Este trabalho foi financiado pelo NIH R21 DC03969-01 (para JGB). Agradecemos ao Dr. Fritz Lischka para capturar células sabor único botão, Dr. Tauf Huque para a realização do RT-PCR mostrado na Figura 4B e D. Sr. Bayley e S. Ms. Alarcon para assistência técnica. M. Yanina Pepino é um companheiro apoiado por uma DA07313 NIDAT32 Washington University School of Medicine, St. Louis, MO (Cottler, LB PI).

1. Introdução e Considerações Gerais O procedimento geral envolve anestesia local de uma área (1 cm 2) pequena da superfície dorsal da língua anterior, seguida da remoção de um número (6-8) de fungiformes (gosto) papilas dessa área anestesiados com uma curva da mola micro -tesoura (McPherson-Vannas tipo # SR 5603, Roboz, Rockville, MD). A retirada fungiformes papilas são de aproximadamente 0,25 mm 3 cada. Há muito pouco não papilas de tecido (gosto) epitelial removida juntamente com cada papila. Forma papilas novo nesta área após 3-5 semanas e recuperar o funcionamento papilas gustativas (Spielman e Brand, observações não publicadas). Não há efeito perceptível no sabor ou sabor dos alimentos após a remoção desta pequena quantidade de material gosto. A partir de estudos que têm contado cada paladar na língua humano adulto, pode-se estimar que a língua humana contém aproximadamente 5.000 papilas gustativas. Nosso procedimento remove a maioria de 20 a 25 deste papilas gustativas (em média, ~ 3,5-4 papilas gustativas fungiformes por papila em humanos) 2, ou cerca de 0,4% do total. Além disso não há nenhuma dor associada com a perda cirúrgica do tecido. Sente-se, é claro, dor leve no local da injeção única, como a agulha entra na língua. Após a anestesia desgastou fora, há um desconforto leve, ocasionalmente, há menos de um dia, mas este desconforto é muito menos do que aquilo que se experimenta depois de acidentalmente &quot;morder&quot; língua queridos. Ao longo dos últimos anos temos desenvolvido um procedimento alternativo que não inclui anestesia. A técnica para a remoção do tecido é idêntico para ambos. A única diferença no processo é que o cirurgião não está mais confinado a uma área de 1 cm de diâmetro 2, onde a anestesia foi abordada. Vez que ele / ela pode escolher qualquer local na superfície dorsal da língua, onde papilas proeminentes aparecer. O número total de papilas removidos são limitados a 6-8 em ambas as técnicas, com ou sem anestesia Se realizada corretamente, o desconforto da remoção de 6-8 papilas fungiformes gosto é considerado um problema menor quando comparada com a dor associada com a administração de A anestesia local levantamento geral dos indivíduos que foram submetidos a ambos os procedimentos, isto é, com e sem anestesia, mostraram que uma esmagadora maioria de assuntos dispensaria sem anestesia local em todas as biópsias futuro. O cirurgião que desenvolveu esta técnica (AIS) e vários colegas ensinado pelo autor que realizou biópsias sem anestesia, testei-o em si mesmos e testemunhar que o desconforto é temporário e é considerado menor do que a língua é uma mordida. Por fim, dezenas de pessoas que concordaram em ser biopsiadas foram perguntados se estariam dispostos a tentar a remoção de uma papila sem anestesia e, se julgar que ela é muito doloroso a ser realizada a anestesia, concordaram em continuar com a remoção das papilas sem anestesia. A biópsia todo não deve demorar mais do que 5-10 minutos. Se a anestesia é empregada mais 2-3 minutos é adicionado. Biópsia é normalmente realizado nas primeiras horas da manhã. Antes da biópsia, os voluntários são instruídos a comer uma refeição leve duas horas antes da hora de início agendada. Na biópsia, consentimento informado é obtido. Os critérios de exclusão no momento da biópsia incluem aqueles com doenças crônicas graves, se controlada por medicação ou não (por exemplo, todas as doenças gastrointestinais, doenças neurodegenerativas, câncer, discrasias sangüíneas, alergia aos anestésicos locais, etc) aqueles com freqüência cardíaca acima de 100 ou menos de 60; pressão arterial sistólica maior que 145 ou menos de 100, pressão arterial diastólica superior a 90 ou inferior a 60, eo parecer do cirurgião que o sujeito pode participar do estudo. Finalmente, é importante considerar que o procedimento de biópsia deve ser realizada no mesmo local onde o tecido será processado para exame desde integridade do tecido é rapidamente perdido como temos freqüentemente observado pelo declínio da qualidade de mRNA. Para minimizar estes problemas o tecido língua deve ser processada o mais rápido possível. 2. Preparação assunto <ol><li> O assunto está sentado em uma cadeira de dentista ou um assento com encosto de cabeça. </li><li> Verificação da freqüência cardíaca e pressão arterial no momento da biópsia. Caso a queda assunto fora da faixa de pressão arterial, freqüência cardíaca ou competência oral, o cirurgião recomenda ao assunto que ele / ela fazer nomeação imediata de ver um médico. </li><li> Inspecionar a cavidade bucal para a saúde dos tecidos em geral, com atenção aos indicadores de xerostomia, língua geográfica ou quaisquer lesões na língua. Qualquer assunto mostrando sinais de doença oral, incluindo lesões na língua ou xerostomia estão excluídos do estudo. Instruir o assunto para enxaguar a boca com água para remover todos os detritos do Cavit oraisy. Se necessário, a língua é limpo com um scrapper língua descartável para remover a placa bacteriana ou detritos, o que poderia ser feita para a língua durante a injeção da anestesia. O cirurgião utiliza compressas de gaze estéril em uma mão enluvada para manter a ¼ anterior da língua, uma vez que se estende desde a cavidade oral. </li><li> Se a anestesia for utilizada, uma seringa de tuberculina 1cc com um calibre 28 x ½ agulha &#39;contendo 0,25 mL de lidocaína (2%) com adrenalina (1:100.000) é injectada lentamente em um site logo abaixo da superfície dorsal da porção anterior da língua . O site de anestesia é distal ao local de coleta para evitar a interferência da lidocaína com estudos posteriores. Para efeito de comparação, a quantidade de lidocaína injetada (0,25 mL) é de cerca de um quarto do valor normalmente