Profesör Richard Borgens, titreşimli prob sistemi montaj yardım Felç Araştırma, Purdue Üniversitesi, Center for minnettarız. Bu çalışmada, MZ ve BR NEI hibe NIH 1R01EY019101 tarafından desteklenen ve Rejeneratif Tıp RB1-01.417 California Institute, NSF MCB-0.951.199 hibe ve Körlük Önlemek için, UC Davis Oftalmoloji Research tarafından sınırsız ödenekle parçası.

1. Probe imalatı Boş probları (aşağıdaki &#39;özel reaktifler ve ekipman Tablo&#39;) (elgiloy / parylene kaplı paslanmaz Mikroelektronlar) Dünya Hassas Aletler satın alınır. Prob ucu arkasında 25-30 mm kesilmiş ve kesim sonunda parylene yalıtım yaklaşık 5 mm iyi bir bağlantı sağlamak için uzak bir neşter (# 11 bıçak) ile kazınır. Prob elektrikle yüklü iletken gümüş epoksi (örneğin Rite-Lok SL65) [* aşağıdaki nota bakınız] kullanarak altın R30 konektör monte edilir. Prob sertleşmesine epoksi izin oda sıcaklığında gece saklanır. Sonra, bir nano-amp güç kaynağı kullanarak prob ucu, altın ve platin ile kaplıdır. Prob ucu aseton durulanır ve nano-amp güç kaynağının negatif çıktı bağlı. Prob ucu, bir diseksiyon mikroskobu (x40) altında incelendi ve altın kaplama solüsyonu (potasyum dicyanoaurate (% 0.2 w / v distile su Kau (CN) 2 (dH 2 O)) olumlu bağlı bir başvuru tel birinci sırada yer aldı çıkış ve çözüm yerleştirilir devreyi tamamlar. 5 A akım nA, ucu yaklaşık yarısı istenilen son boyutu (10-15 mikron) kadar 20 nA yükselmiştir 5 dakika uygulanır. prob ucu dH durulanır 2 O ve platinizing solüsyonu (chloroplatinic asit hidrat,% 1 w / v H2PtCl6 * 6H 2 O) yerleştirilir artı kurşun (II) asetat trihidrat (% 0.1 dH 2 w / v Pb (CH3CO 2) 2 * 3H 2 O O) 250 A akım nA 500 nA ucu istenilen nihai büyüklüğünün yaklaşık% 80 kadar artmış, daha sonra 5 dakika süreyle uygulanan akım 1 uA artmış ve son ucu çapı kadar 1 sn öbekler halinde uygulanır (30-35 mikron hakkında) elde edilir. Son olarak, ucu dH 2 O Problar durulanır süresiz olarak oda sıcaklığında muhafaza edilebilir. probları hasarlı ise, altın R30 konektörler yeniden kullanılmış olabilir. [* Not: Bazı prob sistemleri, sinyal taşımak için amplifikatöre doğrudan bağlı montaj prob var. Diğer sistemler ayrı bir montaj noktası ve sinyal bağlantısı var. İkinci durumda, bir ucunda bir R30 konnektör ile kısa (2-3 cm) tel (bkz. Şekil 2A) prob montaj, ilk R30 konnektör önce lehimlenmiştir.] 2. Probe Sistemi Prob 3 boyutlu mikro-pozisyoner (Şekil 1) üzerine monte edilmiş piezo-elektrik Bender eklenir. Probe titreşim titreşim genliği ve frekansı da uyum sağlar titreşimli prob güç kaynağı tarafından kontrol edilir. Sonda güç kaynağı için bir referans sinyal gönderir kilit-amplifikatör, aynı zamanda titreşim frekansı ve faz açısını gösterir. Aynı zamanda bir prob titreşim hızlı görsel bir referans olacak şekilde bir osiloskop bağlamak için yararlıdır. Prob gelen sinyal, kilit-amplifikatör gider. Fiber optik aydınlatma ile bir diseksiyon mikroskobu (x40 büyütme x6) ile ölçülecek prob ve örnek görülebilir. Kalibrasyon ve numune ölçümleri sırasında, bir referans ve zemin (toprak) tel (bkz. Şekil 2B) çözüm gerekir. Amplifikatör bir analog-dijital (I / O) arabirimi üzerinden bir bilgisayara bağlı. Veri Strathclyde Elektrofizyoloji Yazılım Tüm Hücre Programı (WinWCP) kullanılarak kaydedilir. Kilit amplifikatör ayarları: Hassasiyet [200 μV], Dinamik Çözünürlük [Normal], Ofset [] Genişlet [x1], Zaman Sabiti: Önceden [10] sonrası [0,1]. Daha hızlı yanıt gerekiyorsa, Sabit öncesi Zaman, 3 s azaltılmış olabilir Ofset kontrolü ekranın merkezine yakın prob iz getirmek için kullanılır. Eğer büyük tepkiler bekleniyor, izleme yukarı taşınır veya aşağı olabilir. WCP yazılım ayarları: Kayıt süresi [204,8 s], Kanal başına Örnekleri [1024], Örnekleme Aralığı [0,2], Voltaj Aralığı [+ / - 0.2 V]. Büyük akımları beklenen ise, Voltaj Aralığı 1 V veya 5 artabilir V. 3. Probe Ayarlar Yeni probları test edilecek ve kendilerine özgü frekans ve faz açısı belirlenir. Serum fizyolojik (Şekil 2B) içeren kalibrasyon odasında yeni bir prob yerleştirilir. Güç kaynağı açık ve maksimum titreşim görülünceye kadar frekansı çevirdi. Bu prob rezonans frekansı. Prob Bu frekansı kullanma kararsızlığına neden ve kayıt gürültü üretebilir, probu, prob çalışma frekansı (tipik olarak 150-200 Hz) 10 Hz çıkarılarak &#39;de-tuned&#39;. Titreşim genliği prob titreşim mesafe (bkz. Şekil 2B) probu, prob ucu bir &#39;çift görüntü&#39; vibrasyonlu zaman görülür ki, ucu çapı ile aynı olacak şekilde ayarlanmasıdır. Faz açısını belirlemek için, prob kalibrasyon odasında tuzlu yerleştirilir ve güncel bir uA / cm 2 art arda uygulanan 1.5 . Kadar herhangi bir yanıt var faz açısı amplifikatör kilit ayarlanır. Bu 90 ° ekleme veya çıkarmaaçı maksimum yanıt verir ve bu açı prob çalışma faz açısıdır. Her prob için frekans ve faz açısı ileride kullanmak üzere not edilir. Bu prob yanıtı değiştirecek bir deney sırasında, frekans, genlik ve faz açısı bu ayarları değişmez olduğu önemli bu. Kolaylık