O apoio do Instituto Australiano de Ciência Nuclear e Engenharia é reconhecido. TCK foi o ganhador de prêmios AINSE. Lab Medicine epigenômico é suportado pelo National Health and Medical Research Council of Australia (566.559). Este trabalho é financiado pelo CRC para Biomédica imagem Development Ltd, criado e apoiado em Centros de o Governo australiano de Pesquisa Cooperativa (CRC) do programa. LM é apoiada por Melbourne Research (University of Melbourne) e Biomedical Imaging bolsas complementares CRC. O apoio de Monash Micro Imaging (Drs. Stephen Cody e ISKA Carmichael) foi inestimável para este trabalho.

Preparação celular <ol><li> Humana erythroleukemic K562 células são cultivadas em RPMI-1640 meio suplementado com 10% (v / v) de soro fetal bovino e 20 mg / ml de gentamicina em um 5% CO 2 umidificado ambiente a 37 ° C. </li><li> Aproximadamente 18 horas antes da coloração lavar exponencialmente células de crescimento (ideal a 5 x 10 5 células / ml) com tampão fosfato salino (PBS), ressuspender em novas mídias e voltar para 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Lave as células duas vezes com PBS por centrifugação a aproximadamente 1500 rpm por 5 minutos e ressuspender em mídia fresco. </li><li> Contagem de células e ajustar a densidade da célula para aproximadamente 5 x 10 5 células / ml. </li></ol> As células podem ser contadas, quer por um método automatizado (por exemplo, Sysmex ou Coulter contador com o tamanho do filtro entre 5 a 20 microns) ou usando o método de exclusão pelo azul de tripan e um hemocitómetro. Número excessivo de células (&gt; 800 células / cm 2) pode levar a coloração não uniforme. Irradiação e imunofluorescência <ol><li> Montar clips cytospin, cartões de filtro e slides com uma rotulagem adequada. </li></ol> Ao montar o aparelho cytospin garantir que o buraco na placa de filtro coincide com o funil. <ol start="2"><li> Expor as células a qualquer radiação γ ou raios-X (2Gy neste exemplo). </li></ol> Para evitar a formação de focos durante a irradiação, manter as células no gelo por 5 a 10 minutos antes e durante a irradiação. Irradiação seguintes incubar as células a 37 ° C, 5% CO 2 durante o tempo necessário (para níveis de pico γH2AX 30 minutos a 1 hora; uma hora, neste exemplo). <ol start="3"><li> Lave as células duas vezes com frio PBS por centrifugação e ressuspender em PBS fresco. </li><li> Dispense 100-150 mL da suspensão de células em cada funil cytospin e girar a 500 rpm por 5 minutos. </li><li> Separar os slides de cytospins e permitir que as células a moderadamente o ar seco por aproximadamente 15 minutos. </li></ol> Não deixe secar completamente as células como a morfologia celular pode se desintegrar. <ol start="6"><li> Desenhar um círculo em torno das células com uma caneta hidrofóbica. </li><li> Fix células com paraformaldeído 4% por 5 minutos em temperatura ambiente (RT). </li></ol> Em nossa experiência, a fixação com paraformaldeído é superior à fixação com etanol ou metanol. Células em suspensão necessidade de fixação por 5 minutos em temperatura ambiente enquanto que a fixação vezes mais (15 a 20 minutos) são necessários para a fixação ideal de células aderentes. Nós achamos que a coloração imediatamente produz melhores resultados do que armazenar a lâminas a -20 ° C, que normalmente resulta em alta fluorescência de fundo. <ol start="8"><li> Lave as células duas vezes com PBS por 5 minutos cada. </li><li> Permeabilizar as células com 0,1% Triton X-100 na RT por 5 minutos. </li></ol> Em comparação com Tween-80 que normalmente observam sinais de melhor em células permeabilizadas com Triton-X 100. Dependendo do tipo de célula que pode ser necessário alterar a hora permeabilisation. Por exemplo, em células K562 permeabilização por 5 minutos em temperatura ambiente é suficiente enquanto que em células aderentes uma permeabilização 15 minutos é necessário. <ol start="10"><li> Lave as células três vezes com PBS por 5 minutos cada. </li><li> Bloco de células em BSA 1% por 30 minutos (3 x 10 minutos) em temperatura ambiente. </li></ol> Nós comparamos a eficiência de bloqueio usando soro (derivado de mesma espécie que os anticorpos secundários) e soro albumina bovina em PBS. BSA foi mais eficiente na redução de ligação não específica de