dada para o bloqueio do nervo em procedimentos odontológicos (0,8 mL a 1 mL). Após a inserção da agulha, mas antes da injeção do anestésico, aspiração garante que nenhum vaso sanguíneo é atingido. Essa precaução é tomada mesmo que seja anatomicamente improvável que um grande navio será atingido perto da superfície dorsal. As artérias somente na superfície dorsal, as artérias lingual dorsal são pequenos vasos sanguíneos localizados principalmente mais posterior ao terço anterior, onde a colheita ocorre de tecido. As artérias maiores lingual e as veias linguais executado na superfície ventral da língua, muito distante da região dorsal recebendo anestesia 3. A área de 1 cm anestesiados parece ser um pouco pálido em comparação com o tecido circundante. Isto é devido ao inchaço do tecido, uma vez que comprime os vasos sanguíneos pequenos. É também devido ao efeito vasoconstritor da adrenalina. Após cerca de um minuto, uma sonda é usada para testar a área de dormência. Se a área não é insensível, uma segunda injeção (0,1 a 0,2 mL) pode ser dada. </li></ol> 3. Técnica de Remoção de língua Papilas <ol><li> O trimestre anterior da língua do assunto está envolto em gaze estéril (Figura 1) e segurou na mão esquerda do cirurgião (se realizar a biópsia com a mão direita). Um canto da gaze é deixada aberta para permitir que o cirurgião para limpar a língua sem saliva. A língua deve ser realizada com firmeza, mas, é claro, não de modo a causar desconforto desnecessário. A ponta do dedo indicador da mão esquerda é colocado sob a língua diretamente sob o local onde a biópsia é realizada. Pressionando o dedo indicador para cima, a língua torna-se esticado sobre a ponta do dedo fazendo as papilas pau para fora para biópsia fácil. </li><li> Critérios para a escolha papilas para biópsia: Taste papilas são facilmente distinguíveis da envolvente filliform papilas pela sua forma e tamanho. Fungiformes papilas são redondos e um pouco isolada da envolvente. Em suas imediações há um espaço circular desprovida de filliform papilas (Figura 2A, setas azuis). Este espaço é cerca de 1 mm de diâmetro. Outra característica distintiva das papilas fungiformes é uma arborização estendida capilar visível no topo da maioria das papilas fungiformes de indivíduos jovens. Apesar de arborização torna mais fácil localizar papilas fungiformes, eles não são necessariamente bons indicadores da existência de papilas gustativas em que papila. Como uma regra começa a colheita em direção à extremidade dianteira e movimenta mais longe da ponta da língua para evitar qualquer sangramento capilar de obscurecer o site da coleção de tecidos próximos. </li><li> Uma vez que uma boa papila foi identificado, uma mola de micro-tesoura (McPherson-Vannas, curvado, de ponta afiada 5 mm, pente, largura da ponta 0,2 mm de comprimento total de 3 &quot;(RS-5603, Roboz) é usado para prendê-lo fora. Para efetivamente usar a tesoura cirúrgica micro não se deve usar a ponta da lâmina para o corte, mas sim, na medida dentro da lâmina quanto possível (Figura 1, imagem ampliada e Figura 3), perto do ponto de intersecção com a lâmina oposto. remoção da papila é conseguido com um movimento de corte da tesoura (Figura 1). Quanto mais dentro das lâminas abrir a papila alvo aparecer, o mais eficaz é o de corte. Cuidados devem ser tomados para que a posição global da tesoura deve ser paralelo com a superfície dorsal da língua. </li><li> Às vezes a língua torna-se seca como o cirurgião está tentando identificar um papilla para remoção. Depois de seco, a capacidade do operador para ver claramente que é uma papila fungiforme se torna mais desafiadora e faz deslizar das lâminas sobre a papila muito difícil. Uma língua excessivamente seco normalmente faz a vara lâmina metálica para a língua fazendo o movimento delicado cirúrgica menos controláveis. Deixar o assunto perto dele / a boca e ter saliva entrar em contato com a superfície da língua ajuda o processo. Excessivamente língua molhada não é bom. Usando o canto da gaze que se usa para manter a língua ajuda neste processo. </li><li> Qualquer sangramento capilar que ocorre é tratada por blotting com gaze estéril. Sangramento geralmente pára dentro de um min poucos<html> utes e não interfere com a colheita de tecidos adicionais. Porque as papilas estendem acima da superfície do epitélio da língua, e apenas a parte superior 3 / 4 de uma papila fungiforme é removido (Figura 2B), que parte do fungiformes mostrando papilas gustativas, pequeno sangramento é esperado. </li><li> Usando um pequeno fórceps Dumont (tipo padrão), as papilas removidos são colocados em tampão Ringer refrigerados básica (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM Na Piruvato, 20 mM HEPES-Na , pH 7,2; osmolalidade de aproximadamente 305 osmols milli) para as manipulações subsequentes. É imperativo NUNCA pitada da papila entre as lâminas de uma pinça. O tecido é muito frágil e deve ser tratada com extremo cuidado. </li><li> Após a remoção das papilas, o assunto permanece na cadeira por 10-15 minutos. Cada indivíduo é dito para não morder a língua anestesiada, mas para manter sua língua em repouso. Assuntos devem ser visualmente monitorado pelo cirurgião responsável. A anestesia é esperada a se desgastar em cerca de 30-60 minutos. Porque o site da remoção papilas podem ser ligeiramente ferida após a biópsia, eles são instruídos a estar ciente de picantes ou comida quente (temperatura), refrigerantes ou bebidas que são ou extremamente frios ou quentes. Uma outra indicação é dada aos assuntos que qualquer ligeira coloração avermelhada da saliva é normal e deixará após a dissolução do coágulo. </li><li> Assuntos são vistos 30-40 dias após a remoção das papilas para avaliação do local onde as papilas foram removidas. Por isso gosto papilas tempo deveria ter completamente regenerada. </li></ol> 5. Resultados representante Tecidos coletados podem ser usados ​​para imuno-histoquímica, RT-PCR, hibridização in situ, imagem de cálcio, de fixação de patches e cultura de tecidos. Quando realizada corretamente a aparência das papilas são saudáveis ​​procurando, branco, cerca de 0,5-1 