sağlamak için, mevcut &#39;Güney-Kuzey&#39; akan zaman, bu kayıt iz yukarı yönlü bir sapma (&#39;zirve&#39; olarak adlandırılır) üretmek, ve mevcut akan &#39;Kuzey-Güney&#39; (aşağı yönlü bir sapma göstermesi gerekir Şekil 3A). Bu yanlış bir şekilde ise, faz açısı 180 ° ekleyerek yanıtları yuvarlak saygısız çözecektir. Prob işlevinin arkasında yatan teori, kalibrasyon, vb hakkında ayrıntılı bilgi için Reid ve ark 1 Kalibrasyon: tam 1.5 kalibrasyon odasında prob uygulanan uA / cm 2, bir &#39;standart&#39; mevcut prob yanıt, (bkz. Şekil 2B, 3A) örnek mevcut hesaplamak için kullanılır. Örnek ölçüm probu önce uygun bir çözüm, örneğin BSS + Yapay kornea Gözyaşı Çözüm kalibre edilir. Güney-Kuzey ve Kuzey-Güney, bir yukarı ve aşağı yönlü bir sapma üreten, sırasıyla, dışa ve içe akımları eşdeğer bağlı olarak örnek yönünü: Şu iki yönde uygulanır. Prob iz istikrarlı bir temel ve düşük gürültü (Şekil 3A ve 3B karşılaştırın.) Olmalıdır. Prob, buharlaşma nedeniyle osmolalitesi değiştirmek için telafi etmek için kullanılan bir çözüm deney sonunda kalibre edilir. Verileri analiz ederken, deneyin ilk yarısından itibaren ölçümler sonunda kalibrasyon kullanılarak hesaplanan ikinci yarısından itibaren başlayan kalibrasyon değerlerini ve ölçümler kullanılarak hesaplanabilir. Numune Ölçümü: odasına örnek tutun ve hareketsiz gerekebilir. Örneğin, Şekil 3C kornea ölçümler için gözlerini tutun tel döngüler ile Petri kapları gösterir. Serum fizyolojik içeren çanak diseksiyon mikroskobu ve görüş alanını odak yerleştirilir örnek ilgi alanı altına yerleştirilir. Ölçülecek örnek noktası olarak aynı seviyede bu nedenle prob daha sonra çözümü ve odak de örnek yüzey ve yönelik paralel yerleştirilir. Örnek (örneğin, 1-2 cm) uygun olarak prob kadar taşınır, titreşim (yatay) istikrarlı bir temel (Şekil 4A) kurmak için (ve kaydetmek için bilgisayar yazılımı) açık. Prob sonra yüzeyinden yaklaşık 50 mm, ölçüm konumuna taşınır. Yeni (&#39;pik&#39;) değeri istikrarlı, prob referans konumuna geri taşınır ve izleme başlangıca döner. Bu timelapse veri üretmek için düzenli zaman noktalarında tekrarlanan ya da numune (bkz. Şekil 4B, 5B) taşındı / hafifçe döndürülür ve mekansal harita verileri verim farklı pozisyonlarda tekrarlanan olabilir. Veri Analizi: Veri WinWCP (bkz. Şekil 5A) kullanılarak analiz edilmektedir. Izleme bazal ölçüm zirve öncesinde paralel olacak şekilde yatay kırmızı &#39;sıfır&#39; hattı taşınmış veya aşağı. Dikey yeşil ölçüm hattı izleme bazal boyunca taşınır. Yeşil hat altındaki yeşil okuma çıkış sıfıra yakın (örneğin 0,00012) olmalıdır. Bu sayı, kırmızı ve yeşil çizgiler çapraz gelin ve mavi iz arasında differnce gösterir. Tepe üstüne paralel kadar kırmızı çizgi, daha sonra yukarı taşınır. Yeşil çıkış okuma mV tepe boyutu. Tüm ölçüm tepeler ve kalibrasyon verileri, veri, bir Microsoft Excel şablonu (bkz. Tablo 1) içine konur. Tarih, prob numarası, voltaj aralığı (VR), çözüm kullanılan pozisyonlar ölçüm, zaman noktaları, vb gibi ilgili bilgiler de elektronik tablo konabilir. Akım yönü (örnek ya: &#39;I / O&#39;) not edilir ve içe akımları da &#39;tepe&#39; sütunundaki negatif bir değer verilmiştir. 1.5 kalibrasyon uA / cm 2 uygulanan mevcut = tepe akımı * (1.5/calibration): Sağ taraftaki sütunda geçerli formül kullanılarak hesaplanır. Böylece: &#39;unw1&#39; = 12.45 * (1.5/56.12) = 0,33276907 uA / cm 2. 4. Başarı sırları Tüm elektrofizyoloji olduğu gibi, önemli ekipman uygun topraklama (topraklama) gürültüyü ortadan kaldırmak için yardımcı olur. Böylece, en azından mikro-pozisyoner ve mikroskop şasi topraklı, ve belki de ışık kaynağı (bkz. Şekil 1). Kullanıcı ayrıca statik elektrik kaynağı olabilir, bu yüzden bir bilek bandı ile topraklama bazı durumlarda prob istikrarsızlık önleyebilir, ama her zaman gerekli değildir. Faraday kafesi, kilit-frekans dışında tüm frekansları (örneğin 60Hz elektrik şebekesi) dışarı amplifikatör filtreler prob titreşimli olarak gerekli değildir. Titreşim izolasyonu tablosu yararlı ama şart değildir. Sağlam, istikrarlı bir tezgah ya da masa gibi iyi çalışır. Apart temelExcel çalışma bilgileri (bkz. yukarıda), fotoğraflar mikroskop alınırsa bir laboratuvar-kitap, sıcaklık değişiklikleri, ilaç eklemeler, vb gibi ek yararlı bilgiler kaydetmek için yararlıdır. büyütme dikkat edin. Ilgili ise, örnek (ler) (bkz. Şekil 6) konumu ve / veya prob ölçümleri yönünü gösteren bir çizim için de yararlıdır. Zorlu adımları <ol class="lalpha"><li> Prob verme: prob ve R30 konnektör arasında iyi bir elektrik bağlantısı olması gerekir. Galvanik aşamada bir şey olursa, o zaman bu belki de nedenidir. </li><li> Kalibrasyon: ölçüm olacak örnek için uygun tuzlu su veya kültür ortamı kullanın. Aşırı ya da bu yanıtı değiştirebilir kalibrasyon odasının altında doldurmayın. Sıvı yüzey odasının üst kısmında düz olmalıdır. </li><li> Örnek ölçümler: Planı önceden, örneğin (Şekil 3C) örnek / monte etmek için özel bir oda yapmak gerekir