anticorpos secundário em comparação com soro. Nós comparamos diferentes tempos de bloqueio, bloqueio durante a noite a 4 ° C em comparação com 3 x 10 minutos e 3 x 20 minutos passos bloqueio à temperatura ambiente, e determinou que o bloqueio de 3 x 10 minutos, foi ótimo. <ol start="12"><li> Adicionar 50 mL de anticorpo primário (1: 500 diluído em BSA 1%) para cada slide. </li></ol> Incubação com anticorpo primário em RT por 60 minutos resulta em coloração de fundo reduzido em comparação com uma incubação overnight a 4 ° C. <ol start="13"><li> A mancha diferentes marcadores usar simultaneamente anticorpos produzidos em diferentes espécies (por exemplo, anti-rato e coelho γH2AX H3K4 anti-metilado, neste exemplo). </li><li> Incube com anticorpos primários por 90 minutos em temperatura ambiente em uma plataforma de balanço de 250 rpm. </li></ol> Todas as incubações são realizadas em uma calha de coloração umidificado. <ol start="15"><li> Lave as células três vezes com PBS por 5 minutos cada. </li><li> Adicionar 50 mL de (1: 1000 diluído em BSA 1%) anticorpo secundário para cada slide. </li></ol> A mancha de marcadores diferentes no mesmo slide utilizam anticorpos secundários com despecificidade de espécie IFERENTES (de acordo com o anticorpo primário) e fluorescência de emissão de comprimento de onda (por exemplo, anti-mouse Alexa 488 (verde) e anti-coelho Alexa-546 (vermelho), neste exemplo). <ol start="17"><li> Incubar as células durante 60 minutos a RT em uma plataforma de balanço de 250 rpm. </li></ol> Recomenda-se incubar as células em uma câmara escura úmido para evitar o desbotamento e secagem do anticorpo secundário. <ol start="18"><li> Lave as células três vezes com PBS por 5 minutos cada. </li><li> Adicionar 50 mL de (1:500 diluídos em PBS) TOPRO-3 para cada slide. </li><li> Lavagem das lâminas com PBS para 3X de 5 minutos. </li><li> Retire o excesso de umidade a partir de slides e adicionar anti-fade solução. </li></ol> Recomenda-se não secar completamente antes de adicionar células anti-fade solução. <ol start="22"><li> Lamela, vedação com esmalte de unha e deixar slides durante a noite no escuro à temperatura ambiente. </li></ol> É recomendado o uso de confocal lamínulas específica # 1.5 (0,16-19 mícrons de espessura) e unha polonês claro. Ao colocar a lamela no slide, os cuidados devem ser tomados para evitar a formação de bolhas de ar. Aquisição de imagem <ol><li> A Zeiss Microscópio Confocal LSM510 Meta é usado para adquirir imagens usando o padrão GFP (verde, 488 nm), PI (vermelho 543 nm) e lasers vermelho distante (azul 633 nm). </li></ol> Imagens obtidas utilizando um microscópio confocal revelar melhor resolução espacial. Desde o tamanho do γH2AX focos pode ser inferior a 0,5 μicrons, recomenda-se para adquirir imagens com pelo menos um tamanho de passo 0,5 μicron ao longo do eixo Z. A 63 de óleo x lente objetiva de imersão é o preferido em comparação com qualquer ampliação maior ou menor. Para as células de imagem para muitos focos de contagem é preferível usar uma velocidade de digitalização de 8 e tamanho da imagem de 1024 x 1024 pixels. Para ilustrar a relação espacial entre diferentes proteínas nucleares, é recomendado o uso de uma velocidade de digitalização de 6 com o tamanho da imagem de 2048 x 2048 pixels. Quando imagem em diversos canais de uma aquisição scan line é recomendado em comparação com uma varredura frame. Isto evita o branqueamento e melhor resolução é alcançada. A varredura sequencial é usado para impedir sangrar por entre os canais. Contagem de focos Análise de imagem e contando focos pode ser realizada usando vários pacotes de software (inlcuding Metamorph, Image-J e Imaris). O procedimento para a contagem de focos usando Metamorph é descrito aqui. <ol><li> Abra γH2AX pilhas de imagens diretamente no menu arquivo ou usando o número de compilação opção stacks. </li><li> Ir para Processo menu e escolher a aritmética pilha. </li><li> Escolheu máxima de projeção e selecione os aviões a serem incluídos e clique em OK. </li><li> Salvar a imagem resultante como um Tiff γH2AX. arquivo e abra a imagem TOPRO-3 (azul). </li><li> Ir para regiões e selecione uma ferramenta de desenho e desenhar região regiões ao redor do núcleo. </li><li> Clique na imagem