Siamo grati al professor Richard Borgens, Centro per la Ricerca Paralisi, Purdue University, per un aiuto per il montaggio della sonda sistema vibrante. Questo studio è stato sostenuto da NIH 1R01EY019101 NEI concedere a MZ e BR, e in parte da finanziamenti del California Institute of Regenerative Medicine RB1-01417, NSF MCB-0951199, e da una sovvenzione illimitata di ricerca per prevenire la cecità, UC Davis Oftalmologia.

1. Sonda Produzione Sonde vuote sono acquistati da Strumenti di precisione (World Elgiloy / acciaio rivestita parylene microelettrodi) (vedi &#39;Tabella di reagenti e attrezzature specifiche&#39; di seguito). La sonda viene tagliata 25-30 mm dietro la punta e di circa 5 mm di isolamento parylene alla fine taglio raschiato via con un bisturi (# 11 della lama) per garantire una buona connessione. La sonda è montata in un oro R30 connettore utilizzando elettricamente conduttivo d&#39;argento caricato epossidica (ad esempio Rite-Lok SL65) [* vedi nota sotto]. La sonda viene memorizzata durante la notte a temperatura ambiente per permettere la resina epossidica ad indurirsi. Successivamente, la punta della sonda è placcato in oro e platino, con un nano-amp alimentazione. La punta della sonda è risciacquato in acetone e collegato all&#39;uscita negativo di un nano-amp fonte di alimentazione. La punta della sonda è visto sotto un microscopio da dissezione (x40) e al primo posto in soluzione doratura (dicyanoaurate di potassio (0,2% w / v UAE (CN) 2 in acqua distillata (dH 2 O)). Un filo di riferimento collegato al terminale positivo uscita e immersa in soluzione completa il circuito. Una corrente di 5 nA è applicato per 5 minuti, poi aumentati a 20 nA fino a quando la punta è circa la metà della dimensione finale desiderata (circa 10-15 micron). La punta della sonda è risciacquato in dH 2 O e poi messo in soluzione platinizing (idrato cloroplatinico acido, 1% w / v H2PtCl6 * 6H 2 O) e piombo (II) acetato triidrato (0,1% w / v Pb (CH3CO 2) 2 * 3H 2 O in DH 2 O). Una corrente di 250 nA è applicato per 5 minuti, poi aumentato a 500 nA fino a quando la punta è di circa l&#39;80% della dimensione finale desiderata. La corrente è aumentato a 1 μA e applicato in 1 sec raffiche fino a quando il diametro della punta finale si ottiene (circa 30-35 micron). Infine, la punta è risciacquati in DH 2 O. Le sonde possono essere conservare a temperatura ambiente a tempo indeterminato. sonde sono danneggiati, l&#39;oro R30 connettori possono essere riutilizzati. [* Nota: alcuni sistemi della sonda hanno la sonda di montaggio collegato direttamente all&#39;amplificatore per trasportare il segnale. Altri sistemi hanno un punto di montaggio separato e connettore di segnale. In quest&#39;ultimo caso, una breve (2-3 cm) a filo con un connettore R30 ad una estremità è saldato al primo R30 connettore prima di montare la sonda (vedi Figura 2A).] 2. Sonda di sistema La sonda è collegata ad un piezo-elettrico bender montato su un 3-dimensionale di micro-posizionatore (Figura 1). Vibrazione della sonda è controllata dalla sonda di alimentazione vibrante potenza che permette anche la regolazione di ampiezza di vibrazione e frequenza. L&#39;alimentazione della sonda invia un segnale di riferimento al amplificatore lock-in, che visualizza anche la frequenza di vibrazione e l&#39;angolo di fase. E &#39;anche utile per collegare un oscilloscopio così si ha un rapido riferimento visivo di vibrazione della sonda. Il segnale dalla sonda va al amplificatore lock-in. La sonda e il campione da misurare possono essere visualizzati con un microscopio da dissezione (ingrandimento x6 a x40) con illuminazione a fibre ottiche. Durante le misure di calibrazione e il campione, un riferimento e un terreno (terra) del filo deve essere la soluzione (vedi Figura 2B). L&#39;amplificatore è collegato a un computer tramite un convertitore analogico-digitale (I / O) interfaccia. I dati vengono registrati con l&#39;intero programma cella Strathclyde Elettrofisiologia Software (WinWCP). Lock-in impostazioni amplificatore: Sensibilità [200 uV], Dynamic risoluzione [normale], Offset [su], Expand [x1], costante di tempo: pre [10 s], post [0,1 s]. Se una risposta più rapida è necessaria, il tempo pre costante può essere ridotto a 3 s. Il controllo offset viene utilizzato per portare la traccia sonda vicino al centro dello schermo. Se le risposte di grandi dimensioni sono attesi, la traccia può essere spostato in alto o in basso. WCP impostazioni del software: Durata registrazione [204,8 s], campionamenti per canale [1024], intervallo di campionamento [0,2 s], Gamma di tensione [+ / - 0,2 V]. Se si prevedono grandi correnti, l&#39;intervallo di tensione può essere aumentata a 1 V o 5 V. 3. Sonda Impostazioni Nuove sonde dovranno essere testati e la loro frequenza unica e angolo di fase determinata. La nuova sonda si trova nella camera di calibrazione contenente soluzione fisiologica (Figura 2B). L&#39;alimentazione è acceso e la frequenza alzato fino a quando la vibrazione massima si osserva. Questa è la frequenza di risonanza della sonda. Utilizzando la sonda a questa frequenza può causare instabilità e produrre rumore nella registrazione, così la sonda è &#39;de-tuned&#39; sottraendo da 10 Hz a dare frequenza di lavoro della sonda (tipicamente 150-200 Hz). L&#39;ampiezza della vibrazione è regolato in modo che la distanza vibrazione sonda è lo stesso del diametro della punta, in modo che quando la sonda è vibrato una &#39;doppia immagine&#39; della punta della sonda è visto (vedi Figura 2B). Per determinare l&#39;angolo di fase, la sonda si trova in soluzione salina nella camera di calibrazione e una corrente di 1,5 ìA / cm 2 applicato ripetutamente. L&#39;angolo di fase sulla amplificatore lock-in viene regolata fino a quando non c&#39;è risposta. Aggiungendo o sottraendo 90 ° a questoAngolo dà la massima risposta, e questo angolo è l&#39;angolo di fase di lavoro della sonda. L&#39;angolo di frequenza e di fase per ciascuna sonda si distinguono per un uso futuro. Durante un esperimento, è importante che queste impostazioni di angolo di frequenza, ampiezza e fase non vengono modificate, in modo da alterare la risposta della sonda. Per comodità, quando la corrente scorre &#39;Sud-Nord&#39;, questo