mm de diâmetro (Figura 2B). Papilas coletados são processados ​​para imuno-histoquímica com base em protocolos já existentes e publicados 4. Um broto sabor típico de uma papila gosto paraformaldehide fixa é mostrado na Figura 4A. Papilas biópsia também pode ser tratada enzimaticamente 5 a atingir a dissociação das células de gosto. Após a dissociação enzimática, as células podem ser mantidas por até 4 horas em uma placa de Petri umedecida em 4C. Neste estado podem ser usados ​​para uma única célula de PCR (Figura 4B), Ca-imagem, etc Células mostram uma variedade de formas, muitas sendo delgados e bipolar (Figura 5A e 5B) como seria de esperar de uma célula de gosto. Ao coletar células ou executar Ca-imagem, depois de cerca de 20 minutos sob um microscópio, as células começam a se desenvolver bolhas apoptóticas (Figura 6A e 6B, setas) e muitos deles tornam-se redondas. Usando uma técnica desenvolvida em nosso laboratório, as células foram apanhados individualmente usando um patch pipeta, como mostrado na Figura 5A e 5B. Como mencionado acima, papilas começam a regredir após 5-8 semanas. Figura 7A mostra a aparência de uma língua onde 8 papilas fungiformes foram retirados do lado esquerdo da língua de um voluntário sem usar anestesia. Aviso n. º 8 ligeira manchas avermelhadas, onde as papilas foram cortou. Sem sangramento é observado após a cirurgia. A imagem atual foi tirada 10 minutos após a biópsia. Figura 7B é uma imagem da língua do mesmo assunto visto 40 dias após a biópsia. Observe todas as papilas têm crescido. Para determinar se as papilas regenerados são funcionais pedimos ao nosso voluntário para concordar com uma segunda biópsia que envolve as papilas exatamente o mesmo. Para identificar corretamente as papilas apropriado estávamos planejando re-colheita, geramos uma grade (Figura 7C) que se encaixa as papilas oito que foram removidos em primeiro lugar e sobrepostos que sobre a língua do voluntário mesmo depois de 40 dias após a biópsia inicial . Ajudado pelo contorno da língua e da distância a partir da margem para a rede, uma vez identificados, foram removidos alguns dos papilas mesma exata e processado-los para imuno-histoquímica. Figura 4A é uma dessas papilas. Observe o esboço de um broto gosto (em amarelo) ea coloração imuno para Fosfolipase Cβ2 (PLCβ2), um tipo de célula gosto 2 transdução associada enzima. Estes dados demonstram que a utilização do procedimento de biópsia, conforme descrito neste documento, as papilas fungiformes regenerar suficientemente em 40 dias para ter também no local provável papilas gustativas funcional. <img src="/files/ftp_upload/2201/2201fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. O trimestre anterior da língua do assunto está envolto em gaze estéril e na mão esquerda do cirurgião. Língua deve ser realizada com firmeza. A imagem ampliada à direita mostra a posição correta da tesoura e da posição da papila em relação à lâmina. 201/2201fig2.jpg &quot;alt =&quot; Figura 2 &quot;/&gt; Figura 2. (A) fungiformes papilas são mostradas com setas azuis. Estes são estruturas arredondadas um pouco isolado do seu entorno e nas suas imediações há um espaço circular desprovida de filliform papilas. (B) papilas fungiformes sabor na ponta da mola micro-tesoura segundos após ter sido removido. <img src="/files/ftp_upload/2201/2201fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Auto-biópsia de uma papila fungiforme usando um espelho e sem anestesia. A inserção ilustra a posição global da tesoura, que deve ser paralela com a superfície dorsal da língua. Se feito corretamente e atraumaticamente, a anestesia é perdoado por praticamente todos os voluntários. <img src="/files/ftp_upload/2201/2201fig4a.jpg" alt="Figura 4a" /> Figura 4 A. Imuno-histoquímica de um broto gosto. A papila fungiforme visualizado pela óptica Nomarski utilizando anticorpos para Fosfolipase β2 e marcados com proteína fluorescente vermelha. O esboço do broto gosto e algumas células gosto rotulados são mostrados em amarelo. <img src="/files/ftp_upload/2201/2201fig4b.jpg" alt="Figura 4b" /> B. RT-PCR de um receptor de sabor azedo candidato, ácido Sensoriamento Ion Canal 1 (ASIC1). M = marcador. Pistas de 1 a 4 foram única célula RT-PCR para ASIC1 de quatro voluntários diferentes. Após a coleta, fungiformes papilas foram enzimaticamente dissociada, as células individualmente pegou e expressão de ASIC1 foram feitas. Pistas 2 e 4 tiveram expressão normal de ASIC1. <img src="/files/ftp_upload/2201/2201fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. A. Imagem de células sabor único ser pego usando uma pipeta de patch. A grande célula epitelial é visível no canto inferior esquerdo (5A). Duas células vermelhas do sangue são também visíveis acima da pipeta de patches e atrás do corpo de vidro. A célula gosto é de aproximadamente 30-50 mícrons de comprimento e cerca de 6 mícron de largura. Para referência, um glóbulo vermelho é cerca de 7-8 mícrons de diâmetro. B. mostra uma outra célula receptora gosto cercado por quatro células epiteliais. A célula tem um aspecto nítido sabor. <img src="/files/ftp_upload/2201/2201fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Imagens A. de células que começou a desenvolver bolhas apoptóticas (fantasma como bolhas rodada anexados à célula gosto, setas). Células B. já não são colhidos quando sua aparência muda conforme mostrado aqui. <img src="/files/ftp_upload/2201/2201fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. A. Dez minutos após a remoção de 8 papilas sabor sem usar anestesia. Os locais cirúrgicos são visíveis como manchas ligeiramente avermelhado. Sem sangramento é notado. B. A língua mesmo 40 dias após a biópsia. Observe todas as papilas regenerado. Para ajudar a identificar as papilas removido como regrown, uma grade foi criada com o site na figura ao lado direito e deslocou mais de papilas regenerado na imagem do lado esquerdo. C. As papilas regenerado apareceu no local exato. Colheita papilas novamente a partir deste grupo seguido por imuno-histoquímica demonstrou que as papilas regenerado continha células gosto funcionais (veja a Figura 4A).

