Estamos gratos ao Professor Richard Borgens, Centro de Pesquisa Paralysis, Purdue University, para ajudar na montagem do sistema de sonda vibratória. Este estudo foi suportado pelo NIH NEI conceder 1R01EY019101 para MZ e BR, e em parte por concessões do California Institute of Medicina Regenerativa RB1-01417, NSF MCB-0951199, e por uma concessão irrestrita de Pesquisa para prevenir a cegueira, UC Davis Oftalmologia.

1. Sonda Fabricação Sondas em branco são comprados de Instrumentos de Precisão Mundial (Elgiloy / aço revestido Parileno microeletrodos) (ver «Quadro de reagentes e equipamentos específicos&quot; abaixo). A sonda é cortado 25-30 mm atrás da ponta e cerca de 5 mm de isolamento Parileno no final corte raspado com um bisturi (lâmina # 11) para garantir uma boa conexão. A sonda é montada em um conector R30 ouro utilizando eletricamente condutivo epóxi prata-carregado (por exemplo, Rite-Lok SL65) [* ver nota abaixo]. A sonda é armazenado durante a noite a temperatura ambiente para permitir que o epóxi para endurecer. Em seguida, a ponta da sonda é revestida com ouro e platina, em seguida, usando uma fonte de alimentação nano-ampères. A ponta da sonda é lavado em acetona e conectado à saída negativo de uma fonte de energia nano-ampères. A ponta da sonda é visto sob um microscópio de dissecação (x40) e colocada em primeiro lugar em solução chapeamento de ouro (dicyanoaurate de potássio (0,2% w / v Kau (CN) 2 em água destilada (dH 2 O)). Um fio de referência ligado ao positivo saída e colocados em solução completa o circuito. Uma corrente de 5 nA é aplicado por 5 min, depois aumentou para 20 nA até que a ponta é de cerca de metade do tamanho final desejado (cerca de 10-15 mm). A ponta da sonda é lavado em dH 2 O e, em seguida, colocados em solução platinizing (hidrato de ácido chloroplatinic; 1% w / v H2PtCl6 * 6H 2 O), além de chumbo (II) trihidrato de acetato (0,1% w / v Pb (CH3CO 2) 2 * 3H 2 O 2 em dH O). Uma corrente de 250 nA é aplicado por 5 min, depois aumentou para 500 nA até que a ponta é de aproximadamente 80% do tamanho final desejado. A corrente é aumentada para 1 mA e aplicada em 1 seg rajadas até o diâmetro ponta final é obtida (cerca de 30-35 mm). Finalmente, a dica é lavado em dH 2 O. Sondas podem ser armazenar à temperatura ambiente por tempo indeterminado. Se sondas estão danificados, o ouro R30 conectores podem ser reutilizados. [* Nota: Alguns sistemas têm sonda a sonda de montagem conectado diretamente ao amplificador para transportar o sinal. Outros sistemas têm um outro ponto de montagem eo conector de sinal. Neste último caso, um fio (2-3 cm) curto com um conector R30 em uma extremidade é soldada ao conector R30 primeiro antes da montagem da sonda (ver Figura 2A).] 2. Sistema de sonda A sonda é conectada a um bender piezo-elétrico montado em um 3-dimensional posicionador micro (Figura 1). Vibração sonda é controlada pelo fornecimento de energia vibrando sonda que também permite o ajuste da amplitude de vibração e frequência. A fonte de alimentação da sonda envia um sinal de referência para o amplificador lock-in, que também exibe a freqüência de vibração e ângulo de fase. Também é útil para conectar um osciloscópio de modo um tem uma referência visual rápida da vibração da sonda. O sinal da sonda vai para o amplificador lock-in. A sonda e amostra a ser medida pode ser visto com um microscópio de dissecação (ampliação x6 para x40), com iluminação de fibra ótica. Durante as medições de calibração e de amostra, uma referência e um fio terra (terra) deve estar na solução (ver Figura 2B). O amplificador é conectado a um computador através de um analógico-digital interface (i / o). Os dados são gravados usando o programa Strathclyde Eletrofisiologia Software de células inteiras (WinWCP). Lock-in configurações do amplificador: Sensibilidade [200 mV], resolução dinâmica [normal], Offset [on], Expand [x1], Constante de Tempo: pré [10 s], post [0,1 s]. Se uma resposta mais rápida é necessária, o tempo de pré constante pode ser reduzido a 3 s. O controle de deslocamento é usado para trazer o rastreamento de sonda para perto do centro da tela. Se as respostas são esperadas grandes, o rastreamento pode ser movida para cima ou para baixo. Configurações WCP software: Duração Record [204,8 s], amostras por canal [1024], intervalo de amostragem [0,2 s], Faixa de Tensão [+ / - 0,2 V]. Se grandes correntes são antecipados, a Faixa de tensão pode ser aumentada para 1 V ou 5 V. 3. Configurações de sonda Novas sondas têm de ser testados e sua freqüência única e ângulo de fase determinada. A nova sonda é colocada na câmara de calibração contendo soro fisiológico (Figura 2B). A fonte de alimentação está ligado e virou a freqüência até a vibração máxima é observada. Esta é a freqüência de ressonância da sonda. Usando a sonda nessa freqüência pode causar instabilidade e produzir ruído na gravação, para que a sonda é &quot;de-tuned&quot;, subtraindo 10 Hz para dar frequência de trabalho da sonda (tipicamente 150-200 Hz). A amplitude de vibração é ajustado para que a distância da vibração da sonda é o mesmo que o diâmetro da ponta, de modo que quando a sonda é vibrou uma &quot;imagem dupla&quot; da ponta da sonda é visto (ver Figura 2B). Para determinar o ângulo de fase, a sonda é colocada em solução salina na câmara de calibração e uma corrente de 1,5 mA / cm 2 aplicada repetidamente. O ângulo de fase no amplificador lock-in é ajustado até que não haja resposta. Adição ou subtração de 90 ° a estaângulo dá a resposta máxima, e este ângulo é o ângulo da sonda fase de trabalho. O ângulo de freqüência e fase para cada sonda são anotados para uso futuro. Durante um experimento, é importante que essas configurações de ângulo de amplitude, freqüência e fase não são alteradas, pois isso irá alterar a resposta da sonda. Por conveniência, quando