dovrebbe produrre una deflessione verso l&#39;alto (qui chiamato &#39;picco&#39;) nella traccia di registrazione, e la corrente che scorre &#39;Nord-Sud&#39; dovrebbe mostrare una flessione verso il basso ( vedi figura 3A). Se questo è il modo sbagliato, aggiungendo poi 180 ° per l&#39;angolo di fase lo correggere invertendo il giro delle risposte. Vedi Reid et al. 1 per informazioni dettagliate sulla teoria che sta dietro funzione della sonda, taratura, ecc Calibrazione: La risposta della sonda ad una &#39;standard&#39; in corso di esattamente 1,5 ìA / cm 2, applicata alla sonda in una camera di calibrazione, viene utilizzato per calcolare la corrente nel campione (vedi figura 2B, 3A). Prima della misura del campione, la sonda è calibrata in soluzione del caso, ad esempio BSS + Soluzione lacrime artificiali per cornea. Corrente viene applicata in due direzioni: Sud-Nord e Nord-Sud, producendo una deflessione verso l&#39;alto e una verso il basso, rispettivamente, pari a correnti verso l&#39;esterno e verso l&#39;interno, a seconda dell&#39;orientamento del campione. La traccia sonda dovrebbe avere una base stabile e basso rumore (cfr. fig. 3A e 3B). La sonda è calibrata alla fine dell&#39;esperimento in soluzione utilizzata per compensare il cambiamento osmolalità a causa dell&#39;evaporazione. Quando si analizzano i dati, le misure della prima metà di questo esperimento può essere calcolato utilizzando i valori di taratura di partenza, e le misure dalla seconda metà calcolato utilizzando la calibrazione fine. Misura Esempio: Uno camera può essere progettato per contenere e immobilizzare il campione. Per esempio, la Figura 3C mostra Petri con anse a filo per tenere gli occhi per le misure di cornea. Il piatto contenente soluzione fisiologica è posto sotto il microscopio da dissezione e l&#39;area di interesse sul campione messo a fuoco nel campo visivo. La sonda viene quindi posto in soluzione e orientati parallelamente alla superficie del campione e anche a fuoco quindi è allo stesso livello come il punto sul campione da misurare. La sonda si sposta per quanto è conveniente (ad esempio 1-2 cm) di distanza dal campione, la vibrazione acceso (e il software per registrare) per stabilire una stabile (orizzontale) al basale (vedi Figura 4A). La sonda viene poi spostato nella posizione di misura, circa 50 micron dalla superficie. Quando la (&#39;picco&#39;) nuovo valore è stabile, la sonda si sposta in posizione di riferimento e la traccia ritorna allo stato iniziale. Questo può essere ripetuta a intervalli di tempo regolari per produrre dati timelapse, o il campione spostato / leggermente ruotato e ripetuto in diverse posizioni per produrre dati spaziali mappatura corrente (vedi Figura 4B, 5B). Analisi dei dati: i dati vengono analizzati utilizzando WinWCP (vedi Figura 5A). Linea di &#39;zero&#39; orizzontale rosso è spostato verso l&#39;alto o verso il basso in modo che sia parallela alla linea di base traccia prima del picco di misura. La linea verticale verde misura è spostata oltre alla linea di base traccia. L&#39;uscita di lettura nel verde nella parte inferiore della linea verde dovrebbe essere prossima allo zero (ad esempio 0,00012). Questo numero indica il differnce tra il punto in cui le linee rosse e verdi croce, e la traccia blu. La linea rossa è poi salito fino a quando non è parallelo con la parte superiore del picco. La lettura di uscita verde è la dimensione del picco in mV. I dati per tutti i picchi di misura, ei dati di taratura, vengono messi in un modello di foglio di calcolo Microsoft Excel (vedi tabella 1). Informazioni pertinenti, quali la data, il numero della sonda, range di tensione (VR), soluzione utilizzata, misurando la posizione, il tempo-point, ecc può anche essere messo nel foglio di calcolo. La direzione attuale (dentro o fuori del campione: &#39;I / O&#39;) è nota, e le correnti verso l&#39;interno è dato anche un valore negativo nella colonna &#39;picco&#39;. La corrente nella colonna di destra è calcolato utilizzando la formula: = corrente di picco * (1.5/calibration), dove 1.5 è la corrente in ìA / cm 2 applicato a calibrazione. Così: &#39;unw1&#39; = 12,45 * (1.5/56.12) = 0,33276907 ìA / cm 2. 4. I segreti del successo Come in tutti i elettrofisiologia, messa a terra (messa a terra) di apparecchiature vitali aiuta ad eliminare il rumore. Quindi, almeno il micro-posizionatore e il telaio del microscopio deve essere messa a terra, e forse anche la sorgente di luce (vedi Figura 1). L&#39;utente può anche essere una fonte di elettricità statica, in modo di messa a terra attraverso un polso-band può prevenire l&#39;instabilità della sonda, in alcuni casi, ma non è sempre necessario. Una gabbia di Faraday non è necessario, come il blocco dei filtri amplificatore fuori tutte le frequenze (ad esempio 60Hz da rete elettrica) a parte la frequenza della sonda vibra in. Una tabella di isolamento dalle vibrazioni è utile ma non essenziale. Un solido, stabile da banco o un tavolo funziona altrettanto bene. Oltre alla baseinformazioni contenute nel foglio di calcolo Excel (vedi sopra) è utile per registrare nel proprio laboratorio-book ulteriori informazioni utili come i cambiamenti di temperatura, le aggiunte di droga, ecc Se le fotografie sono tolto il microscopio, nota l&#39;ingrandimento. Se del caso, è anche utile per disegnare uno schizzo del campione (s) che mostra la posizione e / o orientamento di misure sonda (vedi Figura 6). Passi impegnativi <ol class="lalpha"><li> Sonda fare: ci deve essere un buon collegamento elettrico tra la sonda e il connettore R30. Se non accade nulla in fase di galvanica, allora questa è probabilmente la causa. </li><li> Calibrazione: uso appropriato salina o terreno di coltura per il campione sarà di misura. Non sovra o sotto-riempire la camera di calibrazione come questo può alterare la risposta. La superficie del liquido deve essere piatta nella parte superiore della camera. </li><li> Misure campione: Piano in anticipo, ad esempio, avete bisogno di fare una camera speciale per tenere / montare il campione (vedi figura 3C)? Quando si misura da un campione, la sonda dovrebbe essere orientato con l&#39;asse parallelo lungo la superficie del campione, in modo che la direzione