<ol>
	<li>Breslin, P. A., Spector, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+taste+perception.">Mammalian taste perception.</a> Curr Biol. 26 (4), R148-R155 (2008).</li><li>Miller, I., Doty, R. I., Dekker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+peripheral+taste+system.">Anatomy of the peripheral taste system.</a> Handbook of Olfaction and Gustation. , 521-547 (1995).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Figure+12.67.">Figure 12.67.</a> Gray's Anatomy: The Anatomical Basis of Medicine and Surgery. , (1995).</li><li>Huque, T., Cowart, B. J., Dankulich-Nagrudny, L., Pribitkin, E. A., Bayley, D. L., Spielman, A., Feldman, I., S, R., Mackler, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sour+ageusia+in+two+individuals+implicates+ion+channels+of+the+ASIC+and+PKD+families+in+human+sour+taste+perception+at+the+anterior+tongue.">Sour ageusia in two individuals implicates ion channels of the ASIC and PKD families in human sour taste perception at the anterior tongue.</a> PLoS One. 4 (10), e7347-e7347 (2009).</li><li>MacDonald, J. F., Mody, I., Salter, M. W., Spielman, A. I., Spielman, A. I., Brand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamping+of+taste+cells+in+mouse.">Patch-clamping of taste cells in mouse.</a> Experimental Cell Biology of Taste and Olfaction. , 329-332 (1995).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Uma vantagem notável a utilização de células humanas é a sua especificidade. O procedimento descrito aqui em detalhes fornece tecido língua para o isolamento de células gosto receptor dos seres humanos. Estas células gosto pode ser usado para estudos moleculares, buscando descobrir moléculas importantes para a transdução de informação, paladar e para os estudos de cálcio imagem que monitoram a atividade das células aos estímulos gosto. Além disso, o tecido língua fornecidas por este procedimento pode s...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>McPherson-Vannas. Curved, sharp cutting edge 5mm. Comb, tip width 0.2 mm overall length 3"</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz Surgical Instruments Co., Inc. Gaithersburg, MD 20898</td>
<td>RS-5603, Roboz</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Small Dumont forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
<td>RS-4915, Roboz</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