a corrente está fluindo &quot;Sul-Norte&quot;, este deve produzir uma deflexão para cima (chamado aqui &quot;pico&quot;) no rastreamento de gravação e corrente que flui &#39;Norte-Sul&#39; devem mostrar uma deflexão para baixo ( ver Figura 3A). Se este é o caminho errado, em seguida, adicionando 180 ° para o ângulo de fase irá corrigi-lo, lançando a rodada de respostas. Ver Reid et al. 1 para obter informações detalhadas sobre a teoria por trás da função do teste, calibração, etc Calibração: A resposta da sonda a um &quot;padrão&quot; atual de exatamente 1,5 mA / cm 2, aplicada à sonda em uma câmara de calibração, é utilizada para calcular a corrente na amostra (ver Figura 2B, 3A). Antes da medição da amostra, a sonda é calibrada em solução adequada, por exemplo, BSS + Solução de lágrimas artificiais para córnea. Corrente é aplicada em duas direções: Sul-Norte e Norte-Sul, produzindo um para cima e uma deflexão para baixo, respectivamente, equivalentes a correntes exterior e interior, dependendo da orientação da amostra. O traço sonda deve ter uma base estável e de baixo ruído (compare Figs. 3A e 3B). A sonda é calibrada no final do experimento em solução utilizada para compensar a mudança osmolalidade devido à evaporação. Ao analisar os dados, as medições da primeira metade do experimento pode ser calculada usando os valores de calibração de partida, e as medições da segunda metade calculada usando a calibração final. Medição da amostra: A câmara pode ter de ser concebido para segurar e imobilizar a amostra. Por exemplo, a Figura 3C mostra placas de Petri com alças de arame para segurar os olhos para medições de córnea. O prato contendo soro fisiológico é colocado sob o microscópio de dissecação e da área de interesse na amostra colocada em foco no campo de visão. A sonda é então colocado em solução e paralelo ao da superfície da amostra e também em foco, ele está no mesmo nível que o ponto da amostra a ser medida. A sonda é movida na medida em que é conveniente (por exemplo 1-2 cm) de distância da amostra, a vibração ligada (eo software de computador configurado para gravar) para estabelecer uma linha de base (horizontal) estável (ver Figura 4A). A sonda é então colocado em posição de medição, cerca de 50 mm da superfície. Quando o novo valor (&quot;pico&quot;) é estável, a sonda é movido para a posição de referência eo traço retorna ao valor basal. Isto pode ser repetido em momentos regulares para produzir dados timelapse, ou se a amostra movidos / rodado levemente e repetidas em diferentes posições para produzir dados espaciais mapeamento atual (veja a Figura 4B, 5B). Análise de dados: Os dados são analisados ​​utilizando WinWCP (ver Figura 5A). Linha &quot;zero&quot; o vermelho horizontal é movida para cima ou para baixo assim que é paralela à linha de base traço antes do pico de medição. A linha de medição vertical verde é movido transversalmente à linha de base de rastreio. A saída de leitura em verde na parte inferior da linha verde deve ser perto de zero (por exemplo, 0,00012). Esse número mostra a differnce entre o ponto onde as linhas vermelha e verde cruz, eo traço azul. A linha vermelha é então movido para cima até que esteja paralela com o topo do pico. A leitura de saída verde é o tamanho do pico em mV. Os dados para todos os picos de medição, e os dados de calibração, são colocadas em um modelo de planilha do Microsoft Excel (ver Tabela 1). Informações relevantes, tais como a data, o número de sondagens, faixa de voltagem (VR), solução utilizada, medindo posições, tempo de pontos, etc, podem também ser colocados na planilha. A direção atual (dentro ou fora da amostra: &#39;i / o) é observado, e as correntes internas também recebem um valor negativo no &quot;pico&quot; da coluna. A corrente na coluna da direita é calculada utilizando a fórmula: = corrente de pico * (1.5/calibration) onde 1,5 é a corrente em aplicar 2 mA / cm a calibração. Assim: &quot;unw1 &#39;= 12,45 * (1.5/56.12) = 0,33276907 mA / cm 2. 4. Segredos para o Sucesso Como em todos os eletrofisiologia, aterramento (aterramento) do equipamento vital ajuda a eliminar o ruído. Assim, pelo menos o posicionador micro-e o chassi do microscópio deve ser aterrado, e talvez também a fonte de luz (ver Figura 1). O usuário também pode ser uma fonte de eletricidade estática, então de terra através de um pulso de banda pode evitar a instabilidade da sonda, em alguns casos, mas não é sempre necessário. Uma gaiola de Faraday não é necessário, como o lock-in filtros do amplificador para fora todas as freqüências (por exemplo 60Hz da rede elétrica), além da freqüência da sonda está vibrando menos. A mesa de isolamento de vibração é útil mas não essencial. Um banco sólido, estável ou tabela funciona tão bem. Para além do básicoinformações na planilha Excel (veja acima) é útil para gravar em um laboratório do livro informações úteis adicionais, tais como mudanças de temperatura, adições de drogas, etc Se as fotografias são tiradas pelo microscópio, observe a ampliação. Se relevante, também é útil para desenhar um esboço da amostra (s) mostrando a posição e / ou orientação de medições da sonda (ver Figura 6). Passos desafiador <ol class="lalpha"><li> Probe fazer: deve haver uma boa conexão elétrica entre a sonda eo conector R30. Se nada acontecer na fase de galvanoplastia, então este é provavelmente a causa. </li><li> Calibração: use soro fisiológico apropriado ou meio de cultura para a amostra será de medição. Não sobre-ou sub-preencher a câmara de calibração, pois isso pode alterar a resposta. A superfície do líquido deve ser plana na parte superior da câmara. </li><li> Medições da amostra: Planeje com antecedência, por exemplo, que você precisa para fazer uma câmara especial para segurar / montagem da amostra (ver Figura 3C)? Quando se mede a partir de uma amostra, a