della sonda di vibrazione (e quindi la direzione della corrente da misurare) è perpendicolare alla superficie del campione (per esempio, vedere la Figura 4B ). Il campione può essere spostato e / o rotazione per le misurazioni in diverse posizioni. E &#39;importante mantenere una distanza costante tra la sonda e la superficie del campione durante la misurazione. La corrente misurata è proporzionale alla distanza dalla superficie del campione, come la sonda si allontana dalla superficie del campione, la corrente scende dalla legge dell&#39;inverso del quadrato. Cioè, quando si misura una corrente generata sulla superficie del campione, la corrente rilevata è inversamente proporzionale al quadrato della distanza dalla superficie. Un reticolo oculare può essere usato per valutare la distanza tra la sonda e la superficie del campione. </li></ol> Risoluzione dei problemi <ul><li> Problema: nessuna risposta alla calibrazione. Soluzione: soluzione salina di controllo è contattando entrambi gli elettrodi. Controllo della batteria in corrente costante calibratore. </li><li> Problema: la risposta di piccole dimensioni. Soluzione: pulire la sonda in dH 2 O e / o acetone. Controllare angolo di fase. </li><li> Problema: rumore o al basale instabile (vedi Figura 3B). Soluzione: Controllare i cavi di messa a terra. </li><li> Problema: traccia salta fuori dallo schermo. Soluzione: non consentono punta della sonda al tocco del campione. </li></ul> 5. Rappresentante Risultati Figura 3A mostra un buon esempio di una traccia di calibrazione. Si noti la stabile (orizzontale) al basale, a basso rumore e la risposta di grandi dimensioni. A titolo di confronto, 3B figura mostra una traccia rumoroso con base instabile. Misure di corrente in posizioni diverse in una ferita cornea del mouse sono mostrate nella figura 4B. Il pannello superiore mostra la posizione della sonda, il pannello centrale mostra le tracce della sonda come registrato sul computer e il pannello inferiore è un grafico delle correnti presso le diverse posizioni, mostrando un profilo di ferita in corso. 5B figura mostra misurazioni a una ferita della pelle del mouse effettuati a intervalli di tempo regolari per produrre i dati sul tempo attuale ferita portate. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Vibrante sistema sonda. Vedi testo per descrizione dettagliata. Testo blu descrive la funzione dei cavi di collegamento. Simboli verdi mostrano i punti di messa a terra. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. A. Sonda di montaggio. La sonda viene incollato in un oro R30 connettore d&#39;argento caricato epossidica, prima di electroporating. In alcuni sistemi, un secondo connettore con un filo corto per trasportare il segnale è saldato su. Scala grafica 3 mm. La palla di platino non è in scala. B. sonda di calibrazione. Il calibratore di corrente costante (a sinistra) si applica una corrente di 1,5 ìA / cm 2 per la sonda nella camera di calibrazione (a destra). In basso a sinistra: primo piano di una sonda. Quando la sonda è vibrato (in basso a destra), l&#39;ampiezza è regolata in modo una doppia immagine della punta è visto. Scala bar 100 micron. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. A. Calibrazione sonda traccia. Esempio di una traccia buona calibrazione della sonda, con la linea di base stabile, a basso rumore e la risposta di grandi dimensioni. Corrente che scorre Sud-Nord dà una deflessione verso l&#39;alto, e la corrente che scorre da nord a sud produce una deflessione verso il basso. B. Un instabile, traccia rumorosi sonda. C. Chambers fatta per il montaggio del mouse (sinistra) o di ratto (a destra) gli occhi per le misure di cornea. Scala grafica 5mm. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Dimostrare esempi di misura. A. Una linea di base stabile è stabilito con la sonda in posizione di riferimento 1-2 dal campione. Quando la sonda viene spostata in posizione di misura in prossimità del campione, si rileva unattuale e la traccia devia verso l&#39;alto (verso l&#39;esterno di corrente). B. Misure in diverse posizioni attraverso una cornea topo. Sonda è parallelo orientato alla superficie, in modo da vibrazione è perpendicolare. Picchi verso l&#39;alto mostrano le correnti verso l&#39;esterno. Corrente massima è visto ai bordi della ferita (posizioni B &amp; F). Lo schema della sonda viene visualizzato nella misura F posizione (fronte ferita a destra). Scala bar 300 micron. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. A. Analizzando le tracce della sonda. Pannello superiore: la linea rossa zero è spostato verso l&#39;alto o verso il basso in modo che sia parallela alla linea di base traccia, allora la linea di misurazione verde è spostata oltre alla linea di base così la lettura di uscita in verde è vicino a zero (0,00012). Pannello inferiore: la linea rossa è poi salito fino a quando non è parallelo con la parte superiore del picco traccia, e la lettura di uscita fornisce la dimensione del picco in mV (12.45). Correnti è calcolata da questo utilizzando i dati di calibrazione (vedi tabella 1). B. pelle mouse ferita dati Timelapse. Corrente prima ferimento è riportato al tempo zero (simbolo rosso). Misurazioni sono state effettuate nella stessa posizione in una ferita del mouse pelle timepoints regolari dopo ferimento. Dopo l&#39;iniziale correnti transitorie verso l&#39;interno (sotto zero), la corrente invertita e le correnti verso l&#39;esterno (positivo) è cresciuto lentamente e plateau. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Lab-libro di schizzi che mostrano sonda di misura posizioni. Cervello di ratto A.; puntini rossi indicano le posizioni di misura e simboli della sonda mostrano l&#39;orientamento della sonda. Ferita Rat B. cornea; puntini rossi mostrano le posizioni di misura e frecce indicano la direzione della corrente misurata. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358tab1.jpg" alt="Tabella 1" /> Tabella 1. Esempio di foglio di calcolo Excel per la memorizzazione e la quantificazione dei dati della sonda. pN2_cal1 = calibrazione di partenza; cal + e cal-= valori di calibrazione in mV; VR = range di tensione, di picco = misure campione in mV, i / o = flusso di corrente (dentro o fuori del campione).

