Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R21 DC03969-01 (a JGB). Ringraziamo il Dr. Fritz Lischka per l&#39;acquisizione di singole cellule papille gustative, il Dott. Tauf Huque per l&#39;esecuzione della RT-PCR Figura 4B e il Sig. D. Bayley e la signora S. Alarcon per assistenza tecnica. M. Pepino Yanina è un tipo supportato da una DA07313 NIDAT32 Washington University School of Medicine, St. Louis, MO (Cottler, LB PI).

1. Introduzione e considerazioni generali La procedura generale prevede l&#39;anestesia locale di un piccolo (1 cm 2) area della superficie dorsale della lingua anteriore, seguita da rimozione di un numero (6-8) di fungiformi (gusto) papille da quella zona anestetizzati con una curva primavera micro -forbici (McPherson-Vännäs tipo # SR 5603, Roboz, Rockville, MD). Il rimosso papille fungiformi sono circa 0,25 mm 3 ciascuna. C&#39;è molto poco non papille (gusto) tessuto epiteliale rimosso con ogni papilla. Nuovo modulo papille in questo settore dopo 3 a 5 settimane e riprendere il funzionamento papille gustative (Spielman e Brand, osservazioni non pubblicate). Non vi è alcun effetto evidente sul gusto o sapore del cibo dopo la rimozione di questa piccola quantità di materiale gusto. Da studi che hanno contato papille gustative individuali nella lingua umano adulto, si può stimare che la lingua umana contiene circa 5000 papille gustative. La nostra procedura consente di rimuovere al massimo 20 a 25 di queste papille gustative (in media, ~ 3,5-4 papille fungiformi ogni papilla umani) 2, pari a circa lo 0,4% del totale. Inoltre non vi è dolore associato con la perdita chirurgica di questo tessuto. Ci si sente, ovviamente, un leggero dolore al sito di iniezione solo, come l&#39;ago entra nella lingua. Dopo l&#39;anestesia ha portato fuori, c&#39;è il disagio di tanto in tanto mite per meno di un giorno, ma questo disagio è molto meno di quello che si sperimenta dopo accidentalmente &quot;morde&quot; la lingua quelle. Negli ultimi anni abbiamo sviluppato una procedura alternativa che non include l&#39;anestesia. La tecnica per la rimozione dei tessuti è identico per entrambi. L&#39;unica differenza nella procedura è che il chirurgo non è più confinata ad un centimetro di diametro 1 2 zona in cui è stato affrontato l&#39;anestesia. Piuttosto s / he può scegliere qualsiasi sito sulla superficie dorsale della lingua in cui papille prominenti apparire. Il numero totale di papille rimosse sono limitate a 6-8 in entrambe le tecniche, con o senza anestesia se eseguito correttamente, il disagio di rimuovere 6-8 papille gustative fungiformi è considerato un problema minore se confrontato con il dolore associato con la somministrazione di anestesia locale Un&#39;indagine generale di individui che hanno subito entrambe le procedure, cioè, con e senza anestesia, ha dimostrato che la stragrande maggioranza dei soggetti si dispensano senza anestesia locale in tutte le biopsie futuro. Il chirurgo che ha sviluppato questa tecnica (AIS) e diversi colleghi insegnato dall&#39;autore che ha eseguito biopsie senza anestesia, hanno provato su se stessi e testimoniano che il disagio è temporaneo ed è considerata inferiore a quella di mordersi la lingua. Infine, decine di persone che hanno accettato di essere sottoposte a biopsia è stato chiesto se sarebbero disposti a provare la rimozione di una papilla senza anestesia e se lo ritengono di essere troppo doloroso che subirebbe l&#39;anestesia, hanno tutti convenuto di proseguire con la rimozione delle papille senza anestesia. L&#39;intero biopsia non dovrebbe richiedere più di 5-10 minuti. Se l&#39;anestesia è impiegato altri 2-3 minuti viene aggiunto. La biopsia viene generalmente effettuata nelle prime ore del mattino. Prima della biopsia, i volontari sono incaricati di mangiare un pasto leggero due ore prima dell&#39;ora di inizio prevista. Alla biopsia, il consenso informato scritto è ottenuta. I criteri di esclusione, al momento della biopsia includono quelli con gravi malattie croniche, sia sotto controllo farmacologico o non (ad esempio, eventuali malattie gastrointestinali, malattie neurodegenerative, tumori, discrasie ematiche, allergia al anestetici locali, ecc), quelli con frequenza cardiaca superiore a 100 o meno di 60; pressione sistolica maggiore di 145 o inferiore a 100; pressione diastolica superiore a 90 o meno di 60, e il parere del chirurgo che il soggetto può partecipare allo studio. Infine, è importante considerare che la procedura di biopsia dovrebbe essere effettuata nella stessa struttura dove il tessuto verranno trattati per l&#39;esame in quanto l&#39;integrità dei tessuti sta rapidamente persa, come abbiamo più volte notato dalla qualità diminuzione di mRNA. Per minimizzare questi problemi il tessuto della lingua devono essere trattati il ​​più rapidamente possibile. 2. Preparazione soggetto <ol><li> Il soggetto è seduto su una poltrona o un posto a sedere con un poggiatesta. </li><li> Controllare la frequenza cardiaca e la pressione arteriosa al momento della biopsia. Se dovesse cadere soggetto al di fuori del campo della pressione arteriosa, frequenza cardiaca o di una competenza orale, il chirurgo consiglia al soggetto che lui / lei prendere appuntamento immediato vedere un medico. </li><li> Ispezionare la cavità orale per la salute dei tessuti generale, con particolare attenzione agli indicatori di xerostomia, della lingua geografica o eventuali lesioni della lingua. Qualsiasi soggetto che mostra segni di patologie orali, comprese lesioni della lingua o della xerostomia sono esclusi dallo studio. Istruire il soggetto a sciacquare la bocca con acqua per rimuovere tutti i detriti dalla cavità oraley. Se necessario, la lingua è pulita con un scrapper lingua usa e getta per rimuovere la placca o detriti, che potrebbe essere portato in lingua durante l&#39;iniezione dell&#39;anestesia. Il chirurgo utilizza tamponi di garza sterile in una mano guantata di tenere il quarto anteriore della lingua che si estende dalla cavità orale. </li><li> Se l&#39;anestesia viene utilizzata, una siringa tubercolina 1cc con un calibro 28 x ½ &#39;ago contenente 0,25 ml di lidocaina (2%) con adrenalina (1:100.000) viene iniettata lentamente in un sito appena sotto la superficie dorsale della porzione anteriore della lingua . Il sito di anestesia è distale al sito di raccolta per evitare interferenze con la lidocaina con studi successivi. Per confronto, la quantità di lidocaina iniettata (0,25 ml) è circa un quarto della quantità