sonda deve ser orientado com o eixo paralelo tempo para a superfície da amostra, para que direção da sonda de vibração (e, portanto, sentido da corrente que está sendo medido) é perpendicular à superfície da amostra (por exemplo, ver Figura 4B ). A amostra pode ser movido e / ou girado para medições em diferentes posições. É importante manter uma distância consistente entre a sonda ea superfície da amostra durante a medição. A corrente medida é proporcional à distância da superfície da amostra, como a sonda se afasta da superfície da amostra, a corrente cai pela lei do inverso do quadrado. Isto é, quando se mede uma corrente gerada na superfície da amostra, a corrente detectada é inversamente proporcional ao quadrado da distância da superfície. Uma retícula ocular pode ser usado para julgar a distância entre a sonda ea superfície da amostra. </li></ol> Solução de problemas <ul><li> Problema: não há resposta à calibração. Solução: verificação salina é entrar em contato com ambos os eletrodos. Verificação da bateria no calibrador corrente constante. </li><li> Problema: a resposta de pequeno porte. Solução: sonda limpa em / e dH 2 O ou acetona. Verifique ângulo de fase. </li><li> Problema: ruído ou linha de base instável (ver Figura 3B). Solução: Verifique os fios de ligação à terra. </li><li> Problema: trace salta fora da tela. Solução: não permitem ponta da sonda para tocar amostra. </li></ul> 5. Resultados representante Figura 3A mostra um bom exemplo de um traço de calibração. Observe a linha de base (horizontal) estável, baixo ruído e grande resposta. Como comparação, a Figura 3B mostra um traço ruidosos com base instável. Medições de corrente em diferentes posições em uma ferida da córnea do rato são mostrados na Figura 4B. O painel superior mostra as posições da sonda, o painel do meio mostra os traços da sonda como registrado no computador eo painel inferior é um gráfico das correntes em diferentes posições, mostrando um perfil de ferida atual. Figura 5B mostra medições em uma ferida da pele de camundongos feitos em intervalos regulares de tempo para produzir dados sobre a ferida do tempo atual curso. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Vibratório sistema de sonda. Veja o texto para descrição detalhada. Texto azul descreve a função dos fios de conexão. Símbolos verdes mostram os pontos de ligação à terra. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. A. Sonda de montagem. A sonda é colado em um conector R30 ouro com prata-carregado epóxi, antes electroporating. Em alguns sistemas, um segundo conector com um fio curto para transportar o sinal é soldada por diante. Barra de escala 3 mm. A bola platina não está em escala. B. calibração da sonda. O calibrador de corrente constante (à esquerda) se aplica uma corrente de 1,5 mA / cm 2 para a sonda na câmara de calibração (direita). Canto inferior esquerdo: close-up de uma sonda. Quando a sonda é vibrado (inferior direito), a amplitude é ajustada para uma imagem dupla da ponta é visto. Barra de escala 100 mm. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. A. Sonda traço de calibração. Exemplo de um traço boa sonda de calibração, com linha de base estável, baixo ruído e grande resposta. Corrente que flui do Sul para o Norte dá uma deflexão para cima, e corrente que flui Norte-Sul produz uma deflexão para baixo. B. Uma instável, trace sonda ruidosos. C. Chambers fez para mouse de montagem (à esquerda) ou rato (direito) para medições de olhos córnea. Barra de escala 5mm. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Prove exemplos de medição. A. A linha de base estável é estabelecida com a sonda em posição de referência 02/01 a partir da amostra. Quando a sonda é movida para posição de medição perto da amostra, detectar umcorrente e desvia o traço para cima (exterior atual). Medidas B. em diferentes posições através de uma córnea de rato seria. Sonda se paralelo à superfície, de modo a vibração é perpendicular. Picos para cima mostram correntes para fora. Corrente máxima é visto nas bordas da ferida (posições B &amp; F). O esquema da sonda é mostrado na medição F posição (borda da ferida direita). Barra de escala 300 mm. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. A. Analisar traços da sonda. Painel superior: a linha vermelha zero é movida para cima ou para baixo assim que é paralela à linha de base de rastreio, então a linha de medição verde é movido transversalmente à linha de base para a leitura de saída em verde está perto de zero (0,00012). Painel inferior: a linha vermelha é então movido para cima até que esteja paralela com o topo do pico de rastreamento e a leitura de saída dá o tamanho do pico em mV (12.45). Corrente é calculado a partir deste utilizando os dados de calibração (ver Tabela 1). B. da pele do rato ferida dados timelapse. Atual antes de ferir é mostrado no momento zero (símbolo vermelho). As medições foram feitas na mesma posição em uma ferida na pele do rato em intervalo de tempo regular após ferindo. Depois de transiente inicial correntes para dentro (abaixo de zero), a corrente invertida e correntes para fora (positivo) subiu lentamente e plateaued. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Lab-book esboços que mostram sonda de medição posições. A. cérebro Rat; pontos vermelhos mostram medindo posições e símbolos sonda mostram a orientação da sonda. B. ferida córnea Rat; pontos vermelhos mostram as posições de medição e setas indicam direção da corrente medida. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358tab1.jpg" alt="Tabela 1" /> Tabela 1. Exemplo de planilha Excel para armazenar e quantificação de dados da sonda. pN2_cal1 calibração = partida; + cal e cal = valores de calibração em mV; VR = faixa de tensão, o pico de medições em mV = amostra, i / o = fluxo de corrente (dentro ou fora da amostra).