<ol>
	<li>Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+measurement+of+bioelectric+currents+with+a+vibrating+probe.">Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe.</a> Nat. Protoc. 2, 661-9282 (2007).</li><li>Reid, B., Song, B., McCaig, C. D., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+in+rat+cornea:+the+role+of+electric+currents.">Wound healing in rat cornea: the role of electric currents.</a> FASEB J. 19, 379-386 (2005).</li><li>Lois, N., Reid, B., Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+currents+and+lens+regeneration+in+the+rat.">Electric currents and lens regeneration in the rat.</a> Exp. Eye Res. 90, 316-323 (2010).</li><li>Wang, E., Reid, B., Lois, N., Forrester, J. V., McCaig, C. D., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+inhibition+of+lens+epithelial+cell+proliferation:+an+additional+factor+in+secondary+cataract.">Electrical inhibition of lens epithelial cell proliferation: an additional factor in secondary cataract.</a> FASEB J. 19, 842-844 (2005).</li><li>Guo, A., Song, B., Reid, B., Gu, Y., Forrester, J. V., Jahoda, C., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+physiological+electric+fields+on+migration+of+human+dermal+fibroblasts.">Effects of physiological electric fields on migration of human dermal fibroblasts.</a> J. Invest. Derm. , (2010).</li><li>Reid, B., Song, B., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+currents+in+Xenopus+tadpole+tail+regeneration.">Electric currents in Xenopus tadpole tail regeneration.</a> Dev. Biol. 335, 198-207 (2009).</li><li>Zhao, M., Song, B., Pu, J., Wada, T., Reid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+signals+control+wound+healing+through+phosphatidylinositol-3-OH+kinase-&#947;.">Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-&#947;.</a> 442, 457-460 (2006).</li><li>Reid, B., EO, G. r. a. u. e. -. H. e. r. n. a. n. d. e. z., Mannis, M. J., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+endogenous+electric+currents+in+human+corneal+wounds+-+a+novel+approach+of+bioelectric+stimulation+without+electrodes.">Modulating endogenous electric currents in human corneal wounds - a novel approach of bioelectric stimulation without electrodes.</a> Cornea. , (2010).</li><li>Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+vibrating+probe+for+measuring+steady+extracellular+currents.">An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents.</a> J. Cell Biol. 63, 614-628 (1974).</li><li>Hotary, K. B., Nuccitelli, R., Robinson, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computerized+2-dimensional+vibrating+probe+for+mapping+extracellular+current+patterns.">A computerized 2-dimensional vibrating probe for mapping extracellular current patterns.</a> J. Neurosci. Meth. 43, 55-67 (1992).</li><li>Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+ion+currents+and+DC+electric+fields+in+multicellular+animal+tissues.">Endogenous ion currents and DC electric fields in multicellular animal tissues.</a> Bioelectromagnetics Supplement. 1, 147-157 (1992).</li><li>Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioelectric+mechanisms+in+regeneration:+Unique+aspects+and+future+perspectives.">Bioelectric mechanisms in regeneration: Unique aspects and future perspectives.</a> Seminars in Cell Dev. Biol. 20, 543-556 (2009).</li><li>Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+fields+in+wound+healing+-+An+overriding+signal+that+directs+cell+migration.">Electric fields in wound healing - An overriding signal that directs cell migration.</a> Seminars in Cell Dev. Biol. 20, 674-682 (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Descriviamo un basso costo, di base, ma molto sensibile sistema sonda vibrante per la misurazione non invasiva corrente elettrica in una varietà di sistemi biologici. Le modifiche possibili <ol><li> Se platino / iridio elettrodi (Strumenti di precisione mondiale; cat # PTM23B20) sono utilizzati al posto di acciaio inox, poi la fase di placcatura in oro può essere eliminato. </li></ol> Applicazioni Abbiamo usato la sonda vibrante per misurare la corrente elettrica: cornea ratto 2; lente ratto 3,4; topo pelle 5; Xenopus girino 6; pelle umana 7; cornea umana 8; embrione Zebrafish 1; Dictyostelium 1; del cervello del ratto 1. La sonda vibrante è stato descritto da Jaffe e Nuccitelli 9. Un computer controllato sonda che misura la corrente in due dimensioni è stata descritta anche 10. Rilevanti recensioni interessanti sono inclusi anche 11-13.

