Este protocolo para determinar o tamanho da ninhada e a viabilidade embrionária é usado por muitos laboratórios de C.elegans. Diminuições no tamanho bruto e na viabilidade embrionária podem indicar defeitos em processos importantes de desenvolvimento, como miose, fertilização e embriogênese. Esta técnica fornece instruções claras para pesquisadores iniciantes em C.elegans.
É relativamente simples de configurar e executar, e é um ótimo ponto de partida ao trabalhar com novas cepas mutantes. O maior desafio dessa técnica é a identificação embrionária versus embrião não fertilizado. Novos pesquisadores devem praticar a identificação de embriões, ovócitos e os diferentes estágios larvais antes de iniciar esses experimentos.
Para começar, rotule a parte de trás da placa, transfira um hermafrodita de estágio L4 individual para a placa. Certifique-se de que nenhum embrião ou outro verme seja transferido para o prato. Permita que os vermes se desenvolvam em adultos e coloque a autoprogênie por 24 horas na temperatura padrão de cultivo de 20 graus Celsius.
Marque o prato no terceiro dia. No dia seguinte, rotule um conjunto de novas placas e transfira no dia um verme individual para a nova placa. Deixe os vermes depositarem embriões por 24 horas a 20 graus Celsius.
Marque o prato no quarto dia. No terceiro dia, rotule um conjunto de novas placas e transfira os vermes individuais do dia dois para a nova placa. Deixe os vermes depositarem progênie por 24 horas a 20 graus.
Marcar o prato no quinto dia. Desenhe um padrão de grade em uma tampa de 35 milímetros usando um marcador fino. Coloque a tampa quadriculada sob a placa de teste para contagem para acompanhar os vermes previamente contados.
Usando um contador de células diferenciais, conte as larvas vivas e embriões não eclodidos dentro do quadrado individual. Para vermes nas bordas quadradas, conte com base na localização da cabeça do verme. Conte vermes com cabeças tocando as bordas superior e esquerda do quadrado.
Registre o número de larvas vivas e embriões não eclodidos em um caderno de laboratório. No quarto dia, marque a placa do segundo dia contando as larvas vivas e os embriões não eclodidos e registre-os em um caderno de laboratório. No quinto dia, marque a placa do dia três contando as larvas vivas e os embriões não eclodidos e registre-os em um caderno de laboratório.
Depois de rotular a parte de trás da placa, transfira um verme Hermafrodita L4 individual para a placa. Certifique-se de que nenhum embrião ou outro verme seja transferido para o prato. Transfira um único verme macho L4 para a placa contendo um Hermafrodita L quatro.
Deixe os vermes acasalarem e colocarem progênie por 24 horas a 20 graus Celsius. Marcar a placa para larvas vivas versus embriões não eclodidos no terceiro dia. No dia seguinte, rotule um conjunto de novas placas e transfira o hermafrodita e o macho para a nova placa.
Certifique-se de que o hermafrodita atingiu a idade adulta. Deixe os hermafroditas depositarem progênie por 24 horas a 20 graus Celsius. Marcar a placa para larvas vivas versus embriões não eclodidos no quarto dia.
No terceiro dia, rotule um conjunto de novas placas e transfira o hermafrodita e o macho para a nova placa. Deixe os vermes depositarem progênie por 24 horas a 20 graus. Marcar a placa para embriões vivos versus não eclodidos no quinto dia.
Usando um contador de células diferenciais, conte as larvas vivas e os embriões não eclodidos a partir do primeiro dia e registre-os em um caderno de laboratório. No quarto dia, conte a progênie viva e os embriões não eclodidos a partir do segundo dia e registre-os em um caderno de laboratório. Confira o prato do dia um para os machos.
Se o acasalamento ocorreu, a proporção genética esperada de hermafroditas para machos é de 50 a 50. Se no dia um prato não contiver machos, não ocorreu acasalamento entre o macho e o hermafrodita. Descarte esse par de acasalamento e registre a observação no caderno de laboratório.
No quinto dia, conte as larvas vivas e os embriões não eclodidos a partir da placa do terceiro dia e registre-os em um caderno de laboratório. O ensaio de viabilidade embrionária para N2 produziu um percentual de viabilidade de 98,9%, enquanto ele-5(e1490) e spo-11(ok79) mostraram uma redução na viabilidade embrionária com um percentual de 74,9% e 0,8%, respectivamente. O tamanho médio da ninhada de N2, him-5(e1490) e spo-11(ok79) foi determinado como sendo 217, 105 e 219, respectivamente.
O reconhecimento dos vários estágios do desenvolvimento de C.elegans é importante para dados precisos e reprodutíveis. Recomendamos familiarizar-se com o desenvolvimento de vermes usando imagens e um microscópio dissecante. Este procedimento é um ótimo primeiro passo para determinar se um gene está envolvido em um processo de desenvolvimento e pode ser seguido por análises citológicas para determinar qual processo é interrompido.