<ol>
	<li>Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+measurement+of+bioelectric+currents+with+a+vibrating+probe.">Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe.</a> Nat. Protoc. 2, 661-9282 (2007).</li><li>Reid, B., Song, B., McCaig, C. D., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+in+rat+cornea:+the+role+of+electric+currents.">Wound healing in rat cornea: the role of electric currents.</a> FASEB J. 19, 379-386 (2005).</li><li>Lois, N., Reid, B., Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+currents+and+lens+regeneration+in+the+rat.">Electric currents and lens regeneration in the rat.</a> Exp. Eye Res. 90, 316-323 (2010).</li><li>Wang, E., Reid, B., Lois, N., Forrester, J. V., McCaig, C. D., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+inhibition+of+lens+epithelial+cell+proliferation:+an+additional+factor+in+secondary+cataract.">Electrical inhibition of lens epithelial cell proliferation: an additional factor in secondary cataract.</a> FASEB J. 19, 842-844 (2005).</li><li>Guo, A., Song, B., Reid, B., Gu, Y., Forrester, J. V., Jahoda, C., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+physiological+electric+fields+on+migration+of+human+dermal+fibroblasts.">Effects of physiological electric fields on migration of human dermal fibroblasts.</a> J. Invest. Derm. , (2010).</li><li>Reid, B., Song, B., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+currents+in+Xenopus+tadpole+tail+regeneration.">Electric currents in Xenopus tadpole tail regeneration.</a> Dev. Biol. 335, 198-207 (2009).</li><li>Zhao, M., Song, B., Pu, J., Wada, T., Reid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+signals+control+wound+healing+through+phosphatidylinositol-3-OH+kinase-&#947;.">Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-&#947;.</a> 442, 457-460 (2006).</li><li>Reid, B., EO, G. r. a. u. e. -. H. e. r. n. a. n. d. e. z., Mannis, M. J., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+endogenous+electric+currents+in+human+corneal+wounds+-+a+novel+approach+of+bioelectric+stimulation+without+electrodes.">Modulating endogenous electric currents in human corneal wounds - a novel approach of bioelectric stimulation without electrodes.</a> Cornea. , (2010).</li><li>Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+vibrating+probe+for+measuring+steady+extracellular+currents.">An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents.</a> J. Cell Biol. 63, 614-628 (1974).</li><li>Hotary, K. B., Nuccitelli, R., Robinson, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computerized+2-dimensional+vibrating+probe+for+mapping+extracellular+current+patterns.">A computerized 2-dimensional vibrating probe for mapping extracellular current patterns.</a> J. Neurosci. Meth. 43, 55-67 (1992).</li><li>Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+ion+currents+and+DC+electric+fields+in+multicellular+animal+tissues.">Endogenous ion currents and DC electric fields in multicellular animal tissues.</a> Bioelectromagnetics Supplement. 1, 147-157 (1992).</li><li>Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioelectric+mechanisms+in+regeneration:+Unique+aspects+and+future+perspectives.">Bioelectric mechanisms in regeneration: Unique aspects and future perspectives.</a> Seminars in Cell Dev. Biol. 20, 543-556 (2009).</li><li>Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+fields+in+wound+healing+-+An+overriding+signal+that+directs+cell+migration.">Electric fields in wound healing - An overriding signal that directs cell migration.</a> Seminars in Cell Dev. Biol. 20, 674-682 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós descrevemos um baixo custo, básico, mas o sistema sonda altamente sensível para a medição de vibração não-invasiva de corrente elétrica em uma variedade de sistemas biológicos. Modificações possíveis <ol><li> Se platina / irídio eletrodos (Instrumentos de Precisão Mundial; # cat PTM23B20) são usados ​​em vez de aço inoxidável, em seguida, o palco revestimento de ouro pode ser eliminada. </li></ol> Aplicações Temos...