mi? Bir örnek ölçtüğünüzde prob titreşim Probun yönde (ve böylece mevcut ölçülen olma yönü) örnek yüzey (örneğin dik olduğunu, böylece numune yüzeyinde uzun eksenine paralel yönelik olması gerektiğini, Şekil 4B bkz. .) Örnek ve / veya farklı pozisyonlarda ölçümler için döndürülebilir taşınmış olabilir. Ölçerken, sonda ve numune yüzey arasında tutarlı bir mesafeyi korumak için önemlidir. Ölçülen akım numune yüzeyinden mesafe orantılıdır; prob numune yüzeyi, ters kare kanunu mevcut damla uzaklaşmakta. Örnek yüzeyinde oluşan bir akım ölçerken, tespit edilen akım yüzeyinden uzaklığın karesi ile ters orantılıdır. Bir mercek graticule prob ve örnek yüzeyi arasındaki mesafe yargılamak için kullanılabilir. </li></ol> Sorun Giderme <ul><li> Sorun: kalibrasyon hiçbir yanıt. Çözüm: onay tuzlu su hem de elektrot temas. Pil sabit akım kalibratör kontrol edin. </li><li> Sorun: küçük bir tepki. Çözüm: Temiz bir prob dH 2 O ve / veya aseton. Faz açısı kontrol edin. </li><li> Sorun: gürültü ya da dengesiz temel (Şekil 3B). Çözüm: toprak teli. </li><li> Sorun: eser ekran kapalı atlar. Çözüm: prob ucu örnek dokunmak için izin vermez. </li></ul> 5. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 3A, bir kalibrasyon iz iyi bir örnek gösterir. Not kararlı bazal (yatay), düşük gürültü ve büyük tepki. Bir karşılaştırma olarak, Şekil 3B kararsız başlangıca gürültülü bir iz gösterir. Şekil 4B bir fare kornea yara farklı pozisyonlarda akım ölçümleri gösterilmektedir. Üst panelde yoklama konumlarını gösterir, orta panel bilgisayara kaydedilen prob izlerini gösterir ve alt panel mevcut yaranın bir profil gösteren, farklı pozisyonlarda akımların bir grafik. Şekil 5B bir fare derisi yara yara şimdiki zaman ders veri üretmek için düzenli zaman aralıklarıyla yapılan ölçümler göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 prob sistemi Titreşimli. Detaylı açıklama için metne bakınız. Mavi metin bağlantı telleri işlevini açıklar. Yeşil semboller topraklama noktaları göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 A. Prob montaj. Prob önce electroporating gümüş yüklü epoksi ile bir altın R30 konnektör içine yapıştırılmış. Bazı sistemlerde, kısa bir tel ile sinyal taşımak için ikinci bir bağlayıcı lehimlenmiştir. Ölçek çubuğu 3 mm. Platin topu ölçekli değildir. B. Sensör kalibrasyonu. Sabit akım kalibratör (solda) 1.5 prob kalibrasyon odasında uA / cm 2 (sağda) bir akım uygular. Alt sol: yakın bir prob-up. Ucu bir çift görüntü görülür şekilde prob vibrasyonlu (alt sağda), genliği ayarlanır. Ölçek çubuğu 100 mikron. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 A. Sensör kalibrasyonu iz. Stabil bazal, düşük gürültü ve büyük tepki ile iyi bir prob kalibrasyon izi örneği. Şu akan Güney-Kuzey yukarı yönlü bir sapma verir, ve Kuzey-Güney akan Çökmelerin akımı üretir. B. kararsız, gürültülü bir prob iz. C. Chambers montaj fare (sol) ya da sıçan (sağda) gözleri korneanın ölçümleri için yaptı. 5mm Ölçek çubuğu. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 ölçüm örnekler kanıtlayın. A. istikrarlı bir temel referans numuneden 1-2 pozisyonda probu ile kurulmuştur. Prob örnek yakınında ölçüm konumuna taşındığında, bir algılarmevcut ve izleme (dışa akım) yukarıya doğru saptırır. B. Ölçümler bir fare kornea üzerinde farklı konumlarda olurdu. Probe yüzey yönelik paralel, titreşim dik. Yukarı doruklarına dışa akımları göstermektedir. Maksimum akım yara kenarlarında görülür (pozisyonları B &amp; F). Probun ölçüm pozisyonu F (sağ yara kenarına) şematik olarak gösterilmiştir. Ölçek çubuğu 300 mm. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5 A. Prob izleri analizi. Üst panel: yeşil çıkış okuma sıfır (0,00012) yakın izleme başlangıca paralel kırmızı sıfır çizgisine kadar taşınmış veya aşağı, sonra yeşil ölçüm hattı temel doğru taşınır. Alt paneli: kırmızı çizgi, o zaman iz tepe üstüne paralel olana kadar yukarı taşınır ve çıkış okuma mV tepe (12.45) boyutunu verir. Akım (bkz. Tablo 1) kalibrasyon verileri kullanılarak hesaplanır. B. Fare cilt timelapse veri yara. Yaralama önce Cari zaman sıfır (kırmızı sembol) gösterilir. Ölçümler, bir fare derisi yara yaralama sonra düzenli timepoints aynı konumda yapılmıştır. Ilk geçici içe akımlar (sıfırın altında), mevcut ters ve dışa akımlar (pozitif) yavaş yavaş yükseldi ve plato sonra. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6 pozisyonlar ölçüm probu gösteren Lab-kitap skeçler. A. Sıçan beyin; kırmızı noktalar pozisyonları ve prob sembolleri ölçme probu yönünü göstermektedir. B. Rat korneanın yara Kırmızı nokta ölçüm pozisyonları göstermek ve oklar mevcut ölçülen yönü <img src="/files/ftp_upload/2358/2358tab1.jpg" alt="Tablo 1" /> Tablo 1 prob veri depolama ve ölçülmesi için Excel elektronik tablo örneği. pN2_cal1 = başlangıç ​​kalibrasyon; cal + cal-= mV kalibrasyon değerleri; VR = voltaj aralığı, tepe = mV örnek ölçümler, i / o akım = akış (örnek içine veya dışına).