γH2AX Tiff e vá para o menu de processo e selecionar os filtros morfológicos. </li><li> Top Hat escolheu e selecione imagem γH2AX como uma imagem de origem. </li><li> Aplicar Top Hat-filtro e imagem resultante será uma imagem binária com menos ruído e redução da variação na intensidade de focos. </li></ol> Cuidados devem ser tomados ao escolher Top Hat-valores. Valores ótimos podem ser obtidos por comparação visual de imagens de antes e depois da aplicação de filtros. <ol start="9"><li> Vá para o menu de processo e selecionar a imagem limiar. </li><li> Escolha limiar inclusiva e selecionar os valores limite inferior e superior. </li></ol> É tipicamente os valores limite que afetam o número de focos. Portanto, muita atenção é necessária quando a seleção de valores limite. Isto pode ser melhor alcançada pelo número de focos de contagem utilizando limiares diferentes nas células expostas à inferior a 2 Gy de radiação γ-e então comparar os números de focos com a contagem manual (por olho). O limiar ideal é aquele que minimiza a inclusão de fundo e maximiza a inclusão de focos. <ol start="11"><li> Selecione a imagem TOPRO-3 e ir para o menu regiões e selecione a opção de transferência de regiões. Selecione a imagem de origem como TOPRPO-3 e do destino como Top Hat e clique em OK. </li><li> Uma vez que as regiões nuclear são transferidos para a imagem Top Hat-ir para o menu e selecione medida Morfometria Análise Integrada. </li><li> Na janela pop-up selecione fonte de imagem-Top Hat e medida pela área. </li><li> Selecione medir todas as regiões e clique em medida para obter o número de focos em todos os núcleos correspondentes na imagem Top Hat. </li><li> Os números de focos de cada região podem ser exportados para um arquivo MS-Excel usando a opção de log de dados. </li></ol> 3Dreconstrução de imagens Para criar uma imagem 3D a partir de uma pilha usando Metamorph: <ol><li> Vá para o menu pilha e escolha de reconstrução 3D. </li><li> Selecionar o ângulo de rotação (por exemplo, 160 °, 320 °). </li><li> Selecione o tipo de reconstrução 3D máximo. </li><li> Escolheu o plano de rotação (horizontal ou vertical). </li><li> Escolheu a distância Z-calibração. </li></ol> É preferível utilizar o usuário especificado Z-distância (ideal é de 0,5 μicrons). <ol start="6"><li> Escolheu OK para criar uma reconstrução 3D. </li></ol> Linha de varredura análise Para a análise de linha de varredura usando Metamorph: <ol><li> Abra uma imagem qualquer plano único ou um arquivo empilhados. </li><li> Ir para a medida de comando barras de ferramentas e selecione a análise scan line. </li><li> Desenhar uma linha sobre a célula e esta será automaticamente revelam a intensidade de fluorescência e distância de cada marcador ao longo do trajeto da linha. </li></ol> Para elucidar a relação espacial dos marcadores de cromatina vários, por exemplo, γH2AX focos e metilação das histonas, é preferível para desenhar linhas que abrangem regiões que são densas e pobres destes marcadores. Dados representativos Para os fins desta demonstração foram utilizados anticorpos para γH2AX focos e H3K4me, para avaliar a distribuição espacial da LAP para um determinante de epigenética ativamente transcrever eucromatina. Como mostrado na figura 1, após irradiação com 2Gy, γH2AX focos formado predominantemente em regiões que foram maçante tanto para coloração H3K4me e para o DNA da mancha TOPRO-3 (brilhantemente regiões do DNA são indicativos manchadas de heterocromatina). <img src="/files/ftp_upload/2203/2203fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. ΓH2AX forma focos predominantemente em eucromatina em resposta à radiação ionizante. (A) visualização de imunofluorescência γH2AX focos (verde) em humanos erythroleukemic K562 células, uma hora após a irradiação γ-(2 Gy). γH2AX focos são mostrados em relação ao H3K4me, representando ativamente transcrever eucromatina (vermelho). DNA é rotulado com TOPRO-3 (azul). A imagem mesclada (azul, vermelho e verde) demonstra a exclusão γH2AX focos de regiões heterocromáticas. A análise varredura de linha (distância vs intensidade de fluorescência) indica a distribuição relativa dos marcadores em um único plano. (B) Slices em diferentes planos da reconstrução 3D a imagem mesclada descrito acima.

