O mapeamento de circuito assistido por Channelrhodopsin é uma técnica de precisão para mapeamento funcional de projeções neurais de longo alcance. Aqui, mostramos como usar essa abordagem para investigar circuitos no tronco cerebral auditivo. Em fatias cerebrais, axônios de múltiplas fontes são frequentemente misturados, dificultando o isolamento de entradas individuais usando estimulação elétrica.
Usando CRACM, essa limitação pode ser superada. Encontrar lambda e definir consistentemente o sistema de coordenadas estereotribuíveis é um desafio, assim como manter a duração do procedimento curta. Ter todas as etapas cuidadosamente mapeadas aumentará sua taxa de sucesso.
Comece pulverizando a área cirúrgica com 70% de etanol para higienizar e colocar cortinas de toalha estéreis para cobrir a área de cirurgia. Remova a cama da gaiola para limitar o risco de asfixia da gaiola de recuperação. Em seguida, coloque uma almofada de aquecimento sob a gaiola e forneça uma fonte de comida e água.
Em seguida, transfira o animal para um quadro estereotaxico e continue a anestesia. Insira uma sonda de temperatura retal e ligue o controlador de temperatura homeostático. Em seguida, aplique pomada oftálmica para evitar que os olhos sequem.
Administrar analgésico preventivo. Finalmente, raspe o couro cabeludo com cortadores elétricos. Desinfete o couro cabeludo com três cotonetes alternados de iodo povidone e 70% de etanol.
Comece a cirurgia fazendo uma incisão no couro cabeludo ao longo da linha média, começando entre as orelhas e rostral contínua aos olhos, expondo as suturas lambda e bregma. Empurre a pele para o lado e remova o periósteo do osso exposto, se necessário. Em seguida, marque a sutura lambda com um marcador cirúrgico, posicione a ponta do nano-injetor para que ele esteja apenas tocando lambda e zero as coordenadas do micromanipulador.
Use a ponta nano-injetor e o micromanipulador para medir a diferença de elevação entre as suturas lambda e bregma. Ajuste a altura da barra da paleta para trazer lambda e bregma para dentro de mais ou menos 100 micrometer de altura diferença. Mapeie o local de injeção usando a ponta nano-injetor e o sistema de coordenadas do micromanipulador e marque o local com um marcador cirúrgico.
Em seguida, use uma broca micromotora com uma rebarba de broca de 0,5 milímetros para realizar uma craniotomia sobre o local da injeção. Para garantir a ampla transfecção de neurônios no núcleo alvo, use um nano-injetor para fazer injeções em várias profundidades no tecido e no caso de regiões cerebrais maiores, como o colículo inferior, fazer injeções ao longo de duas ou mais penetrações em diferentes coordenadas X e Y. Para injetar o colliculus inferior, deposite 20 nanoliters de vírus nos intervalos de 250 micrômetros ao longo do eixo Z entre 2.250 micrômetros e 1.750 micrômetros de profundidade.
Para injeções no núcleo coclear dorsal, deposite 20 nanoliters de vírus a uma profundidade de 4.750 micrômetros e 4.550 micrômetros, respectivamente. Depois de injetar em cada coordenada Z, espere de dois a três minutos antes de mover o injetor para a próxima coordenada Z para dar tempo para o vírus se difundir do local da injeção, reduzindo a probabilidade de que o vírus seja sugado para cima do trato de injeção quando o nano-injetor for reposicionado. Então, após a última injeção, espere de três a cinco minutos antes de retirar nano-injetor do cérebro.
Quando o nano-injetor é removido do cérebro entre penetrações e entre animais, ejete um pequeno volume de vírus da ponta para verificar se a ponta não está entupida. Após as injeções, use PBS estéril para molhar as bordas cortadas do couro cabeludo e, em seguida, mover suavemente a pele de volta para a linha média. Feche a ferida com suturas simples interrompidas usando suturas de nylon 6-0.
Em seguida, aplique 0,5 a um mililitro de geleia de lidocaína de 2% na ferida. Remova as barras de ouvido e a sonda de temperatura, gire isoflurane e remova o animal da barra de paleta e transfira-o para a gaiola de recuperação. Finalmente, monitore a recuperação de perto.
Uma vez que o animal esteja totalmente acordado, movendo-se e não mostrando sinais de dor ou angústia, transfira-o de volta para sua gaiola e devolva a gaiola para o vivarium. Use métodos padrão de grampo de remendo para fazer gravações. Comece colocando a fatia em uma câmara de gravação sob um microscópio fixo e vertical e profuse continuamente profuso com fluido cerebrospinal artificial a dois mililitros por minuto.
Em seguida, remendo neurônios sob controle visual usando um amplificador de grampo de remendo adequado. Por fim, durante gravações por atacado, ative o Cronos fornecendo pulsos breves de luz de 470 nanômetros ou ChrimsonR por pulsos breves de luz de 580 nanômetros através de LEDs disponíveis comercialmente. Os resultados indicaram que a injeção de ChrimsonR levou a uma forte expressão no DCN com fluorescência tdTomato visível em células e fibras.
No ICC contralateral, as fibras fortemente rotuladas com tdTomato eram claramente visíveis após três semanas, demonstrando a capacidade de tráfico de longo alcance da construção chrimsonr-tdTomato quando injetadas em núcleos de tronco cerebral auditivo. Ativação óptica de EPSecos elicados ChrimsonR em neurônios VIP IC, indicando que o ChrimsonR é uma ferramenta útil para experimentos CRACM de longo alcance quando os parâmetros experimentais exigem o uso de luz vermelha em vez de luz azul. No entanto, descobrimos que o ChrimsonR foi prontamente ativado com luz azul, mostrando o mesmo limiar para ativação de luz azul como Chronos.
Para este protocolo é mais importante ter certeza de que as coordenadas estereotribíficas estão corretas e confirmar que o vírus foi expresso apenas em sua região cerebral alvo. Ao trocar a viroconestrução chronos ChrimsonR com um vírus diferente, por exemplo, um vírus Flex específico de células, você pode responder a várias questões anatômicas ou fisiológicas sem alterar o protocolo de cirurgia.