normalmente dato per il blocco del nervo a procedure dentali (0,8 ml a 1 ml). Dopo l&#39;inserimento dell&#39;ago, ma prima dell&#39;iniezione dell&#39;anestetico, aspirazione assicura che nessun vaso sanguigno viene colpito. Questa precauzione è presa anche se è anatomicamente improbabile che una nave di grandi dimensioni sarà colpito vicino alla superficie dorsale. Le arterie solo sulla superficie dorsale, le arterie dorsali lingue sono piccoli vasi sanguigni in primo luogo situato più posteriormente al terzo anteriore, dove la raccolta dei tessuti si verifica. Le arterie più grandi lingue e le vene linguali correre sulla superficie ventrale della lingua, lontana dalla zona dorsale ricevere anestesia 3. Il 1 area centimetri anestetizzati sembra essere leggermente pallido rispetto al tessuto circostante. Ciò è dovuto al rigonfiamento del tessuto in quanto comprime i piccoli vasi sanguigni. E &#39;anche per l&#39;effetto vasocostrittore della epinefrina. Dopo circa un minuto, una sonda viene utilizzata per testare l&#39;area di intorpidimento. Se l&#39;area non è insensibile, una seconda iniezione (da 0,1 a 0,2 ml) può essere somministrato. </li></ol> 3. Lingua Papille tecnica di rimozione <ol><li> Il quarto anteriore della lingua del soggetto è avvolto in una garza sterile (Figura 1) e tenuto nella mano sinistra del chirurgo (se si esegue la biopsia con la mano destra). Un angolo della garza viene lasciata aperta per permettere al chirurgo di pulire la lingua senza saliva. La lingua deve essere tenuto fermamente, ma, naturalmente, non in modo tale da causare disagio inutili. La punta del dito indice della mano sinistra è posizionata sotto la lingua direttamente sotto il sito in cui viene eseguita la biopsia. Premendo il dito indice verso l&#39;alto, la lingua diventa tesa sopra la punta del dito facendo le papille sporgere per una facile biopsia. </li><li> Criteri per la scelta papille per la biopsia: papille gustative sono facilmente distinguibili dalle circostanti filliform papille dalla loro forma e dimensione. Papille fungiformi sono rotondi e un po &#39;isolata dal circostante. Nelle loro immediate vicinanze vi è uno spazio circolare privo di filliform papille (Figura 2A, frecce blu). Questo spazio è di circa 1 mm di diametro. Un&#39;altra caratteristica distintiva delle papille fungiformi è estesa arborizzazione capillare visibile sulla parte superiore della maggior parte delle papille fungiformi soggetti giovani. Anche se arborizzazione rende più facile localizzare papille fungiformi, non sono necessariamente buoni predittori dell&#39;esistenza di papille gustative in quel papilla. Come una norma relativa raccolta inizia verso la fine anteriore e si allontana dalla punta della lingua per evitare emorragie capillari da oscurare il sito della collezione dei tessuti successiva. </li><li> Una volta che un buon papilla è stata identificata, una molla micro-forbici (McPherson-Vännäs, curva, tagliente affilato 5 mm, pettine, larghezza punta 0,2 mm lunghezza 3 &quot;(RS-5603, Roboz) è usato per tagliare fuori. Per utilizzare efficacemente le forbici micro chirurgico non si dovrebbe usare la punta della lama per il taglio, anzi, per quanto all&#39;interno della lama il più possibile (figura 1, l&#39;immagine ingrandita e la Figura 3), vicino al punto di intersezione con la lama opposta. La rimozione della papilla è realizzato con una mossa di taglio delle forbici (figura 1). ulteriormente all&#39;interno delle pale aprire la papilla appare mirata, più efficace è il taglio. Prestare attenzione che la posizione complessiva delle forbici devono essere paralleli con la superficie dorsale della lingua. </li><li> A volte la lingua diventa secco come il chirurgo sta cercando di identificare una papilla per la rimozione. Una volta asciutta, la capacità dell&#39;operatore di vedere chiaramente che è un papille fungiformi diventa più impegnativo e fa scorrere delle pale sopra la papilla molto difficile. Una lingua troppo secco rende di solito lo stick lama metallica alla lingua di effettuare il passaggio delicato intervento chirurgico meno controllabili. Lasciando che il soggetto vicino il suo / la sua bocca e la saliva sono venuti a contatto con la superficie della lingua aiuta il processo. Eccessivamente lingua bagnata non è buono neanche. Utilizzando l&#39;angolo della garza che si usa per tenere la lingua aiuta in questo processo. </li><li> Qualsiasi sanguinamento capillare che si verifica è trattato tamponando con garza sterile. Il sanguinamento di solito si ferma a pochi min<html> sce e non interferisce con la raccolta di tessuto aggiuntivo. Perché le papille estendono al di sopra della superficie epiteliale della lingua, e solo le superiori 3 / 4 di una papilla fungiformi viene rimosso (Figura 2B), quella parte del fungiform mostrando papille gustative, piccolo sanguinamento è previsto. </li><li> Usando un piccolo Dumont pinza (tipo Pattern), le papille rimossi sono collocati in refrigerata tampone Ringer di base (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM Na-piruvato, 20 mM HEPES-Na , pH 7.2; osmolalità di circa 305 osmols millisecondi) per le manipolazioni successive. E &#39;imperativo per pizzicare MAI la papilla tra le lame di una pinza. Il tessuto è molto fragile e deve essere maneggiato con estrema cura. </li><li> Dopo la rimozione delle papille, il soggetto rimane sulla sedia per 10-15 minuti. Ogni soggetto è detto di non mordere la lingua anestetizzata, ma per mantenere la loro lingua a riposo. Soggetti devono essere visivamente monitorato dal chirurgo curante. L&#39;anestesia è previsto a svanire in circa 30-60 minuti. Perché il sito di rimozione papille potrebbe essere leggermente dolorante dopo la biopsia, sono istruiti a essere consapevoli di piccante o caldo (temperatura) alimenti, bevande gassate o bevande che sono o molto freddi o caldi. Un ulteriore indizio è dato a soggetti che ogni leggera colorazione rossastra della saliva è normale e cesserà in caso di dissoluzione del coagulo. </li><li> I soggetti sono visti 30-40 giorni dopo la rimozione delle papille per la valutazione del sito in cui sono state rimosse le papille. In questo momento papille gustative dovrebbe avere completamente rigenerato. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati Tessuti raccolti possono essere utilizzati per l&#39;immunoistochimica, RT-PCR, ibridazione in situ, l&#39;imaging del calcio, patch di serraggio e coltura di tessuti. Quando eseguito correttamente l&#39;aspetto delle papille sono sani cercando, bianco, circa 0,5-1 mm di diametro (Figura 2B). Papille raccolti per immunoistochimica sono elaborati sulla base di protocolli esistenti e pubblicato 4. Una gemma da un gusto tipico paraformaldehide-fisso papilla gusto è mostrato nella figura 4A. Papille biopsia può anche essere trattate enzimaticamente da 5 a raggiungere dissociazione delle cellule papille gustative. Dopo la dissociazione enzimatica, le cellule possono essere mantenute fino a 4 ore in un piatto umidificato Petri a 4C. In questo stato possono essere utilizzati per la PCR singola cellula (Figura 4B), Ca-imaging, ecc Le cellule mostrano una varietà di forme, molti sono sottili e bipolare (Figura 5A e 5B), come ci si aspetterebbe da una cellula papille gustative. Quando si raccolgono le cellule o l&#39;esecuzione di Ca-imaging, dopo circa 20 minuti al microscopio, le cellule iniziano a sviluppare vesciche apoptotici (Figura 6A e 6B, frecce) e molti di loro diventano rotonde. Utilizzando una tecnica sviluppata nel nostro laboratorio, le cellule sono state prelevati singolarmente con un patch-pipetta, come mostrato nella Figura 5A e 5B. Come accennato in precedenza, papille cominciano a ricrescere dopo 5 a 8 settimane. 7A figura mostra l&#39;aspetto di una lingua in cui sono stati rimossi 8 papille fungiformi dal lato sinistro lingua di un volontario senza utilizzare l&#39;anestesia. Avviso 8 posti leggermente rossastro, dove sono state tagliate le papille off. Nessun sanguinamento si osserva dopo l&#39;intervento chirurgico. L&#39;immagine attuale è stata scattata 10 minuti dopo la biopsia. 7B figura è l&#39;immagine della lingua dello stesso soggetto visto 40 giorni dopo la biopsia. Gara tutti papille sono ricresciuti. Per determinare se le papille rigenerati sono funzionali abbiamo chiesto ai nostri volontari di accettare una seconda biopsia che coinvolge le papille esattamente lo stesso. Per identificare correttamente le papille appropriato stavamo progettando di ri-raccolto, abbiamo generato una griglia (Figura 7C) che si inserisce l&#39;8 papille che sono stati rimossi, in primo luogo e sovrapposti sopra la lingua del volontario stesso dopo 40 giorni dopo biopsia iniziale . Aiutato dal contorno della lingua e la distanza dal margine alla griglia, una volta individuato, abbiamo rimosso alcune delle papille stesse esatte e trattati per loro immunoistochimica. Figura 4A è una di queste papille. Si noti la sagoma di un papille gustative (in giallo) e la colorazione immunopositive per fosfolipasi Cβ2 (PLCβ2), a 2 celle gusto tipo di trasduzione associati enzima. Questi dati dimostrano che utilizzando la procedura biopsia come sopra descritto, le papille fungiformi rigenerare sufficientemente da 40 giorni per avere anche in luogo probabile papille gustative funzionale. <img src="/files/ftp_upload/2201/2201fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Il quarto anteriore della lingua del soggetto è avvolto in una garza sterile e tiene nella mano sinistra del chirurgo. Lingua deve essere tenuto saldamente. L&#39;immagine ingrandita a destra mostra la posizione corretta delle forbici e la posizione della papilla in relazione alla lama. 201/2201fig2.jpg &quot;alt =&quot; Figura 2 &quot;/&gt; Figura 2. (A) papille fungiformi sono indicati con le frecce blu. Si tratta di strutture rotondo un po &#39;isolato dai suoi dintorni e nelle loro immediate vicinanze vi è uno spazio circolare privo di filliform papille. (B) papille fungiformi sapore sulla punta della primavera micro-forbici secondi dopo che è stato rimosso. <img src="/files/ftp_upload/2201/2201fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Auto biopsia di una papilla fungiformi utilizzando uno specchio e senza anestesia. L&#39;inserto illustra la posizione complessiva delle forbici, che deve essere parallelo alla superficie dorsale della lingua. Se fatto correttamente e atraumatico, l&#39;anestesia è rinunciato praticamente da tutti i volontari. <img src="/files/ftp_upload/2201/2201fig4a.jpg" alt="Figura 4a" /> Figura 4 A. Immunoistochimica di un bocciolo gusto. Un papilla ottica fungiformi visualizzati da Nomarski utilizzando anticorpi fosfolipasi β2 e taggati con Red proteina fluorescente. Il profilo della gemma gusto e poche cellule gusto verranno indicati in giallo. <img src="/files/ftp_upload/2201/2201fig4b.jpg" alt="Figura 4b" /> B. RT-PCR di un recettore aspro sapore candidato, Acido Sensing Ion Canale 1 (ASIC1). M = marcatore. Corsie da 1 a 4 sono stati singola cellula RT-PCR per ASIC1 da quattro volontari diversi. Dopo la raccolta, papille fungiformi erano dissociate enzimaticamente le cellule singolarmente presi e espressione di ASIC1 sono stati fatti. 2 e 4 corsie erano espressione normale di ASIC1. <img src="/files/ftp_upload/2201/2201fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Immagine di A. cellule gustative singolo essere raccolto con una pipetta di patch. A grandi cellule epiteliali è visibile nell&#39;angolo in basso a sinistra (5A). Due i globuli rossi sono visibili anche al di sopra della pipetta di patch e dietro la canna di vetro. La cella gusto è di circa 30-50 micron di lunghezza e circa 6 micron di larghezza. Per avere un riferimento, un globulo rosso è di circa 7-8 micron di diametro. B. mostra un altro recettore cellulare gusto circondato da quattro cellule epiteliali. La cella gusto aspetto croccante. <img src="/files/ftp_upload/2201/2201fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. A. immagini di cellule che ha iniziato a sviluppare vesciche apoptotici (fantasma come vesciche intorno collegato alla cella di gusto, frecce). B. Le cellule non sono più raccolte quando il loro aspetto cambia come mostrato qui. <img src="/files/ftp_upload/2201/2201fig7.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. A. Dieci minuti dopo la rimozione di 8 papille gustative senza utilizzare l&#39;anestesia. I siti chirurgici sono visibili come macchie leggermente rossastro. Assenza di sanguinamento è notato. B. La lingua stessa 40 giorni dopo la biopsia. Gara tutti papille rigenerato. Per aiutare a identificare le papille rimosso come ricresciuti, una griglia è stata creata con il sito sull&#39;immagine a destra e spostato oltre le papille rigenerato sull&#39;immagine a sinistra. C. Le papille rigenerato apparso nel punto esatto stesso. La raccolta papille ripartire da questo gruppo seguito da immunoistochimica ha dimostrato che le papille rigenerato contenute cellule gustative funzionale (vedi Figura 4A).