<ol>
	<li>Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+measurement+of+bioelectric+currents+with+a+vibrating+probe.">Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe.</a> Nat. Protoc. 2, 661-9282 (2007).</li><li>Reid, B., Song, B., McCaig, C. D., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+in+rat+cornea:+the+role+of+electric+currents.">Wound healing in rat cornea: the role of electric currents.</a> FASEB J. 19, 379-386 (2005).</li><li>Lois, N., Reid, B., Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+currents+and+lens+regeneration+in+the+rat.">Electric currents and lens regeneration in the rat.</a> Exp. Eye Res. 90, 316-323 (2010).</li><li>Wang, E., Reid, B., Lois, N., Forrester, J. V., McCaig, C. D., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+inhibition+of+lens+epithelial+cell+proliferation:+an+additional+factor+in+secondary+cataract.">Electrical inhibition of lens epithelial cell proliferation: an additional factor in secondary cataract.</a> FASEB J. 19, 842-844 (2005).</li><li>Guo, A., Song, B., Reid, B., Gu, Y., Forrester, J. V., Jahoda, C., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+physiological+electric+fields+on+migration+of+human+dermal+fibroblasts.">Effects of physiological electric fields on migration of human dermal fibroblasts.</a> J. Invest. Derm. , (2010).</li><li>Reid, B., Song, B., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+currents+in+Xenopus+tadpole+tail+regeneration.">Electric currents in Xenopus tadpole tail regeneration.</a> Dev. Biol. 335, 198-207 (2009).</li><li>Zhao, M., Song, B., Pu, J., Wada, T., Reid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+signals+control+wound+healing+through+phosphatidylinositol-3-OH+kinase-&#947;.">Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-&#947;.</a> 442, 457-460 (2006).</li><li>Reid, B., EO, G. r. a. u. e. -. H. e. r. n. a. n. d. e. z., Mannis, M. J., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+endogenous+electric+currents+in+human+corneal+wounds+-+a+novel+approach+of+bioelectric+stimulation+without+electrodes.">Modulating endogenous electric currents in human corneal wounds - a novel approach of bioelectric stimulation without electrodes.</a> Cornea. , (2010).</li><li>Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+vibrating+probe+for+measuring+steady+extracellular+currents.">An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents.</a> J. Cell Biol. 63, 614-628 (1974).</li><li>Hotary, K. B., Nuccitelli, R., Robinson, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computerized+2-dimensional+vibrating+probe+for+mapping+extracellular+current+patterns.">A computerized 2-dimensional vibrating probe for mapping extracellular current patterns.</a> J. Neurosci. Meth. 43, 55-67 (1992).</li><li>Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+ion+currents+and+DC+electric+fields+in+multicellular+animal+tissues.">Endogenous ion currents and DC electric fields in multicellular animal tissues.</a> Bioelectromagnetics Supplement. 1, 147-157 (1992).</li><li>Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioelectric+mechanisms+in+regeneration:+Unique+aspects+and+future+perspectives.">Bioelectric mechanisms in regeneration: Unique aspects and future perspectives.</a> Seminars in Cell Dev. Biol. 20, 543-556 (2009).</li><li>Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+fields+in+wound+healing+-+An+overriding+signal+that+directs+cell+migration.">Electric fields in wound healing - An overriding signal that directs cell migration.</a> Seminars in Cell Dev. Biol. 20, 674-682 (2009).</li></ol>