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Eligoy-Stainless Electrode</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>SSM33A70</td>
<td>76 mm, 7 M&Omega;, 1-2&mu;m tip</td>
</tr>
<tr>
<td>Gold R30 connector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>www.vectorelect.com</td>
<td>R30</td>
<td>Re-usable</td>
</tr>
<tr>
<td>Silver-loaded epoxy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>3M</td>
<td>SL65</td>
<td>Mix 1-part Resin with 1-part Hardener</td>
</tr>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>SZ40</td>
<td>Magnification x6 to x40</td>
</tr>
<tr>
<td>Potassium dicyanoaurate (KAu(CN)2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>379867</td>
<td>CAUTION: Toxic</td>
</tr>
<tr>
<td>Chloroplatinic acid hydrate (H2PtCl6 x 6H2O)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>520896</td>
<td>CAUTION: Toxic</td>
</tr>
<tr>
<td>Lead(II) acetate trihydrate (Pb(CH3CO2)2 x 3H2O)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>185191</td>
<td>CAUTION: Toxic</td>
</tr>
<tr>
<td>Nano-Amp power source</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Made in-house</td>
<td>-</td>
<td>Powered by six 1.5 V (AAA) batteries</td>
</tr>
<tr>
<td>3-dimensional micro-positioner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Line Tool Co.</td>
<td>Model H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lock-in amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stanford Research Systems</td>
<td>SR530</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Digital I/O interface</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>National instruments</td>
<td>PCI-6220</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shielded Connector Block with BNC connections</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>National instruments</td>
<td>BNC-2110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Strathclyde Electrophysiology Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>University of Strathclyde Institute of Pharmacy and Biomedical Sciences, UK</td>
<td>WinWCP V4.1.5</td>
<td>Free download from: <a href="http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm">http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Calibration Chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Made in-house</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Constant Current Calibrator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vibrating Probe Company</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Powered by one 9 V (PP3) battery</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