technique to collect fungiform (taste) papillae from human tongue

O sentido do paladar é fundamental para a vida humana. Ele informa o corpo sobre a qualidade dos alimentos que serão ingeridos potencialmente e estimula os processos metabólicos que preparam o tubo digestivo para a digestão. Constante progresso está sendo feito para a compreensão dos eventos bioquímicos e moleculares iniciais subjacentes transdução gosto (para uma revisão, Breslin e Spector, 2008 1). No entanto, o progresso até agora resultou em grande parte a partir de modelos animais. No entanto, uma vez que diferenças marcantes na especificidade do receptor e densidade do receptor variam entre as espécies, a transdução gosto humano só vai ser entendido usando tecido gosto humano. Aqui nós descrevemos uma técnica de biópsia para coletar humana papilas fungiformes, visíveis como estruturas arredondadas rosa anterior, cerca de 0,5 mm de diâmetro que contêm as papilas gustativas. Estas papilas biópsia são usadas para vários fins, incluindo o isolamento de células viáveis ​​bud gosto, hibridização in situ imuno-histoquímica, e, através de técnicas de biologia molecular, a identificação de proteínas específicas do gosto da novela.

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Technique to Collect Fungiform Taste Papillae from Human Tongue

Conhecimento dos mecanismos moleculares subjacentes a transdução de gustativa tem apreciado recentemente avanços significativos, em grande parte devido ao uso de modelos animais. No entanto, a grande diversidade na sensibilidade gustativa e especificidade entre os estudos mamíferos garante no tecido humano. Descrevemos uma técnica de biópsia para coletar células gosto vivos de papilas na língua humana.

Técnica para coletar fungiformes (Taste) papilas da língua humana

The sense of taste is critical for human life. It informs the body about the quality of food that will be potentially ingested and stimulates metabolic ...

technique-to-collect-fungiform-taste-papillae-from-human-tongue

Research

JoVE Journal

Medicine

Technique to Collect Fungiform (Taste) Papillae from Human Tongue

28.7K visualizações.  College of Dentistry, New York University. Conhecimento dos mecanismos moleculares subjacentes a transdução de gustativa tem apreciado recentemente avanços significativos, em grande parte devido ao uso de modelos animais. No entanto, a grande diversidade na sensibilidade gustativa e especificidade entre os estudos mamíferos garante no tecido humano. Descrevemos uma técnica de biópsia para coletar células gosto vivos de papilas na língua humana.

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Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 diabetic islets from organ donors2. Here we share our protocol for isolating islets from human pancreatic tissue obtained from type 2 diabetic and non-diabetic patients who have undergone partial pancreatectomy due to different pancreatic diseases (benign or malignant pancreatic tumors, chronic pancreatitis, and common bile duct or duodenal tumors). All patients involved gave their consent to this study, which had also been approved by the local ethics committee. The surgical specimens were immediately delivered to the pathologist who selected soft and healthy appearing pancreatic tissue for islet isolation, retaining the damaged tissue for diagnostic purposes. We found that to isolate more than 1,000 islets, we had to begin with at least 2 g of pancreatic tissue. Also essential to our protocol was to visibly distend the tissue when injecting the enzyme-containing media and subsequently mince it to aid digestion by increasing the surface area.
To extend the applicability of our protocol to include the occasional case in which a large amount (&gt;15g) of human pancreatic tissue is available , we used a Ricordi chamber (50 ml) to digest the tissue. During digestion, we manually shook the Ricordi chamber3 at an intensity that varied by specimen according to its level of tissue fibrosis. A discontinous Ficoll gradient was then used to separate the islets from acinar tissue. We noted that the tissue pellet should be small enough to be homogenously resuspended in Ficoll medium with a density of 1.125 g/ml. After isolation, we cultured the islets under stress free conditions (no shaking or rotation) with 5% CO2 at 37 &deg;C for at least 48 h in order to facilitate their functional recovery. Widespread application of our protocol and its future improvement could enable the timely harvesting of large quantities of human islets from diabetic and clinically matched non-diabetic subjects, greatly advancing type 2 diabetes research.

The supply of type 2 diabetic islets for research is insufficient. Here we share our protocol for isolating islets from patients undergoing partial pancreatectomy. This approach represents a unique venue for obtaining islets from type 2 diabetic and clinically matched non-diabetic subjects in adequate numbers for basic and clinical studies.

