Todos os procedimentos foram aprovados pela Universidade de Wisconsin Comissão do Animal Care e estavam em acordo com as diretrizes do NIH. Agradecemos ao Dr. Katherine Kalil para o uso generoso do seu dispositivo Nucleofector. Agradecemos também aos membros do laboratório de Dent para comentários sobre o protocolo. Este trabalho foi suportado por concessões do NIH R01-NS064014, Dana Foundation e Fundação para Whitehall EWD Christopher Viesselmann, Jason Ballweg e Derek Lumbard contribuíram igualmente para este papel.

1. Preparação de Lamelas e Câmaras <ol><li> Preparação de lamelas limpo e câmaras é essencial para culturas saudáveis. Atalhos não deve ser tomado em qualquer uma dessas etapas. </li><li> Lavar as lamelas (redondo 12mm ou 22mm, de vidro alemão - Carolina Marca Assistant) durante a noite em ácido nítrico concentrado (HNO3) em uma jarra de vidro dedicado ou copo. </li><li> Retirar as lamelas de ácido nítrico e lavar extensivamente (5-7x) em água deionizada. </li><li> Separar as lamelas e seco em uma capela de fluxo laminar ou gabinete de biossegurança. Quando seca, esterilizá-las com a luz UV por 30 minutos. Lugar lamínulas esterilizadas em pratos de Petri estéreis para armazenamento. Se os neurônios plaqueamento em lamínulas 12 milímetros diretamente lamínulas lugar em um prato estéreis de 35 mm e prossiga para a Secção 2. </li><li> Câmaras de imagens são construídos por perfuração de um furo 15mm no fundo de pratos de Petri 35 milímetros (remover todas as rebarbas) e anexar as lamelas limpos com uma mistura 3:1 de parafina e vaselina. </li><li> Derreta a parafina / mistura de geléia de petróleo em um tubo cônico dentro de um banho de água fervente. Use um pincel pequeno e revestimento de baixo do prato ao redor do buraco 15mm. Certifique-se manter a parafina agitação / mistura de geléia de petróleo, uma vez que irá separar. Isso geralmente resulta em câmaras coladas com uma maior concentração de vaselina, que se tornará viscoso quando os pratos são colocados na incubadora, resultando em descolamento lamela. A parafina restante / vaselina pode ser armazenado em temperatura ambiente. </li><li> Coloque o prato de cabeça para baixo em uma bandeja plana e coloque a lamínula sobre o buraco. Calor em 80 ° C forno até que a mistura de parafina é derretida (~ 10 minutos). Retire os pratos em uma superfície plana e deixe o jogo mistura de parafina. </li><li> Vire os pratos mais e esterilizar tanto o interior das tampas e os fundos de câmaras com luz UV. </li><li> Lamínulas casaco ou regiões copo de câmaras com 1.0mg/mL Poly-d-lisina (30kDa) em borato tampão (0,1 M de borato de sódio, pH 8,5) por uma hora. Enxágüe 3-5 vezes com grandes quantidades de água grau cultura de tecido deionizada. Certifique-se de remover todos os vestígios de tampão borato. Seco e use imediatamente ou armazenar câmaras / lamínulas para uso posterior. Nós usamos geralmente lamínulas limpo dentro de um mês de preparação. </li></ol> 2. Preparação de Dissection Neuronal e meio de cultura <ol><li> Prepare o suporte de dissecção (DM) pela adição de quantidades adequadas de HBSS 10x e HEPES 100X para o tecido de água grau cultura. Armazenar a 4 ° C. Manter em gelo durante a dissecção. </li><li> O dia antes da dissecção preparar o meio de revestimento (PM) e sem soro médio (SFM). PM é composto por Medium Neurobasal, B27 suplemento, 2 mM de glutamina, glicose 0,3%, 37,5 mM NaCl e 5% de soro fetal bovino (FBS). SFM é composto por Medium Neurobasal, B27 suplemento, 2 mM de glutamina, glicose 0,3% e 37,5 mM NaCl. </li><li> Faça apenas o suficiente para a dissecção e armazenar em um cultura de tecidos incubadora durante a noite com a tampa entreaberta para que a temperatura eo teor de CO 2 da equilibra médio. Nós adicionamos glicose extra e aumentar a osmolalidade de aproximadamente 310mOsm com NaCl. Encontramos as culturas fazer melhor em uma osmolaridade mais fisiológica (osmolalidade Neurobasal é tipicamente 205-245mOsm). </li></ol> 3. Preparação da camada cortical Glial Alimentador de longo prazo Culturas <ol><li> Se a longo prazo são culturas que estar preparado, realizar esta