<ol>
	<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo.">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).</li><li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139.">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li><li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Rev Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li><li>Dickey, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX:+functional+roles+and+potential+applications.">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).</li><li>Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+is+refractory+to+gamma-H2AX+modification+in+yeast+and+mammals.">Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals.</a> J Cell Biol. 178 (2), 209-218 (2007).</li><li>Cowell, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gammaH2AX+foci+form+preferentially+in+euchromatin+after+ionising-radiation.">gammaH2AX foci form preferentially in euchromatin after ionising-radiation.</a> PLoS One. 2 (10), e1057-e1057 (2007).</li><li>Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., &amp;amp, I. l. i. a. k. i. s., G, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-H2AX+in+recognition+and+signaling+of+DNA+double-strand+breaks+in+the+context+of+chromatin.">Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin.</a> Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).</li><li>Vasireddy, R. S., Karagiannis, T. C., El-Osta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gamma-radiation-induced+gammaH2AX+formation+occurs+preferentially+in+actively+transcribing+euchromatic+loci.">gamma-radiation-induced gammaH2AX formation occurs preferentially in actively transcribing euchromatic loci.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (2), 291-294 (2010).</li><li>Goodarzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+signaling+facilitates+repair+of+DNA+double-strand+breaks+associated+with+heterochromatin.">ATM signaling facilitates repair of DNA double-strand breaks associated with heterochromatin.</a> Mol Cell. 31 (2), 167-177 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640)</td>
<td>Growth medium</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>22400071</td>
<td>RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20&#x03BC;g/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N&#x2019;-2-Ethanesulfonic Acid</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F2442</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A7906</td>
<td>BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS (without Ca2+ and Mg2+)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17-517Q</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypan blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>T6146</td>
<td>Used to distinguish between live and dead cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8787</td>
<td>Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>158127</td>
<td>Paraformaldehyde (4%) used to fix cells.</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody</td>
<td>Primary Antibody</td>
<td>Millipore, USA</td>
<td>16193</td>
<td>Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>HistoneH3 (Mono-methyl K4) </td>
<td>Primary Antibody</td>
<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
<td>AB8895</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
<td>Secondary Antibody</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>11029</td>
<td>Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA.</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
<td>Secondary Antibody</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>11035</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TOPRO3</td>
<td>DNA Stain</td>
<td>Invitrogen, USA</td>
<td>T3605</td>
<td>TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser. </td>
</tr>
<tr>
<td>ProLong Gold </td>
<td>Anti-fade solution</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P36930</td>
<td>This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index.</td>
</tr>
<tr>
<td>Polylysine slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Menzel-Gl&#228;ser, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverslips (22x50mm)</td>
<td>Coverslips</td>
<td>Menzel-Gl&#228;ser, Germany</td>
<td>CS2250100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tissue Culture Flask, Vented Cap</td>
<td>Culture Flask</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>353112</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shandon Cytospin 4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ThermoElectron Corp</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytofunnels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Shandon, Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filter Cards </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Shandon, Inc</td>
<td>353025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coplin Jar, glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>1771-OG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Staining Trough</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grale Scientific P/L</td>
<td>V1991.99</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PAP Pen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zymed Laboratories, Invitrogen</td>
<td> 008877</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gammacell 1000 Elite Irradiator</td>
<td>Gamma Irradiator</td>
<td>Nordion International Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zeiss LSM 510 Meta Confocal</td>
<td>Confocal Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm.</td>
</tr>
<tr>
<td>Metamorph</td>
<td>Software for Imaging analysis</td>
<td>Molecular Devices, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