<ol>
	<li>Breslin, P. A., Spector, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+taste+perception.">Mammalian taste perception.</a> Curr Biol. 26 (4), R148-R155 (2008).</li><li>Miller, I., Doty, R. I., Dekker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+peripheral+taste+system.">Anatomy of the peripheral taste system.</a> Handbook of Olfaction and Gustation. , 521-547 (1995).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Figure+12.67.">Figure 12.67.</a> Gray's Anatomy: The Anatomical Basis of Medicine and Surgery. , (1995).</li><li>Huque, T., Cowart, B. J., Dankulich-Nagrudny, L., Pribitkin, E. A., Bayley, D. L., Spielman, A., Feldman, I., S, R., Mackler, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sour+ageusia+in+two+individuals+implicates+ion+channels+of+the+ASIC+and+PKD+families+in+human+sour+taste+perception+at+the+anterior+tongue.">Sour ageusia in two individuals implicates ion channels of the ASIC and PKD families in human sour taste perception at the anterior tongue.</a> PLoS One. 4 (10), e7347-e7347 (2009).</li><li>MacDonald, J. F., Mody, I., Salter, M. W., Spielman, A. I., Spielman, A. I., Brand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamping+of+taste+cells+in+mouse.">Patch-clamping of taste cells in mouse.</a> Experimental Cell Biology of Taste and Olfaction. , 329-332 (1995).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Un notevole vantaggio di utilizzare cellule umane è la loro specificità. La procedura descritta in dettaglio fornisce tessuto lingua per l&#39;isolamento delle cellule gustative recettore dagli esseri umani. Queste cellule gustative possono essere utilizzati per studi molecolari, cercando di scoprire molecole importanti per la trasduzione di informazioni gusto, e per studi di imaging del calcio che monitorano l&#39;attività delle cellule gusto agli stimoli. Inoltre, il tessuto lingua forniti da questa procedura posso...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>McPherson-Vannas. Curved, sharp cutting edge 5mm. Comb, tip width 0.2 mm overall length 3"</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz Surgical Instruments Co., Inc. Gaithersburg, MD 20898</td>
<td>RS-5603, Roboz</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Small Dumont forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
<td>RS-4915, Roboz</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