measurement of bioelectric current with a vibrating probe

Campos elétricos, gerados pelo transporte ativo de íons, estão presentes em muitos sistemas biológicos e, muitas vezes têm funções importantes em tecidos e órgãos. Por exemplo, eles desempenham um papel importante no direcionamento da migração celular durante a cicatrização de feridas. Aqui, descrevemos a produção e uso de ultra-sondas para medir a vibração extracelular correntes elétricas. A sonda é um isolado, fio de metal com uma ponta afiada platina preta pequena (30-35 mm), que pode detectar correntes iónicas na mA / cm 2 na faixa de soro fisiológico. A sonda é vibrado em cerca de 200 Hz por um bender piezoelétricos. Na presença de uma corrente iônica, a sonda detecta uma diferença de tensão entre os extremos do seu movimento. Um lock-in filtros do amplificador para fora o ruído estranho, bloqueando para frequência da sonda de vibração. Os dados são gravados no computador. A sonda é calibrada no início e final dos experimentos em solução salina adequada, utilizando uma câmara que se aplica uma corrente de 1,5 mA exatamente / cm 2. Descrevemos como fazer as sondas, configurar o sistema e calibrar. Nós também demonstrar a técnica de medição da córnea e mostrar alguns resultados representativos de amostras diferentes (córnea, cérebro, pele).

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Measurement of Bioelectric Current with a Vibrating Probe

A fabricação, calibração e uso de sondas não-invasivo para medir a corrente de vibração bioelétrica em diversos sistemas biológicos é descrito.

Medição de corrente bioelétrica com uma sonda de vibração

Electric fields, generated by active transport of ions, are present in many biological systems and often serve important functions in tissues and organs. ...

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Bioengineering

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Current and Resistance

SCIENTISTS IN ACTION

14.1K visualizações.  University of California, Davis. A fabricação, calibração e uso de sondas não-invasivo para medir a corrente de vibração bioelétrica em diversos sistemas biológicos é descrito.