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Eligoy-Stainless Electrode</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>SSM33A70</td>
<td>76 mm, 7 M&Omega;, 1-2&mu;m tip</td>
</tr>
<tr>
<td>Gold R30 connector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>www.vectorelect.com</td>
<td>R30</td>
<td>Re-usable</td>
</tr>
<tr>
<td>Silver-loaded epoxy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>3M</td>
<td>SL65</td>
<td>Mix 1-part Resin with 1-part Hardener</td>
</tr>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>SZ40</td>
<td>Magnification x6 to x40</td>
</tr>
<tr>
<td>Potassium dicyanoaurate (KAu(CN)2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>379867</td>
<td>CAUTION: Toxic</td>
</tr>
<tr>
<td>Chloroplatinic acid hydrate (H2PtCl6 x 6H2O)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>520896</td>
<td>CAUTION: Toxic</td>
</tr>
<tr>
<td>Lead(II) acetate trihydrate (Pb(CH3CO2)2 x 3H2O)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>185191</td>
<td>CAUTION: Toxic</td>
</tr>
<tr>
<td>Nano-Amp power source</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Made in-house</td>
<td>-</td>
<td>Powered by six 1.5 V (AAA) batteries</td>
</tr>
<tr>
<td>3-dimensional micro-positioner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Line Tool Co.</td>
<td>Model H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lock-in amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stanford Research Systems</td>
<td>SR530</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Digital I/O interface</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>National instruments</td>
<td>PCI-6220</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shielded Connector Block with BNC connections</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>National instruments</td>
<td>BNC-2110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Strathclyde Electrophysiology Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>University of Strathclyde Institute of Pharmacy and Biomedical Sciences, UK</td>
<td>WinWCP V4.1.5</td>
<td>Free download from: <a href="http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm">http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Calibration Chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Made in-house</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Constant Current Calibrator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vibrating Probe Company</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Powered by one 9 V (PP3) battery</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
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measurement of bioelectric current with a vibrating probe