technique to collect fungiform (taste) papillae from human tongue

Il senso del gusto è fondamentale per la vita umana. Si informa il corpo circa la qualità del cibo che sarà potenzialmente ingerito e stimola i processi metabolici che preparano il canale alimentare per la digestione. Costanti progressi si stanno compiendo verso la comprensione degli eventi biochimici e molecolari primi sottostante trasduzione del gusto (per una rassegna, Breslin e Spector, 2008 1). Tuttavia, i progressi fino ad oggi è in gran parte il risultato di modelli animali. Tuttavia, dal momento che marcate differenze nella specificità del recettore e la densità dei recettori variano da specie a specie, trasduzione gusto umano essere compresa solo utilizzando tessuti umani gusto. Qui si descrive una tecnica di biopsia per raccogliere umano papille fungiformi, visibili come strutture rosa anteriori arrotondati, di circa 0,5 mm di diametro che contengono le papille gustative. Queste papille biopsie sono utilizzati per scopi diversi tra cui l&#39;isolamento delle cellule vitali papille gustative, ibridazione in situ, immunoistochimica e, attraverso tecniche di biologia molecolare, l&#39;identificazione del gusto proteine ​​specifiche del romanzo.

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Technique to Collect Fungiform Taste Papillae from Human Tongue

Conoscenza dei meccanismi molecolari alla base di trasduzione gustativa ha recentemente goduto di significativi passi avanti, soprattutto grazie all&#39;utilizzo di modelli animali. Tuttavia, la grande diversità di sensibilità e specificità tra gusto garantisce mammiferi studi nel tessuto umano. Descriviamo una tecnica di biopsia per raccogliere cellule gustative viventi dalle papille sulla lingua umana.

Tecnica per raccogliere fungiformi (Gusto) Papille da lingua umana

The sense of taste is critical for human life. It informs the body about the quality of food that will be potentially ingested and stimulates metabolic ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Technique to Collect Fungiform (Taste) Papillae from Human Tongue

28.8K Views.  College of Dentistry, New York University. Conoscenza dei meccanismi molecolari alla base di trasduzione gustativa ha recentemente goduto di significativi passi avanti, soprattutto grazie all'utilizzo di modelli animali. Tuttavia, la grande diversità di sensibilità e specificità tra gusto garantisce mammiferi studi nel tessuto umano. Descriviamo una tecnica di biopsia per raccogliere cellule gustative viventi dalle papille sulla lingua umana.

Video: Technique to Collect Fungiform Taste Papillae from Human Tongue

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 diabetic islets from organ donors2. Here we share our protocol for isolating islets from human pancreatic tissue obtained from type 2 diabetic and non-diabetic patients who have undergone partial pancreatectomy due to different pancreatic diseases (benign or malignant pancreatic tumors, chronic pancreatitis, and common bile duct or duodenal tumors). All patients involved gave their consent to this study, which had also been approved by the local ethics committee. The surgical specimens were immediately delivered to the pathologist who selected soft and healthy appearing pancreatic tissue for islet isolation, retaining the damaged tissue for diagnostic purposes. We found that to isolate more than 1,000 islets, we had to begin with at least 2 g of pancreatic tissue. Also essential to our protocol was to visibly distend the tissue when injecting the enzyme-containing media and subsequently mince it to aid digestion by increasing the surface area.
To extend the applicability of our protocol to include the occasional case in which a large amount (&gt;15g) of human pancreatic tissue is available , we used a Ricordi chamber (50 ml) to digest the tissue. During digestion, we manually shook the Ricordi chamber3 at an intensity that varied by specimen according to its level of tissue fibrosis. A discontinous Ficoll gradient was then used to separate the islets from acinar tissue. We noted that the tissue pellet should be small enough to be homogenously resuspended in Ficoll medium with a density of 1.125 g/ml. After isolation, we cultured the islets under stress free conditions (no shaking or rotation) with 5% CO2 at 37 &deg;C for at least 48 h in order to facilitate their functional recovery. Widespread application of our protocol and its future improvement could enable the timely harvesting of large quantities of human islets from diabetic and clinically matched non-diabetic subjects, greatly advancing type 2 diabetes research.

The supply of type 2 diabetic islets for research is insufficient. Here we share our protocol for isolating islets from patients undergoing partial pancreatectomy. This approach represents a unique venue for obtaining islets from type 2 diabetic and clinically matched non-diabetic subjects in adequate numbers for basic and clinical studies.