evaluation of the spatial distribution of &gamma;h2ax following ionizing radiation

Uma resposta rápida molecular de DNA de fita dupla-breaks (LAP) é a fosforilação da Ser-139 resíduos dentro do tema SQEY terminal do 1,2 H2AX histonas. Esta fosforilação de H2AX é mediada pela fosfatidil-inosito 3-quinase (PI3K) família de proteínas, ataxia telangiectasia mutantes (ATM), subunidade proteína-quinase DNA catalítico e ATM e Rad3 relacionados (ATR) 3. A forma fosforilada da H2AX, referido como γH2AX, se espalha para regiões adjacentes da cromatina a partir do site do DSB, formando focos discretos, que são facilmente visualizados por microscopia immunofluorecence 3. Análise e quantificação de γH2AX focos tem sido amplamente utilizada para avaliar DSB formação e reparação, especialmente em resposta à radiação ionizante e para avaliar a eficácia da radiação modificando vários compostos e compostos citotóxicos 4. Dada a especificidade e sensibilidade requintada deste marcador de novo de LAP, tem fornecido novos insights sobre os processos de danos no DNA e reparo no contexto da cromatina. Por exemplo, na biologia da radiação, o paradigma central é que o DNA nuclear é o alvo crítico com relação à sensibilidade à radiação. Na verdade, o consenso geral no campo tem sido em grande parte para ver cromatina como um modelo homogêneo para danos no DNA e reparo. No entanto, com o uso de γH2AX como marcador molecular de LAP, uma disparidade de γ-induzida por irradiação formação γH2AX focos em eucromatina e heterocromatina foi observada 5-7. Recentemente, foi utilizado um painel de anticorpos para mono-, di-ou tri-metilados histona H3 em lisina 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3), que são marcas epigenéticas de heterocromatina constitutiva e silenciamento transcricional e lisina 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 ), que estão fortemente correlacionados ativamente transcrever regiões eucromáticos, para investigar a distribuição espacial da radiação ionizante γH2AX seguintes 8. De acordo com as idéias predominantes em relação à biologia da cromatina, nossos resultados indicaram uma estreita correlação entre a formação γH2AX e transcrição ativa 9. Aqui nós demonstramos o nosso método de imunofluorescência para detecção e quantificação de γH2AX focos em células não aderentes, com um foco particular em co-localização com outros marcadores epigenéticos, análise de imagens e modelagem 3D.

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Evaluation of the Spatial Distribution of &amp;#947;H2AX following Ionizing Radiation

Análise microscópica de γH2AX focos, que formam após a fosforilação de H2AX em Ser-139 em resposta ao DNA dupla fita-breaks, tornou-se uma ferramenta valiosa na biologia da radiação. Aqui usamos um anticorpo mono-metilado histona H3 em lisina 4 como um marcador epigenético ativamente de eucromatina transcrever, para avaliar a distribuição espacial da radiação induzida por formação γH2AX dentro do núcleo.

Avaliação da Distribuição Espacial da γH2AX seguintes Radiação Ionizante

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

evaluation-spatial-distribution-h2ax-following-ionizing

Research

JoVE Journal

Biology

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

12.6K visualizações.  The Alfred Medical Research and Education Precinct. Análise microscópica de γH2AX focos, que formam após a fosforilação de H2AX em Ser-139 em resposta ao DNA dupla fita-breaks, tornou-se uma ferramenta valiosa na biologia da radiação. Aqui usamos um anticorpo mono-metilado histona H3 em lisina 4 como um marcador epigenético ativamente de eucromatina transcrever, para avaliar a distribuição espacial da radiação induzida por formação γH2AX dentro do núcleo.

Vídeo: Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Quantificação de γH2AX Focos em resposta à radiação ionizante

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Biologia

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

Produção de C. elegans Transgenes via Recombineering com o GalK Marcador selecionável

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.

O método de cultura fatia para acompanhar o desenvolvimento de germes dentários Em Explant Cultura

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análise da Global RNA Síntese no nível da célula única seguinte hipóxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Imagiologia reorganização espacial de uma via de sinalização MAPK Utilizar o sistema de expressão transitória do Tabaco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.