Isolamento de Ilhotas Humanos de pacientes parcialmente pancreatectomizado

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

Medicina

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

Enucleation is the process of retrieving the ocular globe from a cadaveric donor leaving the rest of the globe undisturbed. Excision refers to the retrieval of ocular tissues, especially cornea, by cutting it separate from the ocular globe. Evisceration is the process of removing the internal organs referred here as retina. The ocular globe consists of the cornea, the sclera, the vitreous body, the lens, the iris, the retina, the choroid, muscles etc (Suppl. Figure 1). When a patient is suffering from corneal damage, the cornea needs to be removed and a healthy one must be transplanted by keratoplastic surgeries. Genetic disorders or defects in retinal function can compromise vision. Human ocular globes can be used for various surgical procedures such as eye banking, transplantation of human cornea or sclera and research on ocular tissues. However, there is little information available on human corneal and retinal excision, probably due to the limited accessibility to human tissues. Most of the studies describing similar procedures are performed on animal models. Research scientists rely on the availability of properly dissected and well-conserved ocular tissues in order to extend the knowledge on human eye development, homeostasis and function. As we receive high amount of ocular globes out of which approximately 40% (Table 1) of them are used for research purposes, we are able to perform huge amount of experiments on these tissues, defining techniques to excise and preserve them regularly.
The cornea is an avascular tissue which enables the transmission of light onto the retina and for this purpose should always maintain a good degree of transparency. Within the cornea, the limbus region, which is a reservoir of the stem cells, helps the reconstruction of epithelial cells and restricts the overgrowth of the conjunctiva maintaining corneal transparency and clarity. The size and thickness of the cornea are critical for clear vision, as changes in either of them could lead to distracted, unclear vision. The cornea comprises of 5 layers; a) epithelium, b) Bowman's layer, c) stroma, d) Descemet's membrane and e) endothelium. All layers should function properly to ensure clear vision4,5,6. The choroid is the intermediate tunic between the sclera and retina, bounded on the interior by the Bruch's membrane and is responsible for blood flow in the eye. The choroid also helps to regulate the temperature and supplies nourishment to the outer layers of the retina5,6. The retina is a layer of nervous tissue that covers the back of the ocular globe (Suppl. Figure 1) and consists of two parts: a photoreceptive part and a non-receptive part. The retina helps to receive the light from the cornea and lens and converts it into the chemical energy eventually transmitted to the brain with help of the optic nerve5,6.
The aim of this paper is to provide a protocol for the dissection of corneal and retinal tissues from human ocular globes. Avoiding cross-contamination with adjacent tissues and preserving RNA integrity is of fundamental importance as such tissues are indispensable for research purposes aimed at (i) characterizing the transcriptome of the ocular tissues, (ii) isolating stem cells for regenerative medicine projects, and (iii) evaluating histological differences between tissues from normal/affected subjects. In this paper we describe the technique we currently use to remove the cornea, the choroid and retinal tissues from an ocular globe. Here we provide a detailed protocol for the dissection of the human ocular globe and the excision of corneal and retinal tissues. The accompanying video will help researchers to learn an appropriate technique for the retrieval of precious human tissues which are difficult to find regularly.

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

The paper describes a simplified technique to excise corneal and to eviscerate retinal tissues from the ocular globe of human cadaveric donors. The technique described here will help to excise good quality tissues to be used for transplantation, surgical or research purposes without damaging other tissues of the ocular globe.

Uma técnica simplificada para<em&gt; In situ</em&gt; Excisão de Córnea e evisceração de tecido da retina do globo ocular humano

Enucleation is the process of retrieving the ocular globe from a cadaveric donor leaving the rest of the globe undisturbed. Excision refers to the ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly effective. This video describes the percutaneous biopsy technique using a modified Bergstr&#246;m needle to obtain skeletal muscle tissue samples from the vastus lateralis of human subjects. The Bergstr&#246;m needle consists of an outer cannula with a small opening (&#8216;window&#8217;) at the side of the tip and an inner trocar with a cutting blade at the distal end. Under local anesthesia and aseptic conditions, the needle is advanced into the skeletal muscle through an incision in the skin, subcutaneous tissue, and fascia. Next, suction is applied to the inner trocar, the outer trocar is pulled back, skeletal muscle tissue is drawn into the window of the outer cannula by the suction, and the inner trocar is rapidly closed, thus cutting or clipping the skeletal muscle tissue sample. The needle is rotated 90&#176;&#160;and another cut is made. This process may be repeated three more times. This multiple cutting technique typically produces a sample of 100-200 mg or more in healthy subjects and can be done immediately before, during, and after a bout of exercise or other intervention. Following post-biopsy dressing of the incision site, subjects typically resume their activities of daily living right away and can fully participate in vigorous physical activity within 48-72 hr. Subjects should avoid heavy resistance exercise for 48 hr to reduce the risk of herniation of the muscle through the incision in the fascia.

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&amp;#246;m Technique

The purpose of this video is to present the modified Bergstr&#246;m skeletal muscle biopsy technique on human subjects.

Procedimentos de biópsia de músculo esquelético humano, utilizando a técnica Bergström Modificado

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and VII). Due to its autofluorescence, opaqueness, and thickness, it has not been found suitable for confocal microscopy. An alternative approach to the one presented here, which uses formalin-fixed sclera embedded in paraffin for immunohistochemistry, has technical challenges, especially when preheating the tissue for antigen retrieval. Since the sclera is relatively poor in both cells and vessels, the use of larger tissue samples was explored to help prevent overlooking cells and to understand their localization in relation to vessels and other anatomical sites. To allow for the analysis of larger tissue samples under the confocal microscope, a laminating technique was performed to create thin layers from the sclera. Following the analysis of results of CD31 blood vessels and lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1) positive cells, for which approval for scientific examination was obtained, the advantages and limitations of this method are discussed.

Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used.

Usando uma técnica de estratificação para executar microscopia confocal da esclera humana


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include supporting mastication and deglutition, as well as taste-sensing and phonetics. Accordingly, the strength and volume of the tongue can impact the ability of vertebrates to accomplish basic activities such as feeding, communicating, and breathing. Human patients with sleep apnea have enlarged tongues, characterized by reduced muscle tone and increased intramuscular fat that can be visualized and quantified by magnetic resonance imaging (MRI). The abilities to measure force generation and viscoelastic properties of the tongue constitute important tools for obtaining functional information to correlate with imaging data. Here, we present techniques for measuring tongue force production in anesthetized Zucker rats via electrical stimulation of the hypoglossal nerves and for determining the viscoelastic properties of the tongue by applying passive Lissajous force/deformation curves.