Düşük maliyetli, basit, ama biyolojik sistemlerin çeşitli non-invaziv elektrik akımı ölçmek için çok hassas titreşimli prob sistemi açıklanmaktadır. Olası Değişiklikler <ol><li> Platinyum / iridyum elektrotlar (Dünya Hassas Aletler; kedi # PTM23B20) Eğer paslanmaz çelik yerine kullanılan, daha sonra altın kaplama aşamasında ortadan kaldırılabilir. </li></ol> Uygulamalar Titreşimli prob, elektrik akımı ölçmek i...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Eligoy-Stainless Electrode</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>SSM33A70</td>
<td>76 mm, 7 M&Omega;, 1-2&mu;m tip</td>
</tr>
<tr>
<td>Gold R30 connector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>www.vectorelect.com</td>
<td>R30</td>
<td>Re-usable</td>
</tr>
<tr>
<td>Silver-loaded epoxy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>3M</td>
<td>SL65</td>
<td>Mix 1-part Resin with 1-part Hardener</td>
</tr>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>SZ40</td>
<td>Magnification x6 to x40</td>
</tr>
<tr>
<td>Potassium dicyanoaurate (KAu(CN)2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>379867</td>
<td>CAUTION: Toxic</td>
</tr>
<tr>
<td>Chloroplatinic acid hydrate (H2PtCl6 x 6H2O)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>520896</td>
<td>CAUTION: Toxic</td>
</tr>
<tr>
<td>Lead(II) acetate trihydrate (Pb(CH3CO2)2 x 3H2O)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>185191</td>
<td>CAUTION: Toxic</td>
</tr>
<tr>
<td>Nano-Amp power source</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Made in-house</td>
<td>-</td>
<td>Powered by six 1.5 V (AAA) batteries</td>
</tr>
<tr>
<td>3-dimensional micro-positioner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Line Tool Co.</td>
<td>Model H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lock-in amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stanford Research Systems</td>
<td>SR530</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Digital I/O interface</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>National instruments</td>
<td>PCI-6220</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shielded Connector Block with BNC connections</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>National instruments</td>
<td>BNC-2110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Strathclyde Electrophysiology Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>University of Strathclyde Institute of Pharmacy and Biomedical Sciences, UK</td>
<td>WinWCP V4.1.5</td>
<td>Free download from: <a href="http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm">http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Calibration Chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Made in-house</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Constant Current Calibrator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vibrating Probe Company</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Powered by one 9 V (PP3) battery</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