parte do protocolo de duas a três semanas antes de continuar com as dissecações cortical ou do hipocampo. </li><li> Prepare médio glial (GM) com MEM, a glicose 0,3%, penicilina / estreptomicina e soro de cavalo de 10%. </li><li> Euthanize filhotes P1-P3 do mouse pelo resfriamento em gelo por 5 minutos. Retire cada filhote do gelo e spray com etanol 70%. Rapidamente decapitar com uma tesoura. Remova todo o cérebro a um prato contendo frio DM (passo 2.1). </li><li> Remova os dois hemisférios cerebrais e das meninges. Neocórtex o consumo e remover para um novo prato que não contém mídia. Prepare córtices de 4 cérebros total. </li><li> Picar os córtices com uma lâmina de barbear limpa, estéril mais fino possível e remover o tecido cortado com uma pipeta de plástico para um tubo cônico de 50 mL contendo 12 mL de frio DM. Adicionar tripsina e DNase para concentrações finais de 0,25% (1,5 mL) e 0,1% (1,5 mL), respectivamente. Incubar em banho-maria a 37 ° C por 10 minutos, sob agitação intermitente. </li><li> Remova o tubo que contém o tecido cortical e limpar cuidadosamente com etanol 70% antes de trazer para a capa de cultura de tecidos. Tecido cortical pipeta cima e para baixo com uma pipeta de 10 mL aproximadamente 10-15 vezes, ou até mais pedaços desaparecem. </li><li> Retornar o tubo a 37 ° C em banho-maria por mais 10 minutos, sob agitação intermitente. </li><li> Limpe cuidadosamente o tubo com etanol 70% e trazê-lo de volta para a capa de cultura de tecidos. Pipeta o tecido cortical cima e para baixo com um m 5L pipeta cerca de 10-15 vezes, ou até que os pedaços desaparecem. </li><li> Adicionar 15 mL de GM quente e centrifugar a 200xg (1000rpm) por 10 minutos. </li><li> Elimine o sobrenadante, ressuspender as células peletizada em 20 mL de GM fresco e contar com um hemocitômetro. Placa 5 7.5x10 6 células em 15 mL de GM por 75 centímetros balão 2. </li><li> Depois de um dia e cada 2-3 dias subseqüentes na cultura, desalojar células soltas batendo o frasco contra a sua mão. Remova a mídia, juntamente com as células desalojadas e substituir com 15 mL de GM fresco. </li><li> Glia pode ser colhida após 1-2 semanas de crescimento nos frascos, quando eles estão prestes 70-100% confluentes. Para preparar lamínulas individuais revestidos com glia, lugar de ácido nítrico 6 limpos e esterilizados 25 milímetros lamínulas redondas em um prato de 10cm, e coloque 3 pontos da mistura 3:1 de parafina / vaselina em cada lamela em um padrão triangular com um pequeno pincel . Tratar pratos aberto com luz UV por 30 minutos. Brasão as lamelas com 0,1 mg / mL Poly-d-lisina (30kDa) em tampão borato de uma hora, depois lave bastante (3-5x) com água estéril grau de cultura de tecidos deionizada e deixar secar. </li><li> Retirar o balão da glia, contendo a partir de incubadora, descartar a médio e enxágüe com 5 mL de pré-aquecido tripsina / EDTA. Remover a solução de tripsina / EDTA do frasco e pipeta de 3 mL de frescos pré-aquecido tripsina / EDTA para o balão. Incubar o balão durante 1 minuto a 37 ° C antes de adicionar 5 mL de GM para parar o tripsinização. </li><li> Remova o frasco da glia por repetidas pipetagens 10-15 vezes, e depois transferir os meios de comunicação a um tubo de 15 mL cônico. Centrifugar a 200xg (1000rpm) por 8 minutos. Remover o sobrenadante e adicionar 10 mL de GM, contagem de células, e placa de 5x10 5 células em 12,5 mL de GM por 10 centímetros prato contendo as lamelas. </li><li> Troca o meio com frescos pré-aquecido GM a cada 2-3 dias. O dia antes da dissecção neurônio, remova a GM e substituir com SFM (seção 2.2). Utilize este SFM glial-condicionado no passo 4,12 quando a inundação culturas corticais ou hipocampais. </li></ol> 4. Dissecação cortical e / ou hipocampo e Eletroporação <ol><li> Remover quantidades apropriadas de soluções nucleofection (Lonza), combinar e à temperatura ambiente antes de iniciar a dissecação. Como a solução Nucleofection tem uma duração limitada quando combinado, só combinar a quantidade necessária para cada preparação (100 mL por transfecção). </li><li> Euthanize um rato grávidas em E15.5 com CO 2 (dia de plug é