validation of targeting efficiency in vitro and in cortical organoids. Electroporation of cortical organoids is performed at mid-neurogenic stages, enabling the targeting of most major cell classes in the developing neocortex, including apical radial glia, basal progenitor cells, and neurons. Taken together, the electroporation of sliced human cortical organoids represents a powerful technique to investigate gene function, gene regulation, and cell morphology during cortical development.

<meta charset="utf8"></head><body>Eletroporação de organoides corticais humanos fatiados para estudos da função gênica

Here, we present the acute genetic manipulation of sliced human cortical organoids by electroporation. These cortical organoid models are particularly amenable to injection as ventricle-like structures can be readily identified after slicing, enabling the functional investigation of human cortical development, neurodevelopmental disorders, and cortical evolution.

Eletroporação de organoides corticais humanos fatiados para estudos da função gênica

Human cortical organoids have become important tools for studying human brain development, neurodevelopmental disorders, and human brain evolution. ...

No útero Eletroporação seguido por Cultura Neuronal primário para estudar a função do gene no subconjunto dos neurônios corticais

Resumo

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In Utero injeção intraventricular e eletroporação de embriões de camundongos E15

Nucleofection e Cultura Primária de Neurônios do hipocampo do rato embrionárias e Cortical

Entrega Gene eficiente em múltiplos territórios CNS Usando In Utero Eletroporação

Mouse No Utero Eletroporação: Transfecção Gênica Controlled Spatiotemporal

Métodos de Estudo da morfogênese neuronal:

Ex utero Eletroporação e Explantes hemisfério inteiro: um método simples Experimental de Estudos do Desenvolvimento Cortical Precoce

In Utero Eletroporação Abordagens para estudar a excitabilidade neuronal subpopulações e Conectividade uma única célula

Eletroporação de organoides corticais humanos fatiados para estudos da função gênica

Eletroporação de organoides corticais humanos fatiados para estudos da função gênica

Eletroporação de organoides corticais humanos fatiados para estudos da função gênica