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

We describe a surgical procedure in an anesthetized rat model for determining the muscle tone and viscoelastic properties of the tongue. The procedure involves specific stimulation of the hypoglossal nerves and application of passive Lissajous force/deformation curves to the muscle.

Avaliação In Vivo das Propriedades Mecanicas e Viscoelásticas da Língua do Rato

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

Technique of Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice for Induction of Left Ventricular Hypertrophy

Transverse aortic constriction (TAC) in mice is one of the most commonly used surgical techniques for experimental investigation of pressure overload-induced left ventricular hypertrophy (LVH) and its progression to heart failure. In the majority of the reported investigations, this procedure is performed with intubation and ventilation of the animal which renders it demanding and time-consuming and adds to the surgical burden to the animal. The aim of this protocol is to describe a simplified technique of minimally invasive TAC without intubation and ventilation of mice. Critical steps of the technique are emphasized in order to achieve low mortality and high efficiency in inducing LVH.
Male C57BL/6 mice (10-week-old, 25-30 g, n=60) were anesthetized with a single intraperitoneal injection of a mixture of ketamine and xylazine. In a spontaneously breathing animal following a 3-4 mm upper partial sternotomy, a segment of 6/0 silk suture threaded through the eye of a ligation aid was passed under the aortic arch and tied over a blunted 27-gauge needle. Sham-operated animals underwent the same surgical preparation but without aortic constriction. The efficacy of the procedure in inducing LVH is attested by a significant increase in the heart/body weight ratio. This ratio is obtained at days 3, 7, 14 and 28 after surgery (n = 6 - 10 in each group and each time point). Using our technique, LVH is observed in TAC compared to sham animals from day 7 through day 28. Operative and late (over 28 days) mortalities are both very low at 1.7%.
In conclusion, our cost-effective technique of minimally invasive TAC in mice carries very low operative and post-operative mortalities and is highly efficient in inducing LVH. It simplifies the operative procedure and reduces the strain put on the animal. It can be easily performed by following the critical steps described in this protocol.

The aim of this protocol is to describe step-by-step the technique of minimally invasive transverse aortic constriction (TAC) in mice. By elimination of intubation and ventilation which are mandatory for the commonly used standard procedure, minimally invasive TAC simplifies the operative procedure and reduces the strain put on the animal.

Técnica de constrição da aorta minimamente invasiva transversal em camundongos para indução de Hipertrofia Ventricular Esquerda

Transverse aortic constriction (TAC) in mice is one of the most commonly used surgical techniques for experimental investigation of pressure ...

Taste Exam: A Brief and Validated Test

The emerging importance of taste in medicine and biomedical research, and new knowledge about its genetic underpinnings, has motivated us to supplement classic taste-testing methods in two ways. First, we explain how to do a brief assessment of the mouth, including the tongue, to ensure that taste papillae are present and to note evidence of relevant disease. Second, we draw on genetics to validate taste test data by comparing reports of perceived bitterness intensity and inborn receptor genotypes. Discordance between objective measures of genotype and subjective reports of taste experience can identify data collection errors, distracted subjects or those who have not understood or followed instructions. Our expectation is that fast and valid taste tests may persuade researchers and clinicians to assess taste regularly, making taste testing as common as testing for hearing and vision. Finally, because many tissues of the body express taste receptors, taste responses may provide a proxy for tissue sensitivity elsewhere in the body and, thereby, serve as a rapid, point-of-care test to guide diagnosis and a research tool to evaluate taste receptor protein function.

This protocol measures human taste responses and includes a brief anatomical assessment, a short taste test, and a validation method using the subject&#39;s reported sensation and taste receptor genotype.

: Sabor um breve e validado teste exame

The emerging importance of taste in medicine and biomedical research, and new knowledge about its genetic underpinnings, has motivated us to supplement ...

Standardized Technique of Aortic Valve Re-implantation for Valve-sparing Aortic Root Replacement

Despite the obvious advantages of the preservation of a normal aortic valve during aortic root replacement, the complexity of valve sparing procedures prevents a number of cardiac surgeons from incorporating them into their practice. The aim of this protocol is to describe a simplified and user-friendly technique of an aortic valve-sparing root replacement (VSRR) procedure by re-implantation of the aortic valve. Proper selection of patients and limitations of the technique are discussed.
In 54 consecutive patients, normal appearing aortic valves were re-implanted in a commercially available polyester prosthesis with pre-shaped sinuses by a simplified and standardized technique. Placement of the first row of the proximal suture line, choice of the prosthesis size, and adjustment of the height of the commissures of the patient to the fixed height of the sinus portion of the prosthesis were slightly modified from the reference techniques with the aim of increasing its feasibility for use by other cardiac surgeons. Early mortality and morbidity as well as 5-year survival, freedom from aortic valve reoperation, and freedom from recurrent moderate regurgitation were collected in all patients.
Thirty-day mortality, re-sternotomy for bleeding, re-sternotomy for mediastinitis, and the incidence of stroke were very low, 1.8% for each (1 of 54). No patient required permanent pace-maker implantation. At 5 years, survival, freedom from aortic valve reoperation, and freedom from recurrent moderate regurgitation were 97.5%, 95.2%, and 91.6%, respectively.
Mid-term results of our standardized technique of re-implantation of the aortic valve for valve-sparing aortic root replacement are very good and compare with more complex techniques reported by experienced surgeons. By following the present protocol of the standardized re-implantation technique, a greater number of cardiac surgeons can perform this procedure with comparable good results.