E0.5) e remover o útero de uma placa de Petri de 10 cm. Remover fetos e decapitar em frio DM (seção 2.1). </li><li> Remova todo o cérebro em um prato separado de DM frio e com uma agulha de tungstênio dobrado, remova os dois neocórtices. Remove as meninges com micropinças e córtices lugar em novo prato da DM frio. Com uma tesoura pequena íris ou Wecker, remova o córtex ou hipocampo e coloque em um tubo de 1,5 mL cheio Eppendorf com 1,0 mL de frio DM. Manter este tubo em gelo. </li><li> Depois de dissecar todos os córtices ou hipocampo, adicione 110 mL de tripsina 2,5% para o tubo Eppendorf contendo o tubo de tecido e coloque em uma incubadora de 37 ° C por 20 minutos. </li><li> Remover o sobrenadante e lavar córtices ou hipocampo com 1,0 mL PM (seção 2.2) invertendo suavemente o tubo Eppendorf. Repetir a lavagem duas vezes, deixando 1 mL da PM no tubo. </li><li> Triturar os pedaços 15 vezes com uma pipeta P1000, e remover as células sobrenadante / para um novo tubo de 15 mL cônico contendo 4 mL de PM, deixando qualquer pedaços que permanecem no tubo de Eppendorf. </li><li> Girar o tubo de 15 ml em 20xg (350 rpm) por 7 minutos com o freio. Desprezar o sobrenadante e adicionar 100 mL de pré-misturado, a solução nucleofection temperatura ambiente (Lonza) para cada transfecção. Triturar 5 vezes com um movimento suave para cima e para baixo da pipeta P1000. </li><li> Remover 100 mL da solução de mistura nucleofection / célula a cada tubo Eppendorf novo e adicionar a quantidade adequada de DNA. Por muito tempo as culturas termo geralmente usamos 1-2μg de DNA por transfecção. No entanto, este etiquetas apenas uma pequena proporção &lt;10% dos neurônios na cultura. Geralmente usamos 5-10μg de DNA por transfecção se querem maior eficiência de transfecção para a cultura de curto prazo. Temos utilizado até um total de 40μg de DNA, quando transfecting com dois plasmídeos diferentes. Plasmídeos são armazenadas em tampão TE a 1μg / mL. </li><li> Adicionar suspensão de células / DNA para a cubeta (Lonza) e electroporate as células do Nucleofector (Lonza), usando o programa O-005 (neurônios do SNC Mouse). </li><li> Trabalhando rapidamente, adicionar 500 mL da PM pré-aquecido e equilibrado para a cuvete e remoção da solução / células para um novo tubo de 1,5 mL Eppendorf. Adicionar PM suficiente para trazer o volume de cada transfecção a 1,0 mL. Contar as células com um hemocitômetro e placa em 3-5x10 3 células / cm 2 para as culturas jovens, ou 5-10x10 3 células / cm 2 para o longo prazo culturas. &lt;/ Li&gt; <li> De curto prazo culturas, inundar a placas de cultura de 35mm com 2,0 mL de aquecido, CO 2-SFM equilibrada após uma hora de galvanização. Se estiver usando lamínulas, nós removemos a metade da PM e substituí-lo com SFM, em seguida, repita mais duas vezes. Nem as câmaras cheias de imagens ou lavar os resultados lamínulas em um teor muito baixo de soro (&lt;0,5%). Curto prazo culturas não precisa ser cultivada com uma camada de alimentação glial e não precisam ser re-alimentados. </li><li> A longo prazo culturas, nós removemos uma lamela glia coberto com três pontos de parafina / vaselina e invertê-lo em cima do buraco 15 milímetros no prato de 35 mm, uma hora após o início do cultivo. Dois mililitros do SFM condicionado do prato glial é então adicionado à câmara de imagem. Para alimentar as culturas de longo prazo, nós removemos um terço do SFM cada 2-3 dias e substituí-lo com frescos, pré-aquecido e CO 2-SFM equilibrada. </li></ol> 5. Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2373/2373fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Viva os neurônios do hipocampo em fases sucessivas de desenvolvimento. Emparelhados imagens de representante vivo neurônios do hipocampo são mostrados como tanto uma imagem de contraste de interferência diferencial e uma micrografia correspondente fluorescente. Cada uma dessas células tem sido transfectadas com EGFP-tubulina e DsRed2 em vetores pCAX. Os neurônios foram fotografadas no dia seguinte in vitro (DIV): Fase 1 (1DIV), Stage 2 (1DIV), Fase 3 (2DIV), Fase 4 (11DIV) e Stage 5 (32DIV). Barra de escala é 20Hm.