Isolamento di isole umane da pazienti parzialmente Pancreatectomized

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

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A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

Enucleation is the process of retrieving the ocular globe from a cadaveric donor leaving the rest of the globe undisturbed. Excision refers to the retrieval of ocular tissues, especially cornea, by cutting it separate from the ocular globe. Evisceration is the process of removing the internal organs referred here as retina. The ocular globe consists of the cornea, the sclera, the vitreous body, the lens, the iris, the retina, the choroid, muscles etc (Suppl. Figure 1). When a patient is suffering from corneal damage, the cornea needs to be removed and a healthy one must be transplanted by keratoplastic surgeries. Genetic disorders or defects in retinal function can compromise vision. Human ocular globes can be used for various surgical procedures such as eye banking, transplantation of human cornea or sclera and research on ocular tissues. However, there is little information available on human corneal and retinal excision, probably due to the limited accessibility to human tissues. Most of the studies describing similar procedures are performed on animal models. Research scientists rely on the availability of properly dissected and well-conserved ocular tissues in order to extend the knowledge on human eye development, homeostasis and function. As we receive high amount of ocular globes out of which approximately 40% (Table 1) of them are used for research purposes, we are able to perform huge amount of experiments on these tissues, defining techniques to excise and preserve them regularly.
The cornea is an avascular tissue which enables the transmission of light onto the retina and for this purpose should always maintain a good degree of transparency. Within the cornea, the limbus region, which is a reservoir of the stem cells, helps the reconstruction of epithelial cells and restricts the overgrowth of the conjunctiva maintaining corneal transparency and clarity. The size and thickness of the cornea are critical for clear vision, as changes in either of them could lead to distracted, unclear vision. The cornea comprises of 5 layers; a) epithelium, b) Bowman's layer, c) stroma, d) Descemet's membrane and e) endothelium. All layers should function properly to ensure clear vision4,5,6. The choroid is the intermediate tunic between the sclera and retina, bounded on the interior by the Bruch's membrane and is responsible for blood flow in the eye. The choroid also helps to regulate the temperature and supplies nourishment to the outer layers of the retina5,6. The retina is a layer of nervous tissue that covers the back of the ocular globe (Suppl. Figure 1) and consists of two parts: a photoreceptive part and a non-receptive part. The retina helps to receive the light from the cornea and lens and converts it into the chemical energy eventually transmitted to the brain with help of the optic nerve5,6.
The aim of this paper is to provide a protocol for the dissection of corneal and retinal tissues from human ocular globes. Avoiding cross-contamination with adjacent tissues and preserving RNA integrity is of fundamental importance as such tissues are indispensable for research purposes aimed at (i) characterizing the transcriptome of the ocular tissues, (ii) isolating stem cells for regenerative medicine projects, and (iii) evaluating histological differences between tissues from normal/affected subjects. In this paper we describe the technique we currently use to remove the cornea, the choroid and retinal tissues from an ocular globe. Here we provide a detailed protocol for the dissection of the human ocular globe and the excision of corneal and retinal tissues. The accompanying video will help researchers to learn an appropriate technique for the retrieval of precious human tissues which are difficult to find regularly.

A Simplified Technique for In situ Excision of Cornea and Evisceration of Retinal Tissue from Human Ocular Globe

The paper describes a simplified technique to excise corneal and to eviscerate retinal tissues from the ocular globe of human cadaveric donors. The technique described here will help to excise good quality tissues to be used for transplantation, surgical or research purposes without damaging other tissues of the ocular globe.

Una tecnica semplificata per<em&gt; In situ</emEscissione&gt; della cornea e l&#39;eviscerazione del tessuto retinico dal globo oculare umano

Enucleation is the process of retrieving the ocular globe from a cadaveric donor leaving the rest of the globe undisturbed. Excision refers to the ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly effective. This video describes the percutaneous biopsy technique using a modified Bergstr&#246;m needle to obtain skeletal muscle tissue samples from the vastus lateralis of human subjects. The Bergstr&#246;m needle consists of an outer cannula with a small opening (&#8216;window&#8217;) at the side of the tip and an inner trocar with a cutting blade at the distal end. Under local anesthesia and aseptic conditions, the needle is advanced into the skeletal muscle through an incision in the skin, subcutaneous tissue, and fascia. Next, suction is applied to the inner trocar, the outer trocar is pulled back, skeletal muscle tissue is drawn into the window of the outer cannula by the suction, and the inner trocar is rapidly closed, thus cutting or clipping the skeletal muscle tissue sample. The needle is rotated 90&#176;&#160;and another cut is made. This process may be repeated three more times. This multiple cutting technique typically produces a sample of 100-200 mg or more in healthy subjects and can be done immediately before, during, and after a bout of exercise or other intervention. Following post-biopsy dressing of the incision site, subjects typically resume their activities of daily living right away and can fully participate in vigorous physical activity within 48-72 hr. Subjects should avoid heavy resistance exercise for 48 hr to reduce the risk of herniation of the muscle through the incision in the fascia.

The purpose of this video is to present the modified Bergstr&#246;m skeletal muscle biopsy technique on human subjects.

Scheletrici Procedure biopsia muscolare dell&#39;uomo con la tecnica Bergström Modificato

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and VII). Due to its autofluorescence, opaqueness, and thickness, it has not been found suitable for confocal microscopy. An alternative approach to the one presented here, which uses formalin-fixed sclera embedded in paraffin for immunohistochemistry, has technical challenges, especially when preheating the tissue for antigen retrieval. Since the sclera is relatively poor in both cells and vessels, the use of larger tissue samples was explored to help prevent overlooking cells and to understand their localization in relation to vessels and other anatomical sites. To allow for the analysis of larger tissue samples under the confocal microscope, a laminating technique was performed to create thin layers from the sclera. Following the analysis of results of CD31 blood vessels and lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1) positive cells, for which approval for scientific examination was obtained, the advantages and limitations of this method are discussed.

Human sclera tissue is mainly collagen; therefore, it is not easily usable for immunohistochemistry. To achieve the goal of performing immunohistochemistry for confocal microscopy of scleral tissue, a laminating technique was used.