Valve-sparing aortic root replacement has the advantage of preserving the patient&#39;s own aortic valve. The complexity of the reported techniques to date restricts their use to a limited number of cardiac surgeons. This protocol describes step-by-step a standardized technique reproducible by a greater number of cardiac surgeons.

Substituição de raiz de técnica padronizada de re-implantação de válvula aórtica para válvula conservadora da aorta

Despite the obvious advantages of the preservation of a normal aortic valve during aortic root replacement, the complexity of valve sparing procedures ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal pigment epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera, the integrity of the fragile retina can easily be compromised. The aim of this study was to develop a novel HORC model that contains the retina, RPE-choroid and sclera to maintain retinal integrity when culturing retinal explants.
After cutting circumferentially along the limbus to remove iris and lens, four deep incisions were made to flatten the eyecup. In contrast to previous HORC protocols, a trephine was used to cut through not only the retina but also the RPE-choroid and sclera. The resultant triple-layered explants were cultured for 72 h. Hematoxylin and Eosin staining (H&#38;E) was used to assess anatomical structures and retinal explants were further characterized by immunohistochemistry (IHC) for apoptosis, M&#252;ller cell integrity and retinal inflammation. To confirm the possibility of disease induction, explants were exposed to high glucose (HG) and pro-inflammatory cytokines (Cyt), to mimic diabetic retinopathy (DR). The Luminex magnetic bead assay was used to measure DR-related cytokines released into the culture medium.
H&#38;E staining revealed distinct retinal lamellae and compact nuclei in retinal explants with the underlying RPE-choroid and sclera, while retinas without the underlying structures exhibited reduced thickness and severe nuclei loss. IHC results indicated absence of apoptosis and retinal inflammation as well as preserved M&#252;ller cell integrity. The Luminex&#160;assays showed significantly increased secretion of DR-associated pro-inflammatory cytokines in retinal explants exposed to HG + Cyt relative to baseline levels at 24 h.
We successfully developed and characterized a novel HORC protocol in which retinal integrity was preserved without apoptosis or retinal inflammation. Moreover, the induced secretion of DR-associated pro-inflammatory biomarkers when exposing retinal explants to HG + Cyt suggests that this model could be used for clinically translatable retinal disease studies.

This study aims to develop a novel human organotypic retinal culture (HORC) model that prevents compromising retinal integrity during explant handling. This is achieved by culturing the retina with the overlying vitreous and the underlying retinal pigment&#160;epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera.

Caracterização de uma nova técnica de cultura de retina organotipípica humana

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Psychophysical Tracking Method to Assess Taste Detection Thresholds in Children, Adolescents, and Adults: The Taste Detection Threshold (TDT) Test

This paper describes a two-alternative, forced-choice, staircase, tracking procedure, called the Taste Detection Threshold (TDT) test, that provides a reliable measure of sweet, salty, and umami taste detection thresholds from childhood to adulthood. Advantages of the method include procedures that are identical for children and adults, thus allowing the determination of age-related and individual differences in taste perception, if any, and tasks that can be completed in a relatively short time frame, do not rely on continuous attention or require memorization, control for subjective response biases, and minimize the impact of language development. After a 1 hour fast, participants are presented with pairs of solutions; in each pair, one solution is water, and the other solution contains varying concentrations of the tastant.
Using a whole-mouth tasting method, participants taste each solution (without swallowing and with rinsing between tastings) and then point to the solution with a taste or that tastes different from water. The concentration of the stimulus in the subsequent pair increases after a single incorrect response and decreases after two consecutive correct responses. A reversal occurs when the concentration sequence changes direction. The task is deemed completed after the occurrence of four reversals, provided there are a maximum of two dilution steps between two successive reversals, and the series of reversals do not form an ascending pattern. These additional criteria ensure greater reliability in outcomes. The TDT is then calculated as the geometric mean of the concentrations of the four reversals. This method has real-world relevance as it provides information on a dimension of taste perception that is independent of hedonics, and that can change with aging and certain disease states, making it a valuable psychophysical test.

Psychophysical Tracking Method to Assess Taste Detection Thresholds in Children, Adolescents, and Adults: The Taste Detection Threshold TDT Test

Psychophysical tools measure the functionality of the taste system for both research and health assessment purposes. This paper describes a method to measure taste detection thresholds that can determine the lowest concentration of sucrose, sodium chloride, or monosodium glutamate that can be tasted by individuals as young as 6 years.

Método de rastreamento psicofísico para avaliar limiares de detecção de sabor em crianças, adolescentes e adultos: o teste de limiar de detecção de sabor (TDT)

This paper describes a two-alternative, forced-choice, staircase, tracking procedure, called the Taste Detection Threshold (TDT) test, that provides a ...