<ol>
	<li>Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G., Goslin, K., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13.">Chapter 13.</a> Culturing Nerve Cells. , 339-370 (1998).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+and+movement+of+microtubules+in+axonal+growth+cones+and+developing+interstitial+branches.">Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches.</a> J Neurosci. 19, 8894-8908 (1999).</li><li>Dent, E. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+neuronal+cytoskeleton.">Dynamic imaging of neuronal cytoskeleton.</a> Methods Enzymol. 361, 390-407 (2003).</li><li>Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+are+required+for+cortical+neurite+initiation.">Filopodia are required for cortical neurite initiation.</a> Nat Cell Biol. 9, 1347-1359 (2007).</li><li>Hu, X., Viesselmann, C., Nam, S., Merriam, E., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dynamic+microtubule+invasion+of+dendritic+spines.">Activity-dependent dynamic microtubule invasion of dendritic spines.</a> J Neurosci. 28, 13094-13105 (2008).</li><li>Lebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+of+Ena/VASP+proteins+for+filopodia+formation+in+neurons+and+in+function+downstream+of+netrin-1.">Critical role of Ena/VASP proteins for filopodia formation in neurons and in function downstream of netrin-1.</a> Neuron. 42, 37-49 (2004).</li><li>Meberg, P. J., Miller, M. W., Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7.">Chapter 7.</a> Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , 112-129 (2003).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li><li>Zeitelhofer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transfection+of+mammalian+neurons+via+nucleofection.">High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection.</a> Nat Protoc. 2, 1692-1704 (2007).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este protocolo para cultivo embrionário neurônios do hipocampo do rato e cortical foi desenvolvido como uma modificação do protocolo de Banker, que usa 1,2 neurônios de rato. Nós temos usado esse protocolo para mouse cultura e neurônios hamster bem 3,4,5,6,7. Este protocolo funciona igualmente bem para ambos os neurônios do hipocampo e neocortical e é semelhante a um protocolo publicado pela Meberg e Miller 8. Geralmente, nós usamos os neurônios do hipocampo para o longo prazo de cultura, porque eles estão bem caracterizadas e um sistema modelo mais estabelecida. Além disso, são susceptíveis de conter uma população mais homogênea de neurônios do neocórtex. No entanto, os neurônios neocorticais cultivadas usando este protocolo também sobrevivem e se diferenciam de forma semelhante (dados não publicados). Nós usam rotineiramente os neurônios do hipocampo e neocortical para a cultura de curto prazo. Dissecção do neocórtex também resulta em neurônios substancialmente mais (1.5x10 6 neurônios por par de córtices) do que a dissecação do hipocampo (2.5x10 5 neurônios por par de hipocampo), o que torna uma melhor escolha do material para secar Ocidental, por exemplo. Como acontece com qualquer cultura primária, é essencial para minimizar o tempo que leva desde a morte do animal para o revestimento das células. Ele geralmente leva 10-20 dissecções para se tornar consistentemente rápido em dissecção e revestimento. Além disso, ao trabalhar com o Nucleofector Lonza, é fundamental para trabalhar com rapidez durante o processo de eletroporação, como a viabilidade dos neurônios diminui rapidamente se forem deixados no buffer nucleofection. Grande parte da nossa imagem é realizado com microscopia de fluorescência interna reflectância total (TIRFM). Este tipo de microscopia só é capaz de imagem várias centenas de nanômetros além da lamela. Portanto, as áreas dos neurônios que freqüentemente imagem, o cone de crescimento axonal e espinhas dendríticas, devem ser respeitados diretamente para a lamela. Assim, usamos as culturas de baixa densidade que exigem alimentação glial de longo prazo de cultura. Temos usado as culturas de maior densidade (&gt; 2x10 4 células / cm 2), sem camadas de alimentação glial, a longo prazo culturas e descobriram que eles sobrevivem muito bem com a alimentação pouco. No entanto, as espinhas dendríticas desses neurônios são muitas vezes muito longe do substrato para a imagem em TIRFM, embora possam ser facilmente detectados com ampla microscopia de campo ou microscopia confocal. Na maioria dos nossos estudos, transfectar neurônios antes do plaqueamento, e ter imaginado proteínas fluorescentes marcado por até três meses em cultura. Esta expressão de longo prazo de proteínas fluorescentes marcado nos dá confiança de que, ao utilizar baixas concentrações de DNA (1-2μg) que não estão produzindo artefatos superexpressão nos neurônios. No entanto, este procedimento também pode ser usado para estudar a superexpressão de proteínas se grandes quantidades de DNA são utilizadas (10-20μg). Os plasmídeos que usamos para transfecção neurônios geralmente contêm proteínas de fusão EGFP ou mCherry, embora também rótulo do citoplasma neuronal com DsRed2 ou EGFP sozinho. Esta técnica funciona bem eletroporação com um número de vetores. Nós preferimos plasmídeos que contêm um promotor de β-actina com um enhancer CMV e β-globina cauda poli-A (pCAGGs ou pCAX plasmídeos) 9, devido aos níveis relativamente altos de expressão, eo fato de que eles são bem tolerados pelos neurônios tanto na cultura de curto e longo prazo. Geralmente, as proteínas começam a se expressar dentro de cerca de 4 horas de revestimento e alcançar níveis suficientes para a imagem latente dentro de 10-24hs 10. Temos utilizado com sucesso CMV-promotor-driven plasmídeos em curto prazo culturas, mas descobriram que eles podem causar altos níveis de superexpressão que matam neurônios em longo prazo de cultura. No entanto, temos verificado que o condicionamento glial de culturas de baixa densidade ajuda na sobrevivência de neurônios transfectadas com CMV-promotor plasmídeos impulsionado, em comparação com maior densidade (não-glial alimentados) culturas.