measurement of bioelectric current with a vibrating probe

Iyonları aktif taşıma ile oluşturulan Elektrik alanlar, birçok biyolojik sistemler mevcuttur ve genellikle doku ve organların önemli işlevleri hizmet. Örneğin, yara iyileşmesi sırasında hücre göçü yönlendirilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Burada ekstrasellüler elektrik akımları ölçmek için derece hassas titreşimli probları üretimi ve kullanımı açıklanmaktadır. Prob serum fizyolojik iyonik akımlar uA / cm 2 aralığında tespit edebilen küçük bir platin-siyah ucu (30-35 mikron), yalıtımlı, bilenmiş bir metal tel . Prob bir piezoelektrik Bender tarafından yaklaşık 200 Hz vibrasyonlu. Iyonik bir akımın varlığı, prob hareketini uç arasında bir gerilim farkı algılar. Bir kilit-amplifikatör titreşim prob frekans kilitleme gereksiz gürültüyü filtreler. Veriler bilgisayarda üzerine kaydedilmektedir. Uygun tuzlu su deneyleri başında ve sonunda tam 1,5 uA / cm 2 bir akım uygular bir oda prob kullanılarak kalibre edilir. Problar sistemi kurmak ve kalibre etmek için nasıl açıklar. Ayrıca kornea ölçüm tekniği göstermek ve farklı örnekleri (kornea, deri, beyin) temsil eden bazı sonuçları göstermek.

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Bioelectric Current with a Vibrating Probe at JoVE.com

Measurement of Bioelectric Current with a Vibrating Probe

Çeşitli biyolojik sistemler biyoelektrik akımı ölçmek için non-invaziv titreşimli probları üretimi, kalibrasyon ve kullanımı açıklanmıştır.

Titreşimli Prob ile Biyoelektrik Akım ölçümü

Electric fields, generated by active transport of ions, are present in many biological systems and often serve important functions in tissues and organs. ...

measurement-of-bioelectric-current-with-a-vibrating-probe

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Physics

Bioengineering

Unit 1

Current and Resistance

SCIENTISTS IN ACTION

14.1K Görüntüleme.  University of California, Davis. Çeşitli biyolojik sistemler biyoelektrik akımı ölçmek için non-invaziv titreşimli probları üretimi, kalibrasyon ve kullanımı açıklanmıştır.