Campi elettrici, generati dal trasporto attivo di ioni, sono presenti in molti sistemi biologici e spesso svolgono funzioni importanti in tessuti e organi. Ad esempio, essi svolgono un ruolo importante nel dirigere la migrazione delle cellule durante la guarigione delle ferite. Qui si descrive la fabbricazione e l&#39;uso di sonde a vibrazione ultrasensibile per la misura extracellulare correnti elettriche. Il sensore è un isolato, filo metallico affilato con una piccola punta di platino-nero (30-35 micron), in grado di rilevare le correnti ioniche nei ìA / cm 2 gamma di soluzione fisiologica. La sonda viene fatta vibrare a circa 200 Hz da un piezoelettrico bender. In presenza di una corrente ionica, la sonda rileva una differenza di tensione tra gli estremi del suo movimento. Un lock-in filtri amplificatore i rumori estranei, bloccando alla frequenza della sonda di vibrazione. I dati vengono registrati su computer. La sonda è calibrata all&#39;inizio e alla fine degli esperimenti in soluzione fisiologica del caso, con una camera che si applica una corrente di esattamente 1,5 ìA / cm 2. Noi descriviamo come fare le sonde, impostare il sistema e calibrare. Abbiamo anche dimostrare la tecnica di misurazione della cornea, e mostrano alcuni risultati rappresentante di diversi esemplari (cornea, cute, cervello).