* A maioria dos reagentes que nós armazenamos a -80 ° C podem ser armazenadas a -20 ° C também. Armazenando-os a -80 ° C aumenta sua vida útil e os resultados em culturas pouco mais consistente.

nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons

Neurônios do hipocampo e cortical tem sido amplamente utilizado para o estudo do sistema nervoso central (SNC) de polarização neuronal, axônio / dendrite conseqüência, e formação de sinapses e função. Uma vantagem do cultivo desses neurônios é que eles prontamente polarizar, formando axônios e dendritos distintivo, sobre um substrato bidimensional em densidades muito baixas. Esta propriedade tornou-os extremamente útil para determinar muitos aspectos do desenvolvimento neuronal. Além disso, através do fornecimento condicionado glial para estes neurônios que continuará a desenvolver, formando conexões sinápticas funcionais e sobreviver por vários meses em cultura. Neste protocolo, esboçamos uma técnica para dissecar, cultura e transfectar neurônios do hipocampo e embrionárias de camundongos cortical. Transfecção é realizado por electroporating DNA nos neurônios antes do plaqueamento via nucleofection. Este protocolo tem a vantagem de expressar proteínas de fusão fluorescente-tag no início do desenvolvimento (~ 4-8hrs após o plaqueamento) para estudar a dinâmica e função de proteínas durante a polarização conseqüência axônio, e de ramificação. Também descobrimos que este transfecção único antes do plaqueamento mantém a expressão da proteína fluorescente-tag de fusão em níveis adequados para a imagem latente durante toda a vida do neurônio (&gt; 2 meses em cultura). Assim, esta metodologia é útil para estudar a localização de proteínas e função ao longo do desenvolvimento do SNC, com pouca ou nenhuma perturbação da função neuronal.