Video: Measurement of Bioelectric Current with a Vibrating Probe

Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium. We have developed tissue surface tensiometry (TST) specifically to measure the surface free energy of interaction between cells. The biophysical concepts underlying TST have been previously described in detail1,2. The method is based on the observation that mutually cohesive cells, if maintained in shaking culture, will spontaneously assemble into clusters. Over time, these clusters will round up to form spheres. This rounding-up behavior mimics the behavior characteristic of liquid systems. Intercellular binding energy is measured by compressing spherical aggregates between parallel plates in a custom-designed tissue surface tensiometer. The same mathematical equation used to measure the surface tension of a liquid droplet is used to measure surface tension of 3D tissue-like spherical aggregates. The cellular equivalent of liquid surface tension is intercellular binding energy, or more generally, tissue cohesivity. Previous studies from our laboratory have shown that tissue surface tension (1) predicts how two groups of embryonic cells will interact with one another1-5, (2) can strongly influence the ability of tissues to interact with biomaterials6, (3) can be altered not only through direct manipulation of cadherin-based intercellular cohesion7, but also by manipulation of key ECM molecules such as FN8-11 and 4) correlates with invasive potential of lung cancer12, fibrosarcoma13, brain tumor14 and prostate tumor cell lines15. In this article we will describe the apparatus, detail the steps required to generate spheroids, to load the spheroids into the tensiometer chamber, to initiate aggregate compression, and to analyze and validate the tissue surface tension measurements generated.

We describe a method of measuring binding energy, expressible as tissue surface tension, between cells within 3D tissue-like aggregates. Differences in tissue surface tension have been demonstrated to correlate with invasiveness of lung, muscle, and brain tumors, and are fundamental determinants of establishing spatial relationships between different cell types.

Doku Yüzey tensiometresi Agrega Uyum ölçümü

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium.  We ...

Biyomühendislik

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion fluxes at the cellular level are required for initiating action potentials in excitable cells.2 Sodium regulation plays an important role in both of these cases; however, no method currently exists for continuously monitoring sodium levels in vivo 3 and intracellular sodium probes 4 do not provide similar detailed results as calcium probes. In an effort to fill both of these voids, fluorescent nanosensors have been developed that can monitor sodium concentrations in vitro and in vivo.5,6 These sensors are based on ion-selective optode technology and consist of plasticized polymeric particles in which sodium specific recognition elements, pH-sensitive fluorophores, and additives are embedded.7-9 Mechanistically, the sodium recognition element extracts sodium into the sensor. 10 This extraction causes the pH-sensitive fluorophore to release a hydrogen ion to maintain charge neutrality within the sensor which causes a change in fluorescence. The sodium sensors are reversible and selective for sodium over potassium even at high intracellular concentrations.6 They are approximately 120 nm in diameter and are coated with polyethylene glycol to impart biocompatibility. Using microinjection techniques, the sensors can be delivered into the cytoplasm of cells where they have been shown to monitor the temporal and spatial sodium dynamics of beating cardiac myocytes.11 Additionally, they have also tracked real-time changes in sodium concentrations in vivo when injected subcutaneously into mice.3 Herein, we explain in detail and demonstrate the methodology for fabricating fluorescent sodium nanosensors and briefly demonstrate the biological applications our lab uses the nanosensors for: the microinjection of the sensors into cells; and the subcutaneous injection of the sensors into mice.

Fluorescent nanoparticles produced in our lab are used for imaging ion concentrations and ion fluxes in biological systems such as cells during signaling and interstitial fluid during physiological homeostasis.

Biyolojik Sistemleri İyon Konsantrasyon Ölçümü için Floresan Nanopartiküller

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

Önceden Tasarlanmış Boyut ve Şekle Sahip Polimerik ve Biyohidred Elyafların Mikroakışkan İmalatı

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a combination of bright field and differential interference contrast imagery. Two primary approaches are presented: noninterferometric quantitative phase microscopy (NIQPM), to perform measurements of total cell mass and subcellular density distribution, and Hilbert transform differential interference contrast microscopy (HTDIC)&#160;to determine volume. NIQPM is based on a simplified model of wave propagation, termed the paraxial approximation, with three underlying assumptions: low numerical aperture (NA) illumination, weak scattering, and weak absorption of light by the specimen. Fortunately, unstained cellular specimens satisfy these assumptions and low NA illumination is easily achieved on commercial microscopes. HTDIC is used to obtain volumetric information from through-focus DIC imagery under high NA illumination conditions. High NA illumination enables enhanced sectioning of the specimen along the optical axis. Hilbert transform processing on the DIC image stacks greatly enhances edge detection algorithms for localization of the specimen borders in three dimensions by separating the gray values of the specimen intensity from those of the background. The primary advantages of NIQPM and HTDIC lay in their technological accessibility using &#8220;off-the-shelf&#8221; microscopes. There are two basic limitations of these methods: slow z-stack acquisition time on commercial scopes currently abrogates the investigation of phenomena faster than 1 frame/minute, and secondly, diffraction effects restrict the utility of NIQPM and HTDIC to objects from 0.2 up to 10 (NIQPM) and 20 (HTDIC) &#956;m in diameter, respectively. Hence, the specimen and its associated time dynamics of interest must meet certain size and temporal constraints to enable the use of these methods. Excitingly, most fixed cellular specimens are readily investigated with these methods.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Nicel Optik Mikroskopi: Hücresel biyofizik ölçümü Standart Optik Mikroskop ile Özellikleri