Utilizzando una tecnica di laminazione per l&#39;esecuzione di Microscopia confocale della sclera umana


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include supporting mastication and deglutition, as well as taste-sensing and phonetics. Accordingly, the strength and volume of the tongue can impact the ability of vertebrates to accomplish basic activities such as feeding, communicating, and breathing. Human patients with sleep apnea have enlarged tongues, characterized by reduced muscle tone and increased intramuscular fat that can be visualized and quantified by magnetic resonance imaging (MRI). The abilities to measure force generation and viscoelastic properties of the tongue constitute important tools for obtaining functional information to correlate with imaging data. Here, we present techniques for measuring tongue force production in anesthetized Zucker rats via electrical stimulation of the hypoglossal nerves and for determining the viscoelastic properties of the tongue by applying passive Lissajous force/deformation curves.

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

We describe a surgical procedure in an anesthetized rat model for determining the muscle tone and viscoelastic properties of the tongue. The procedure involves specific stimulation of the hypoglossal nerves and application of passive Lissajous force/deformation curves to the muscle.

Valutazione in vivo delle proprietà meccaniche e viscoelastiche del linguaggio del ratto

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

Technique of Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice for Induction of Left Ventricular Hypertrophy

Transverse aortic constriction (TAC) in mice is one of the most commonly used surgical techniques for experimental investigation of pressure overload-induced left ventricular hypertrophy (LVH) and its progression to heart failure. In the majority of the reported investigations, this procedure is performed with intubation and ventilation of the animal which renders it demanding and time-consuming and adds to the surgical burden to the animal. The aim of this protocol is to describe a simplified technique of minimally invasive TAC without intubation and ventilation of mice. Critical steps of the technique are emphasized in order to achieve low mortality and high efficiency in inducing LVH.
Male C57BL/6 mice (10-week-old, 25-30 g, n=60) were anesthetized with a single intraperitoneal injection of a mixture of ketamine and xylazine. In a spontaneously breathing animal following a 3-4 mm upper partial sternotomy, a segment of 6/0 silk suture threaded through the eye of a ligation aid was passed under the aortic arch and tied over a blunted 27-gauge needle. Sham-operated animals underwent the same surgical preparation but without aortic constriction. The efficacy of the procedure in inducing LVH is attested by a significant increase in the heart/body weight ratio. This ratio is obtained at days 3, 7, 14 and 28 after surgery (n = 6 - 10 in each group and each time point). Using our technique, LVH is observed in TAC compared to sham animals from day 7 through day 28. Operative and late (over 28 days) mortalities are both very low at 1.7%.
In conclusion, our cost-effective technique of minimally invasive TAC in mice carries very low operative and post-operative mortalities and is highly efficient in inducing LVH. It simplifies the operative procedure and reduces the strain put on the animal. It can be easily performed by following the critical steps described in this protocol.

The aim of this protocol is to describe step-by-step the technique of minimally invasive transverse aortic constriction (TAC) in mice. By elimination of intubation and ventilation which are mandatory for the commonly used standard procedure, minimally invasive TAC simplifies the operative procedure and reduces the strain put on the animal.

Tecnica di costrizione aortico trasversale mininvasiva in topi per induzione dell'ipertrofia ventricolare sinistra

Transverse aortic constriction (TAC) in mice is one of the most commonly used surgical techniques for experimental investigation of pressure ...

Taste Exam: A Brief and Validated Test

The emerging importance of taste in medicine and biomedical research, and new knowledge about its genetic underpinnings, has motivated us to supplement classic taste-testing methods in two ways. First, we explain how to do a brief assessment of the mouth, including the tongue, to ensure that taste papillae are present and to note evidence of relevant disease. Second, we draw on genetics to validate taste test data by comparing reports of perceived bitterness intensity and inborn receptor genotypes. Discordance between objective measures of genotype and subjective reports of taste experience can identify data collection errors, distracted subjects or those who have not understood or followed instructions. Our expectation is that fast and valid taste tests may persuade researchers and clinicians to assess taste regularly, making taste testing as common as testing for hearing and vision. Finally, because many tissues of the body express taste receptors, taste responses may provide a proxy for tissue sensitivity elsewhere in the body and, thereby, serve as a rapid, point-of-care test to guide diagnosis and a research tool to evaluate taste receptor protein function.

This protocol measures human taste responses and includes a brief anatomical assessment, a short taste test, and a validation method using the subject&#39;s reported sensation and taste receptor genotype.

Esame gustativo: Un Test breve e convalidato

The emerging importance of taste in medicine and biomedical research, and new knowledge about its genetic underpinnings, has motivated us to supplement ...

Standardized Technique of Aortic Valve Re-implantation for Valve-sparing Aortic Root Replacement

Despite the obvious advantages of the preservation of a normal aortic valve during aortic root replacement, the complexity of valve sparing procedures prevents a number of cardiac surgeons from incorporating them into their practice. The aim of this protocol is to describe a simplified and user-friendly technique of an aortic valve-sparing root replacement (VSRR) procedure by re-implantation of the aortic valve. Proper selection of patients and limitations of the technique are discussed.
In 54 consecutive patients, normal appearing aortic valves were re-implanted in a commercially available polyester prosthesis with pre-shaped sinuses by a simplified and standardized technique. Placement of the first row of the proximal suture line, choice of the prosthesis size, and adjustment of the height of the commissures of the patient to the fixed height of the sinus portion of the prosthesis were slightly modified from the reference techniques with the aim of increasing its feasibility for use by other cardiac surgeons. Early mortality and morbidity as well as 5-year survival, freedom from aortic valve reoperation, and freedom from recurrent moderate regurgitation were collected in all patients.
Thirty-day mortality, re-sternotomy for bleeding, re-sternotomy for mediastinitis, and the incidence of stroke were very low, 1.8% for each (1 of 54). No patient required permanent pace-maker implantation. At 5 years, survival, freedom from aortic valve reoperation, and freedom from recurrent moderate regurgitation were 97.5%, 95.2%, and 91.6%, respectively.
Mid-term results of our standardized technique of re-implantation of the aortic valve for valve-sparing aortic root replacement are very good and compare with more complex techniques reported by experienced surgeons. By following the present protocol of the standardized re-implantation technique, a greater number of cardiac surgeons can perform this procedure with comparable good results.