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Measurement of Bioelectric Current with a Vibrating Probe

L&#39;, taratura fabbricazione e l&#39;uso di sonde a vibrazione non invasivo per misurare la corrente bioelettrica in vari sistemi biologici è descritto.

Misura della corrente bioelettrica con una sonda vibrante

Electric fields, generated by active transport of ions, are present in many biological systems and often serve important functions in tissues and organs. ...

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Nanyang Technological University

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14.1K Views.  University of California, Davis. L', taratura fabbricazione e l'uso di sonde a vibrazione non invasivo per misurare la corrente bioelettrica in vari sistemi biologici è descritto.

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Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium. We have developed tissue surface tensiometry (TST) specifically to measure the surface free energy of interaction between cells. The biophysical concepts underlying TST have been previously described in detail1,2. The method is based on the observation that mutually cohesive cells, if maintained in shaking culture, will spontaneously assemble into clusters. Over time, these clusters will round up to form spheres. This rounding-up behavior mimics the behavior characteristic of liquid systems. Intercellular binding energy is measured by compressing spherical aggregates between parallel plates in a custom-designed tissue surface tensiometer. The same mathematical equation used to measure the surface tension of a liquid droplet is used to measure surface tension of 3D tissue-like spherical aggregates. The cellular equivalent of liquid surface tension is intercellular binding energy, or more generally, tissue cohesivity. Previous studies from our laboratory have shown that tissue surface tension (1) predicts how two groups of embryonic cells will interact with one another1-5, (2) can strongly influence the ability of tissues to interact with biomaterials6, (3) can be altered not only through direct manipulation of cadherin-based intercellular cohesion7, but also by manipulation of key ECM molecules such as FN8-11 and 4) correlates with invasive potential of lung cancer12, fibrosarcoma13, brain tumor14 and prostate tumor cell lines15. In this article we will describe the apparatus, detail the steps required to generate spheroids, to load the spheroids into the tensiometer chamber, to initiate aggregate compression, and to analyze and validate the tissue surface tension measurements generated.

We describe a method of measuring binding energy, expressible as tissue surface tension, between cells within 3D tissue-like aggregates. Differences in tissue surface tension have been demonstrated to correlate with invasiveness of lung, muscle, and brain tumors, and are fundamental determinants of establishing spatial relationships between different cell types.

Misura della coesione aggregata da parte del tessuto superficiale Tensiometry

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium.  We ...

Ricerca

Bioingegneria

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion fluxes at the cellular level are required for initiating action potentials in excitable cells.2 Sodium regulation plays an important role in both of these cases; however, no method currently exists for continuously monitoring sodium levels in vivo 3 and intracellular sodium probes 4 do not provide similar detailed results as calcium probes. In an effort to fill both of these voids, fluorescent nanosensors have been developed that can monitor sodium concentrations in vitro and in vivo.5,6 These sensors are based on ion-selective optode technology and consist of plasticized polymeric particles in which sodium specific recognition elements, pH-sensitive fluorophores, and additives are embedded.7-9 Mechanistically, the sodium recognition element extracts sodium into the sensor. 10 This extraction causes the pH-sensitive fluorophore to release a hydrogen ion to maintain charge neutrality within the sensor which causes a change in fluorescence. The sodium sensors are reversible and selective for sodium over potassium even at high intracellular concentrations.6 They are approximately 120 nm in diameter and are coated with polyethylene glycol to impart biocompatibility. Using microinjection techniques, the sensors can be delivered into the cytoplasm of cells where they have been shown to monitor the temporal and spatial sodium dynamics of beating cardiac myocytes.11 Additionally, they have also tracked real-time changes in sodium concentrations in vivo when injected subcutaneously into mice.3 Herein, we explain in detail and demonstrate the methodology for fabricating fluorescent sodium nanosensors and briefly demonstrate the biological applications our lab uses the nanosensors for: the microinjection of the sensors into cells; and the subcutaneous injection of the sensors into mice.

Fluorescent nanoparticles produced in our lab are used for imaging ion concentrations and ion fluxes in biological systems such as cells during signaling and interstitial fluid during physiological homeostasis.