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

Mikroakışkan Tekniği Hücre deformabilitesi Probe

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Kelvin Probe Kuvvet Mikroskobu kullanılarak Bakterilerin Yüzey Potansiyel Ölçümü

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Fabrication of a Dipole-assisted Solid Phase Extraction Microchip for Trace Metal Analysis in Water Samples

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water samples. A brief overview of the evolution of chip-based SPE techniques is provided. This is followed by an introduction to specific polymeric materials and their role in SPE. To develop an innovative dipole-assisted SPE technique, a chlorine (Cl)-containing SPE functionality was implanted into a poly(methyl methacrylate) (PMMA) microchip. Herein, diverse analytical techniques including contact angle analysis, Raman spectroscopic analysis, and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry (LA-ICP-MS) analysis were employed to validate the utility of the implantation protocol of the C-Cl moieties on the PMMA. The analytical results of the X-ray absorption near-edge structure (XANES) analysis also demonstrated the feasibility of the Cl-containing PMMA used as an extraction medium by virtue of the dipole-ion interactions between the highly electronegative C-Cl moieties and the positively charged metal ions.

The fabrication protocol of a dipole-assisted solid phase extraction microchip for the trace metal analysis is presented.

Su Örneklerinde Eser Metal Analizi için Dipol destekli Katı Faz Ekstraksiyon Microchip Fabrikasyon

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

mikroakışkan Probe ile Canlı Hücre Katmanlar hızlı Subtractive Desenlendirme

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps compared to standard metallographic sample preparation procedures. The paper proposes a novel bespoke rig for dynamic domain imaging with in situ BH (magnetic hysteresis) measurements and elaborates the protocols for the sensor preparation and the use of the rig to ensure accurate BH measurement. The protocols for static and ordinary dynamic domain imaging (without in situ BH measurements) are also presented. The reported method takes advantage of the convenience and high sensitivity of the traditional Bitter method and enables in situ BH measurement without interrupting or interfering with the domain wall movement processes. This facilitates establishing a direct and quantitative link between the domain wall movement processes&#8211;microstructural feature interactions in ferritic steels with their BH loops. This method is anticipated to become a useful tool for the fundamental study of microstructure&#8211;magnetic property relationships in steels and to help interpret the electromagnetic sensor signals for non-destructive evaluation of steel microstructures.

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample and sensor preparation procedures and the protocols for using the test rig particularly for dynamic domain imaging with in situ BH measurements in order to achieve optimal domain pattern quality and accurate BH measurements.

En iyi duruma getirilmiş kurulum ve manyetik etki alanı görüntüleme ile Situ histeresis ölçüm için iletişim kuralı

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps ...

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only one-fourth of these patients achieving transplantation, there is a dire need for alternatives for those with failing organs. In order to decrease the harmful consequences of dialysis along with the overall healthcare costs it incurs, active investigation is ongoing in search of alternative solutions to organ transplantation. Implantable tissue-engineered renal cellular constructs are one such feasible approach to replacing lost renal functionality. Here, described for the first time, is the microdissection of murine kidneys for isolation of living corticomedullary renal segments. These segments are capable of rapid incorporation within scaffold-free endothelial-fibroblast constructs which may enable rapid connection with host vasculature once implanted. Adult mouse kidneys were procured from living donors, followed by stereoscope microdissection to obtain renal segments 200 - 300 &#181;m in diameter. Multiple renal constructs were fabricated using primary renal segments harvested from only one kidney. This method demonstrates a procedure which could salvage functional renal tissue from organs that would otherwise be discarded.

Tissue-engineered renal constructs provide a solution for the organ shortage and deleterious effects of dialysis. Here, we describe a protocol to micro dissect murine kidneys for isolation of cortico-medullary segments. These segments are implanted into scaffold-free cellular constructs, forming renal organoids.

Mikrodiseksiyon birincil böbrek doku parçaları ve roman iskele-Alerjik yapı teknolojisi ile birleşme

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...