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Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Este protocolo descreve os passos necessários para dissecar, transfectar via de eletroporação e neurônios do hipocampo e da cultura do mouse cortical. Curto prazo, as culturas podem ser utilizados para estudos sobre crescimento do axônio e orientação, enquanto culturas a longo prazo podem ser usados ​​para estudos de sinaptogênese e análise espinha dendrítica.

Nucleofection e Cultura Primária de Neurônios do hipocampo do rato embrionárias e Cortical

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

nucleofection-primary-culture-embryonic-mouse-hippocampal-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

33.3K visualizações.  University of Wisconsin-Madison. Este protocolo descreve os passos necessários para dissecar, transfectar via de eletroporação e neurônios do hipocampo e da cultura do mouse cortical. Curto prazo, as culturas podem ser utilizados para estudos sobre crescimento do axônio e orientação, enquanto culturas a longo prazo podem ser usados ​​para estudos de sinaptogênese e análise espinha dendrítica.

Vídeo: Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Neurociência

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

No útero Eletroporação seguido por Cultura Neuronal primário para estudar a função do gene no subconjunto dos neurônios corticais

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. Neuroepithelial cells of the neural tube that express Nkx6.1 are the unique precursor cells for spinal motoneurons1. Though postmitotic motoneurons move towards their final position and organize themselves into columns along the spinal tract2,3. More than 90% of all these differentiated and positioned motoneurons express the transcription factors Islet 1/2. They innervate the muscles of the limbs as well as those of the body and the inner organs. Among others, motoneurons typically express the high affinity receptors for brain derived neurotrophic factor (BDNF) and Neurotrophin-3 (NT-3), the tropomyosin-related kinase B and C (TrkB, TrkC). They do not express the tropomyosin-related kinase A (TrkA)4. Beside the two high affinity receptors, motoneurons do express the low affinity neurotrophin receptor p75NTR. The p75NTR can bind all neurotrophins with similar but lower affinity to all neurotrophins than the high affinity receptors would bind the mature neurotrophins. Within the embryonic spinal cord, the p75NTR is exclusively expressed by the spinal motoneurons5. This has been used to develop motoneuron isolation techniques to purify the cells from the vast majority of surrounding cells6. Isolating motoneurons with the help of specific antibodies (panning) against the extracellular domains of p75NTR has turned out to be an expensive method as the amount of antibody used for a single experiment is high due to the size of the plate used for panning. A much more economical alternative is the use of lectin. Lectin has been shown to specifically bind to p75NTR as well7. The following method describes an alternative technique using wheat germ agglutinin for a preplating procedure instead of the p75NTR antibody. The lectin is an extremely inexpensive alternative to the p75NTR antibody and the purification grades using lectin are comparable to that of the p75NTR antibody. Motoneurons from the embryonic spinal cord can be isolated by this method, survive and grow out neurites.

An alternative way of isolating mouse embryonic motoneurons from the spinal cord is described. The method takes into account the fact that lectin can bind to the low affinity nerve growth factor receptor p75NTR. This lectin-based preplating allows a purification similar to that with a specific antibody against the p75NTR.

Lectina baseado em isolamento e cultura de motoneurônios embrionárias de rato

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Bilaminar Co-cultura de neurônios de rato Primária Cortical e Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Isolamento e Cultura de neurônios do hipocampo de ratos pré-natal

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

Isolamento e Cultura de astrócitos corticais de rato

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Fosfato de cálcio transfecção de primário neurônios do hipocampo

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Cultura primária de neurônios dopaminérgicos mouse

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Isolamento, cultura e Long-Term Manutenção da Primária mesencefálico Dopaminergic neurônios dos cérebros de roedores Embryonic

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

Low-Density hipocampo Cultura Neuron primária

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...