Vídeo: Measurement of Bioelectric Current with a Vibrating Probe

Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium. We have developed tissue surface tensiometry (TST) specifically to measure the surface free energy of interaction between cells. The biophysical concepts underlying TST have been previously described in detail1,2. The method is based on the observation that mutually cohesive cells, if maintained in shaking culture, will spontaneously assemble into clusters. Over time, these clusters will round up to form spheres. This rounding-up behavior mimics the behavior characteristic of liquid systems. Intercellular binding energy is measured by compressing spherical aggregates between parallel plates in a custom-designed tissue surface tensiometer. The same mathematical equation used to measure the surface tension of a liquid droplet is used to measure surface tension of 3D tissue-like spherical aggregates. The cellular equivalent of liquid surface tension is intercellular binding energy, or more generally, tissue cohesivity. Previous studies from our laboratory have shown that tissue surface tension (1) predicts how two groups of embryonic cells will interact with one another1-5, (2) can strongly influence the ability of tissues to interact with biomaterials6, (3) can be altered not only through direct manipulation of cadherin-based intercellular cohesion7, but also by manipulation of key ECM molecules such as FN8-11 and 4) correlates with invasive potential of lung cancer12, fibrosarcoma13, brain tumor14 and prostate tumor cell lines15. In this article we will describe the apparatus, detail the steps required to generate spheroids, to load the spheroids into the tensiometer chamber, to initiate aggregate compression, and to analyze and validate the tissue surface tension measurements generated.

We describe a method of measuring binding energy, expressible as tissue surface tension, between cells within 3D tissue-like aggregates. Differences in tissue surface tension have been demonstrated to correlate with invasiveness of lung, muscle, and brain tumors, and are fundamental determinants of establishing spatial relationships between different cell types.

Medição de Coesão agregados por tensiometria superfície do tecido

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium.  We ...

Bioengenharia

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion fluxes at the cellular level are required for initiating action potentials in excitable cells.2 Sodium regulation plays an important role in both of these cases; however, no method currently exists for continuously monitoring sodium levels in vivo 3 and intracellular sodium probes 4 do not provide similar detailed results as calcium probes. In an effort to fill both of these voids, fluorescent nanosensors have been developed that can monitor sodium concentrations in vitro and in vivo.5,6 These sensors are based on ion-selective optode technology and consist of plasticized polymeric particles in which sodium specific recognition elements, pH-sensitive fluorophores, and additives are embedded.7-9 Mechanistically, the sodium recognition element extracts sodium into the sensor. 10 This extraction causes the pH-sensitive fluorophore to release a hydrogen ion to maintain charge neutrality within the sensor which causes a change in fluorescence. The sodium sensors are reversible and selective for sodium over potassium even at high intracellular concentrations.6 They are approximately 120 nm in diameter and are coated with polyethylene glycol to impart biocompatibility. Using microinjection techniques, the sensors can be delivered into the cytoplasm of cells where they have been shown to monitor the temporal and spatial sodium dynamics of beating cardiac myocytes.11 Additionally, they have also tracked real-time changes in sodium concentrations in vivo when injected subcutaneously into mice.3 Herein, we explain in detail and demonstrate the methodology for fabricating fluorescent sodium nanosensors and briefly demonstrate the biological applications our lab uses the nanosensors for: the microinjection of the sensors into cells; and the subcutaneous injection of the sensors into mice.

Fluorescent nanoparticles produced in our lab are used for imaging ion concentrations and ion fluxes in biological systems such as cells during signaling and interstitial fluid during physiological homeostasis.

Nanopartículas fluorescentes para a medição da concentração de íons em Sistemas Biológicos

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

Fabricação microfluida de fibras poliméricas e biohibridas com tamanho e forma predesigned

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a combination of bright field and differential interference contrast imagery. Two primary approaches are presented: noninterferometric quantitative phase microscopy (NIQPM), to perform measurements of total cell mass and subcellular density distribution, and Hilbert transform differential interference contrast microscopy (HTDIC)&#160;to determine volume. NIQPM is based on a simplified model of wave propagation, termed the paraxial approximation, with three underlying assumptions: low numerical aperture (NA) illumination, weak scattering, and weak absorption of light by the specimen. Fortunately, unstained cellular specimens satisfy these assumptions and low NA illumination is easily achieved on commercial microscopes. HTDIC is used to obtain volumetric information from through-focus DIC imagery under high NA illumination conditions. High NA illumination enables enhanced sectioning of the specimen along the optical axis. Hilbert transform processing on the DIC image stacks greatly enhances edge detection algorithms for localization of the specimen borders in three dimensions by separating the gray values of the specimen intensity from those of the background. The primary advantages of NIQPM and HTDIC lay in their technological accessibility using &#8220;off-the-shelf&#8221; microscopes. There are two basic limitations of these methods: slow z-stack acquisition time on commercial scopes currently abrogates the investigation of phenomena faster than 1 frame/minute, and secondly, diffraction effects restrict the utility of NIQPM and HTDIC to objects from 0.2 up to 10 (NIQPM) and 20 (HTDIC) &#956;m in diameter, respectively. Hence, the specimen and its associated time dynamics of interest must meet certain size and temporal constraints to enable the use of these methods. Excitingly, most fixed cellular specimens are readily investigated with these methods.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Microscopia ótica quantitativa: Measurement of Cellular Biofísica Características com um microscópio óptico padrão