Valve-sparing aortic root replacement has the advantage of preserving the patient&#39;s own aortic valve. The complexity of the reported techniques to date restricts their use to a limited number of cardiac surgeons. This protocol describes step-by-step a standardized technique reproducible by a greater number of cardiac surgeons.

Sostituzione della radice tecnica standardizzata di re-impianto di valvola aortica per risparmiatori di valvola aortica

Despite the obvious advantages of the preservation of a normal aortic valve during aortic root replacement, the complexity of valve sparing procedures ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal pigment epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera, the integrity of the fragile retina can easily be compromised. The aim of this study was to develop a novel HORC model that contains the retina, RPE-choroid and sclera to maintain retinal integrity when culturing retinal explants.
After cutting circumferentially along the limbus to remove iris and lens, four deep incisions were made to flatten the eyecup. In contrast to previous HORC protocols, a trephine was used to cut through not only the retina but also the RPE-choroid and sclera. The resultant triple-layered explants were cultured for 72 h. Hematoxylin and Eosin staining (H&#38;E) was used to assess anatomical structures and retinal explants were further characterized by immunohistochemistry (IHC) for apoptosis, M&#252;ller cell integrity and retinal inflammation. To confirm the possibility of disease induction, explants were exposed to high glucose (HG) and pro-inflammatory cytokines (Cyt), to mimic diabetic retinopathy (DR). The Luminex magnetic bead assay was used to measure DR-related cytokines released into the culture medium.
H&#38;E staining revealed distinct retinal lamellae and compact nuclei in retinal explants with the underlying RPE-choroid and sclera, while retinas without the underlying structures exhibited reduced thickness and severe nuclei loss. IHC results indicated absence of apoptosis and retinal inflammation as well as preserved M&#252;ller cell integrity. The Luminex&#160;assays showed significantly increased secretion of DR-associated pro-inflammatory cytokines in retinal explants exposed to HG + Cyt relative to baseline levels at 24 h.
We successfully developed and characterized a novel HORC protocol in which retinal integrity was preserved without apoptosis or retinal inflammation. Moreover, the induced secretion of DR-associated pro-inflammatory biomarkers when exposing retinal explants to HG + Cyt suggests that this model could be used for clinically translatable retinal disease studies.

This study aims to develop a novel human organotypic retinal culture (HORC) model that prevents compromising retinal integrity during explant handling. This is achieved by culturing the retina with the overlying vitreous and the underlying retinal pigment&#160;epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera.

Caratterizzazione di una nuova tecnica di coltura retinica organotipica umana

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Psychophysical Tracking Method to Assess Taste Detection Thresholds in Children, Adolescents, and Adults: The Taste Detection Threshold (TDT) Test

This paper describes a two-alternative, forced-choice, staircase, tracking procedure, called the Taste Detection Threshold (TDT) test, that provides a reliable measure of sweet, salty, and umami taste detection thresholds from childhood to adulthood. Advantages of the method include procedures that are identical for children and adults, thus allowing the determination of age-related and individual differences in taste perception, if any, and tasks that can be completed in a relatively short time frame, do not rely on continuous attention or require memorization, control for subjective response biases, and minimize the impact of language development. After a 1 hour fast, participants are presented with pairs of solutions; in each pair, one solution is water, and the other solution contains varying concentrations of the tastant.
Using a whole-mouth tasting method, participants taste each solution (without swallowing and with rinsing between tastings) and then point to the solution with a taste or that tastes different from water. The concentration of the stimulus in the subsequent pair increases after a single incorrect response and decreases after two consecutive correct responses. A reversal occurs when the concentration sequence changes direction. The task is deemed completed after the occurrence of four reversals, provided there are a maximum of two dilution steps between two successive reversals, and the series of reversals do not form an ascending pattern. These additional criteria ensure greater reliability in outcomes. The TDT is then calculated as the geometric mean of the concentrations of the four reversals. This method has real-world relevance as it provides information on a dimension of taste perception that is independent of hedonics, and that can change with aging and certain disease states, making it a valuable psychophysical test.

Psychophysical Tracking Method to Assess Taste Detection Thresholds in Children, Adolescents, and Adults: The Taste Detection Threshold TDT Test

Psychophysical tools measure the functionality of the taste system for both research and health assessment purposes. This paper describes a method to measure taste detection thresholds that can determine the lowest concentration of sucrose, sodium chloride, or monosodium glutamate that can be tasted by individuals as young as 6 years.

Metodo di monitoraggio psicofisico per valutare le soglie di rilevamento del gusto in bambini, adolescenti e adulti: il test della soglia di rilevamento del gusto (TDT)

This paper describes a two-alternative, forced-choice, staircase, tracking procedure, called the Taste Detection Threshold (TDT) test, that provides a ...