Análise do SCAP<em&gt; N</em&gt; -glycosylation E Tráfico de Células Humanas

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro and in vivo. Fluorescent probes are particularly useful in determining the bio-distribution of administered large molecules, where the addition of a small-molecule fluorescent label is unlikely to affect the kinetics or bio-distribution of the compound. A variety of methods exist to examine bio-distribution that vary significantly in the amount of effort required and whether the resulting measurements are fully quantitative, but using multiple methods in conjunction can provide a rapid and effective system for analyzing bio-distributions.
Ex vivo whole-organ imaging is a method that can be used to quickly compare the relative concentrations of fluorescent molecules within tissues and between multiple types of tissues or treatment groups. Using an imaging platform designed for live-animal or whole-organ imaging, fluorescence within intact tissues can be determined without further processing, saving time and labor while providing an accurate picture of the overall bio-distribution. This process is ideal in experiments attempting to determine the tissue specificity of a compound or for the comparison of multiple different compounds. Quantitative tissue histology on the other hand requires extensive further processing of tissues in order to create a quantitative measure of the labeled compounds. To accurately assess bio-distribution, all tissues of interest must be sliced, scanned, and analyzed relative to standard curves in order to make comparisons between tissues or groups. Quantitative tissue histology is the gold standard for determining absolute compound concentrations within tissues.
Here, we describe how both methods can be used together effectively to assess the ability of different administration methods and compound modifications to target and deliver fluorescently labeled molecules to the central nervous system1.

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo whole-organ imaging is a rapid method for determining the relative concentrations of fluorescently labeled compounds within and between tissues or treatment groups. Conversely, quantitative fluorescence histology, while more labor intensive, allows for the quantification of the absolute tissue levels of labeled molecules.

O uso de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Imagem de órgãos inteiros e Histologia Tissue quantitativa para determinar o Bio-distribuição das moléculas fluorescente etiquetado

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved in humans and are associated with metabolic syndrome or other diseases. Examination of lipid accumulation in this organism can be carried out by fixative dyes or label-free methods. Fixative stains like Nile red and oil red O are inexpensive, reliable ways to quantitatively measure lipid levels and to qualitatively observe lipid distribution across tissues, respectively. Moreover, these stains allow for high-throughput screening of various lipid metabolism genes and pathways. Additionally, their hydrophobic nature facilitates lipid solubility, reduces interaction with surrounding tissues, and prevents dissociation into the solvent. Though these methods are effective at examining general lipid content, they do not provide detailed information about the chemical composition and diversity of lipid deposits. For these purposes, label-free methods such as GC-MS and CARS microscopy are better suited, their costs notwithstanding.

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Nile red staining of fixed Caenorhabditis elegans is a method for quantitative measurement of neutral lipid deposits, while oil red O staining facilitates qualitative assessment of lipid distribution among tissues.

Quantificação de lipídios abundância e avaliação da distribuição de lipídios em Caenorhabditis elegans por Nilo vermelho e coloração do óleo vermelho O

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.

Dosimetria para Irradiação Celular usando instalações de raios-X ortovoltage (40-300 kV)

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose ...

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) human corneal epithelial cell cultures. Cells were exposed to UV radiation and toxic doses of benzalkonium chloride (BAK), hydrogen peroxide (H2O2), and sodium dodecyl sulfate (SDS). Metabolic activity was measured using a metabolic assay. The release of inflammatory cytokines was measured using a multi-plex interleukin (IL)-1&#946;, IL-6, IL-8, and tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) assay, and cells were evaluated for viability using fluorescent dyes. 
The damaging effects of UV on cell metabolic activity and cytokine release occurred at 5 min of UV exposure for iHCEC and 20 min for pHCEC. Similar percent drops in metabolic activity of the iHCEC and pHCEC occurred after exposure to BAK, H2O2, or SDS, and the most significant changes in cytokine release occurred for IL-6 and IL-8. Microscopy of fluorescently stained iHCEC and pHCEC BAK-exposed cells showed cell death at 0.005% BAK exposure, although the degree of ethidium staining was greater in the iHCECs than pHCECs. Utilizing multiple methods of assessing toxic effects using microscopy, assessments of metabolic activity, and cytokine production, the toxicity of UV radiation and chemical toxins could be determined for both primary and immortalized cell lines.

This article describes the procedures used to evaluate the toxicity of UV radiation and chemical toxins on a primary and immortalized cell line.

Determinação da Toxicidade da Radiação UV e Produtos Químicos em Células Epiteliais Primárias e Imortalizadas da Córnea Humana

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...