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

A técnica de microfluídica para sondar Deformabilidade celular

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Superfície de Medição de Potencial de Bactérias Usando Kelvin Probe Microscopia de Força

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Fabrication of a Dipole-assisted Solid Phase Extraction Microchip for Trace Metal Analysis in Water Samples

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water samples. A brief overview of the evolution of chip-based SPE techniques is provided. This is followed by an introduction to specific polymeric materials and their role in SPE. To develop an innovative dipole-assisted SPE technique, a chlorine (Cl)-containing SPE functionality was implanted into a poly(methyl methacrylate) (PMMA) microchip. Herein, diverse analytical techniques including contact angle analysis, Raman spectroscopic analysis, and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry (LA-ICP-MS) analysis were employed to validate the utility of the implantation protocol of the C-Cl moieties on the PMMA. The analytical results of the X-ray absorption near-edge structure (XANES) analysis also demonstrated the feasibility of the Cl-containing PMMA used as an extraction medium by virtue of the dipole-ion interactions between the highly electronegative C-Cl moieties and the positively charged metal ions.

The fabrication protocol of a dipole-assisted solid phase extraction microchip for the trace metal analysis is presented.

Fabricação de um dipolo-assistida Fase Sólida Extração Microchip para análise de metais traço em amostras de água

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

Padronização Subtractive rápida de camadas de células vivas com uma Probe microfluídicos

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps compared to standard metallographic sample preparation procedures. The paper proposes a novel bespoke rig for dynamic domain imaging with in situ BH (magnetic hysteresis) measurements and elaborates the protocols for the sensor preparation and the use of the rig to ensure accurate BH measurement. The protocols for static and ordinary dynamic domain imaging (without in situ BH measurements) are also presented. The reported method takes advantage of the convenience and high sensitivity of the traditional Bitter method and enables in situ BH measurement without interrupting or interfering with the domain wall movement processes. This facilitates establishing a direct and quantitative link between the domain wall movement processes&#8211;microstructural feature interactions in ferritic steels with their BH loops. This method is anticipated to become a useful tool for the fundamental study of microstructure&#8211;magnetic property relationships in steels and to help interpret the electromagnetic sensor signals for non-destructive evaluation of steel microstructures.

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample and sensor preparation procedures and the protocols for using the test rig particularly for dynamic domain imaging with in situ BH measurements in order to achieve optimal domain pattern quality and accurate BH measurements.

Configuração otimizada e protocolo para a imagem latente magnética domínio em Situ histerese medicão

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps ...

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only one-fourth of these patients achieving transplantation, there is a dire need for alternatives for those with failing organs. In order to decrease the harmful consequences of dialysis along with the overall healthcare costs it incurs, active investigation is ongoing in search of alternative solutions to organ transplantation. Implantable tissue-engineered renal cellular constructs are one such feasible approach to replacing lost renal functionality. Here, described for the first time, is the microdissection of murine kidneys for isolation of living corticomedullary renal segments. These segments are capable of rapid incorporation within scaffold-free endothelial-fibroblast constructs which may enable rapid connection with host vasculature once implanted. Adult mouse kidneys were procured from living donors, followed by stereoscope microdissection to obtain renal segments 200 - 300 &#181;m in diameter. Multiple renal constructs were fabricated using primary renal segments harvested from only one kidney. This method demonstrates a procedure which could salvage functional renal tissue from organs that would otherwise be discarded.

Tissue-engineered renal constructs provide a solution for the organ shortage and deleterious effects of dialysis. Here, we describe a protocol to micro dissect murine kidneys for isolation of cortico-medullary segments. These segments are implanted into scaffold-free cellular constructs, forming renal organoids.

Microdissection de segmentos de tecido Renal primária e incorporação com tecnologia de construção romance livre de andaime

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...