Le nanoparticelle fluorescenti per la misurazione della concentrazione di ioni in sistemi biologici

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Indagare Sistemi recettore-ligando del Cellulosome con sede a AFM singola molecola di Forza Spettroscopia

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

Fabbricazione microfluidica di fibre polimeriche e bioibride con dimensioni e forma predesignate

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a combination of bright field and differential interference contrast imagery. Two primary approaches are presented: noninterferometric quantitative phase microscopy (NIQPM), to perform measurements of total cell mass and subcellular density distribution, and Hilbert transform differential interference contrast microscopy (HTDIC)&#160;to determine volume. NIQPM is based on a simplified model of wave propagation, termed the paraxial approximation, with three underlying assumptions: low numerical aperture (NA) illumination, weak scattering, and weak absorption of light by the specimen. Fortunately, unstained cellular specimens satisfy these assumptions and low NA illumination is easily achieved on commercial microscopes. HTDIC is used to obtain volumetric information from through-focus DIC imagery under high NA illumination conditions. High NA illumination enables enhanced sectioning of the specimen along the optical axis. Hilbert transform processing on the DIC image stacks greatly enhances edge detection algorithms for localization of the specimen borders in three dimensions by separating the gray values of the specimen intensity from those of the background. The primary advantages of NIQPM and HTDIC lay in their technological accessibility using &#8220;off-the-shelf&#8221; microscopes. There are two basic limitations of these methods: slow z-stack acquisition time on commercial scopes currently abrogates the investigation of phenomena faster than 1 frame/minute, and secondly, diffraction effects restrict the utility of NIQPM and HTDIC to objects from 0.2 up to 10 (NIQPM) and 20 (HTDIC) &#956;m in diameter, respectively. Hence, the specimen and its associated time dynamics of interest must meet certain size and temporal constraints to enable the use of these methods. Excitingly, most fixed cellular specimens are readily investigated with these methods.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Quantitative Microscopia ottica: Misura di Biofisica Cellulare caratteristiche con un microscopio ottico standard

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

Una tecnica Microfluidic per sondare deformabilità cellulare

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Superficie di misurazione potenziale di batteri Utilizzando Kelvin Probe microscopia a forza

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Fabrication of a Dipole-assisted Solid Phase Extraction Microchip for Trace Metal Analysis in Water Samples

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water samples. A brief overview of the evolution of chip-based SPE techniques is provided. This is followed by an introduction to specific polymeric materials and their role in SPE. To develop an innovative dipole-assisted SPE technique, a chlorine (Cl)-containing SPE functionality was implanted into a poly(methyl methacrylate) (PMMA) microchip. Herein, diverse analytical techniques including contact angle analysis, Raman spectroscopic analysis, and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry (LA-ICP-MS) analysis were employed to validate the utility of the implantation protocol of the C-Cl moieties on the PMMA. The analytical results of the X-ray absorption near-edge structure (XANES) analysis also demonstrated the feasibility of the Cl-containing PMMA used as an extraction medium by virtue of the dipole-ion interactions between the highly electronegative C-Cl moieties and the positively charged metal ions.

The fabrication protocol of a dipole-assisted solid phase extraction microchip for the trace metal analysis is presented.

Realizzazione di un dipolo-assistita estrazione in fase solida Microchip per Trace analisi dei metalli in campioni di acqua

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

Rapid Patterning sottrattiva di strati cellulare dal vivo con una sonda Microfluidic

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps compared to standard metallographic sample preparation procedures. The paper proposes a novel bespoke rig for dynamic domain imaging with in situ BH (magnetic hysteresis) measurements and elaborates the protocols for the sensor preparation and the use of the rig to ensure accurate BH measurement. The protocols for static and ordinary dynamic domain imaging (without in situ BH measurements) are also presented. The reported method takes advantage of the convenience and high sensitivity of the traditional Bitter method and enables in situ BH measurement without interrupting or interfering with the domain wall movement processes. This facilitates establishing a direct and quantitative link between the domain wall movement processes&#8211;microstructural feature interactions in ferritic steels with their BH loops. This method is anticipated to become a useful tool for the fundamental study of microstructure&#8211;magnetic property relationships in steels and to help interpret the electromagnetic sensor signals for non-destructive evaluation of steel microstructures.

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample and sensor preparation procedures and the protocols for using the test rig particularly for dynamic domain imaging with in situ BH measurements in order to achieve optimal domain pattern quality and accurate BH measurements.

Installazione ottimizzata e protocollo per l'Imaging di dominio magnetico con In Situ isteresi misura

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps ...