Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Steve Withers e Hong-Ming Chen para a prestação de DNP Cellobioside-substrato.

Antes de iniciar este protocolo, você terá sua biblioteca metagenomic armazenados em um formato placa 384 poços. Em nosso estudo, foi utilizada a pCC1 vetor de controle de cópia fosmid em combinação com TransforMax fago T1-resistentes EPI300-T1 R E. células de Escherichia como o anfitrião da biblioteca e armazenadas nossas placas a -80 ° C 11. 1. Replicação das Placas Biblioteca metagenomic <ol><li> Descongele as placas contendo sua biblioteca a 37 ° C por aproximadamente 20 minutos, ou até que todos os poços são descongelados. </li><li> Use o recurso de luz ultravioleta de esterilização da qPix2 para esterilizar o robô por 15 minutos. </li><li> Prepare o caldo LB com cloranfenicol na concentração final de 12.5ug/mL e arabinose em 100ug/mL em um frasco de reagente 500mL. Cada placa usará cerca de 20 mL, além de fazer uma 50mL adicionais para permitir volume morto. </li><li> Configure o qFill3 como instruções do fabricante com a garrafa media ligados ao colector através do tubo estéril. Programá-lo para a quantidade adequada de mídia, e configurá-lo para preencher um volume de 45uL em cada poço. </li><li> Purgar o ar da tubulação e múltiplas usando o recurso de purga do robô até que a mídia é visível proveniente de cada pino da placa base. </li><li> Preencher o número desejado de placas com a mídia usando o LB qFill3. Cada prato leva aproximadamente 20 segundos para encher. </li><li> Carregar as placas biblioteca e as placas novas em áreas apropriadas do robô qPix2. Preencha os banhos de limpeza com os reagentes adequados; 2% Micro90 no banho traseira, autoclavado água destilada em banho de meio, 80% de etanol na banheira frente. </li><li> Use o programa &quot;Replicar&quot; do qPix2. No software, selecione o apropriado cabeça, número e tipos de placas e chapas de fonte de destino. Também configurar a cabeça para limpar entre repetições, geralmente 6 ciclos em cada banho é suficiente. Capacidade da máquina é de 10 placas de cada vez, e leva aproximadamente 15 minutos para replicar todas elas com uma cabeça de alfinete 384 (ou cerca de 50 minutos com uma cabeça de alfinete 96). Nota: Existe uma opção para &quot;Stir Source&quot; ou &quot;Stir Destino&quot;. É recomendado não usar essas opções como problemas já ocorreu com o nosso robot usá-los. </li><li> Uma vez que as placas são replicadas, crescem as placas a 37 ° C por 24 horas em uma caixa de umidade. Porque estamos induzindo a um número elevado de cópias de fosmid com adição de arabinose, os clones tendem a crescer mais lentamente do que os não-induzida clones. Retorno das placas biblioteca para -80 ° C. Nota: Incubação em uma caixa de umidade garante a evaporação dos meios de comunicação não ocorrer nos poços na borda das placas, mantendo um ambiente uniforme para todos os poços. </li><li> Limpe o robô qFill3 pela primeira purga-lo com água (~ 50 ml) e, em seguida, o etanol 80% (~ 50 ml). Desmontar os componentes, e limpo e autoclave a garrafa, tampa, e tubo enrolado em folha de alumínio. </li></ol> 2. Medir o Crescimento da E. Clones coli <ol><li> Remover placas de 37 ° C incubadora. Retire e reserve as tampas, e placas de lugar para a plataforma de carregamento revista fornecido com o RapidStak, até um máximo de 25 placas. Nota: A placa na parte inferior da pilha será o primeiro a ser lido. Certifique-se de acompanhar a ordem das placas, como o software não registra isso. </li><li> Remover uma revista da Stak Rapid, garantir que ele está vazio, e empurre-o para a pilha de pratos para ser lido. Agarrá-lo pela alça, e as placas devem todos ser carregados na revista. Carregar a revista no RapidStak. Nota: A revista tem um pequeno parafuso no canto denotando que canto os poços A1 das placas deve ir. A revista só vai montar na RapidStak em uma orientação. </li><li> Abra o programa RE SkanIt no computador ligado às máquinas. Selecionar &quot;New Session&quot; e nomeá-la adequadamente. Escolha &quot;Fundo Plano Corning 384-placa bem&quot; como o tipo de prato. </li><li> Na &quot;Placa Layout&quot; da área, selecione a opção &quot;Wizard&quot; botão, e escolhê-lo para adicionar 384 incógnitas para seu prato. </li><li> No &quot;Protocolo&quot;, selecione o &quot;Bem Loop&quot; opção, e entrar para 384 poços. A &quot;Bem Loop&quot; ícone aparecerá no fluxo de árvore no lado esquerdo da tela. Selecione o ícone e clique para adicionar &quot;Medição fotométrica&quot;. Configurá-lo para ler em 600nm. </li><li> Salve o seu protocolo com um nome único, e feche o programa RE SkanIt. </li><li> No computador, abra o programa PolaraRS. </li><li> Na página principal, haverá tabela listando os instrumentos conectado ao dispositivo RapidStak. O VarioSkan deve ser no lado esquerdo desta tabela. Sob o título VarioSkan, haverá dois links; &quot;RunSession&quot; e &quot;Incubar&quot;. Clique no botão &quot;RunSession&quot; opção. </li><li> Uma nova janela, a janela de teste, aparecerá com um fluxograma no meio. Selecione a opção &quot;RunSession&quot; item (deve ser o item presente apenas). No lado direito da tela um menu drop-downirá aparecer. Encontrar o nome do seu RE SkanIt salvo executar neste menu. Nota: Parece haver qualquer ordenamento racional para esse menu. Não é por ordem alfabética, ou por data de adição, ou relacionado ao local onde o computador do protocolo é salvo. Isto significa que você deve olhar através de todos os protocolos antes de encontrar o seu próprio, que é uma dor. </li><li> Uma vez selecionado o protocolo, no canto superior direito clique em &quot;Executar este ensaio&quot;. </li><li> Uma caixa irá aparecer, pedindo-lhe para indicar que a revista para usar como fonte, e que a revista está vazio. Caixa inferior na tela corresponde à revista da frente. [Opcional: ele pede que você digite o número de placas carregadas para determinar uma estimativa para a quantidade de tempo que levará. Esta estimativa é normalmente muito longe.] </li><li> Garantir tanto a RapidStak eo VarioSkan estão ligados, e pressione &quot;OK&quot;. </li><li> O RapidStak irá carregar automaticamente suas placas para o leitor de placas, permitindo medições contínuas de chapas. Para ler 25 placas leva aproximadamente 50 minutos. Nota: Recomenda-se observar o carregamento primeira placa na VarioSkan para garantir o alinhamento correcto das máquinas. Se o RapidStak não carrega o leitor de placas corretamente, utilize o &quot;Pause este ensaio&quot; botão no canto superior direito da janela PolaraRS. </li><li> Uma vez que o VarioSkan é feito de ler todos os pratos, retire o carregador cheio e colocá-lo na plataforma de carga revista. Levante o retângulo externo da plataforma, ea revista deve deslizar, deixando as placas de pé em uma pilha no meio. Substituir as tampas para as placas apropriadas. </li></ol> 3. Além do Mix Ensaio para Cada Placa <ol><li> Preparar a mistura de ensaio usando o estoque 10x premade da mistura de lise (10% Triton X-100, ris 100mM, EDTA 10mM) em tampão acetato de potássio 50 mM pH 5,5. Prepare um estoque de até 75mg/mL substrato DNP cellobioside em DMSO, certificando-se o substrato estiver completamente dissolvido. Adicionar DNP-cellobioside solução estoque de misturar ensaio para uma concentração final de 0.1mg/mL. Cada placa usará cerca de 20 mL de solução, além de fazer uma 50mL adicionais para permitir volume morto. Nota: DNP Cellobioside não é facilmente solúvel em água, de modo a dissolução em DMSO aumenta a solubilidade. A presença de DMSO na solução final do ensaio não tem nenhum efeito observável. </li><li> Configure o qFill3 como instruções do fabricante com a garrafa media ligados ao colector através do tubo estéril. Programá-lo para a quantidade adequada de mídia, e configurá-lo para preencher um volume de 45uL em cada poço. </li><li> Purgar o ar da tubulação e múltiplas usando o recurso de purga do robô até que a mídia é visível proveniente de cada pino da placa base. </li><li> Adicione a mistura de ensaio para cada placa usando o qFill3. Cada prato leva aproximadamente 20 segundos para encher. </li><li> Uma vez mix de ensaio é adicionada, incubar as placas a 37 ° C em uma caixa de umidade para 12-16 horas. Nota: Mais de incubação das placas uma vez que o mix de ensaio é adicionada fará com que a evaporação nos poços externa da placa, produzindo valores mais elevados de absorbância do que o observado para os poços no interior. Isso pode ser compensado por placas de incubação em câmara úmida. </li></ol> 4. Absorbância leitura de Clones Analisada <ol><li> Remover placas de 37 ° C incubadora. Retire e reserve as tampas, e placas de lugar para a plataforma de carregamento revista fornecido com o RapidStak, até um máximo de 25 placas. Nota: A placa na parte inferior da pilha será o primeiro a ser lido. Certifique-se de acompanhar a ordem das placas, como o software não registra isso. </li><li> Remover uma revista da Stak Rapid, garantir que ele está vazio, e empurre-o para a pilha de pratos para ser lido. Agarrá-lo pela alça, e as placas devem todos ser carregados na revista. Carregar a revista no RapidStak. Nota: A revista tem um pequeno parafuso no canto denotando que canto os poços A1 das placas deve ir. A revista só vai montar na RapidStak em uma orientação. </li><li> Abra o programa RE SkanIt no computador ligado às máquinas. Selecionar &quot;New Session&quot; e nomeá-la adequadamente. Escolha &quot;Fundo Plano Corning 384-placa bem&quot; como o tipo de prato. </li><li> Na &quot;Placa Layout&quot; da área, selecione a opção &quot;Wizard&quot; botão, e escolhê-lo para adicionar 384 incógnitas para seu prato. </li><li> No &quot;Protocolo&quot;, selecione o &quot;Bem Loop&quot; opção, e entrar para 384 poços. A &quot;Bem Loop&quot; ícone aparecerá no fluxo de árvore no lado esquerdo da tela. Selecione o ícone e clique para adicionar &quot;Medição fotométrica&quot;. Configurá-lo para ler em 400nm. </li><li> Salve o seu protocolo com um nome único, e feche o programa RE SkanIt. </li><li> No computador, abra o programa PolaraRS. </li><li> Na página principal, haverá tabela listando os instrumentos conectado ao dispositivo RapidStak. O VarioSkan deve ser no lado esquerdo desta tabela. Sob o título VarioSkan, haverá dois links; &quot;RunSession&quot; e &quot;Incubate &quot;. Clique no botão&quot; RunSession opção &quot;. </li><li> Uma nova janela, a janela de teste, aparecerá com um fluxograma no meio. Selecione a opção &quot;RunSession&quot; item (deve ser o item presente apenas). No lado direito da tela um menu drop-down aparecerá. Encontrar o nome do seu RE SkanIt salvo executar neste menu. </li><li> Uma vez selecionado o protocolo, no canto superior direito clique em &quot;Executar este ensaio&quot;. </li><li> Uma caixa irá aparecer, pedindo-lhe para indicar que a revista para usar como fonte, e que a revista está vazio. Caixa inferior na tela corresponde à revista da frente. [Opcional: ele pede que você digite o número de placas carregadas para determinar uma estimativa para a quantidade de tempo que levará. Esta estimativa é normalmente muito longe.] </li><li> Garantir tanto a RapidStak eo VarioSkan estão ligados, e pressione &quot;OK&quot; </li><li> O RapidStak irá carregar automaticamente suas placas para o leitor de placas, permitindo medições contínuas de chapas. Nota: Recomenda-se observar o carregamento primeira placa na VarioSkan para garantir o alinhamento correcto das máquinas. Se o RapidStak não carrega o leitor de placas corretamente, utilize o &quot;Pause este ensaio&quot; botão no canto superior direito da janela PolaraRS. </li><li> Uma vez que o VarioSkan é feito de ler todos os pratos, retire o carregador cheio e colocá-lo na plataforma de carga revista. Levante o retângulo externo da plataforma, ea revista deve deslizar, deixando as placas de pé em uma pilha no meio. As placas podem ser eliminadas de acordo com seus procedimentos de laboratório. </li><li> Para exportar as leituras de absorbância, software open RE SkanIt, e escolha &quot;Abrir um arquivo existente&quot;. </li><li> Selecione o diretório onde você salvou a sua sessão, bateu o ícone &quot;+&quot; para expandir a lista e sob o título rubrica será opções rotuladas &quot;Container 1&quot; para &quot;Container N&quot;, dependendo do número de placas. Selecione a primeira placa a ser analisado. </li><li> Na barra de menu no topo da página, selecione &quot;Processamento de Dados&gt; Relatório / Export&quot; </li><li> Escolha as opções desejadas para a exportação. Nota: Eu normalmente selecione &quot;Layout da placa&quot; e &quot;fotométrica&quot; ​​dados para a exportação. </li><li> Clique em &quot;Exibir relatório&quot; e depois &quot;File&gt; Save&quot;. Escolha o diretório desejado. O formato de saída é uma planilha do Microsoft Excel </li></ol> 5. Resultados representante Um exemplo de leituras de absorbância de uma placa de 384 único poço que contém um clone positivo é mostrado na Figura 2. Clones positivos mostram um acentuado aumento na absorvância sobre aqueles que não expressam a atividade celulase. Diferenças no tempo de ensaio, local bem no prato, ou concentração DNP (pode ser introduzido através da filtragem de não-dissolvido DNP) pode afetar as leituras de absorbância absoluta. Leituras de absorbância relativa, como a diferença de absorvância acima da média ou média placa de coluna, são um método mais robusto de identificar clones celulase positivo. Após a identificação dos clones positivos das placas biblioteca, recomenda-se a replicar todos os clones positivos para um novo prato para a triagem secundária. Isso elimina os efeitos decorrentes da variação local bem ou placa e permite uma maior comparação direta entre clones positivos. <img src="/files/ftp_upload/2461/2461fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Fluxograma do ensaio de alto rendimento para uma biblioteca metagenomic clonado em E. coli e armazenadas a -80 ° C. <img src="/files/ftp_upload/2461/2461fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Leituras de absorbância de uma placa de 384 poços contendo um clone positivo. Celulase clones positivos podem ser identificados por absorbância aumentou significativamente ao longo clones negativo.

<ol>
	<li>Rubin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+of+cellulosic+biofuels.">Genomics of cellulosic biofuels.</a> Nature. 454, 841-845 (2008).</li><li>Voget, S., Steele, H. L., Streit, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+metagenome+derived+halotolerant+cellulase.">Characterization of a metagenome derived halotolerant cellulase.</a> J. Biotechnol. 126, 26-36 (2006).</li><li>Duan, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+partial+characterization+of+novel+genes+encoding+acidic+cellulases+from+metagenomes+of+buffalo+rumens.">Isolation and partial characterization of novel genes encoding acidic cellulases from metagenomes of buffalo rumens.</a> J. Appl. Microbiol. 107, 245-256 (2009).</li><li>Zhang, Y. H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outlook+for+cellulase+improvement:+Screening+and+selection+strategies.">Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies.</a> Biotech. Advances. 24, 452-481 (2006).</li><li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen.">Use of congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Appl. And Environ. Microbiol. 43, 777-780 (1982).</li><li>Sharrock, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulase+assay+methods:+a+review.">Cellulase assay methods: a review.</a> J. Biochem and Biophys Methods. 17, 81-106 (1988).</li><li>Kasana, R. C., Salwan, R., Dhar, H., Dutt, S., Gulati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+easy+method+for+detection+of+microbial+cellulases+on+agar+plates+using+Gram's+Iodine.">A rapid and easy method for detection of microbial cellulases on agar plates using Gram's Iodine.</a> Curr. Microbiology. 57, 503-507 (2008).</li><li>Huang, J. S., Tang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+assay+for+cellulase+and+dextranase.">Sensitive assay for cellulase and dextranase.</a> Anal. Biochem. 73, 369-377 (1976).</li><li>Tull, D., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cellulases+and+xylanases:+A+detailed+kinetic+study+of+the+exo-beta-1,4-glycanase+from+Cellulomonas+fimi.">Mechanisms of cellulases and xylanases: A detailed kinetic study of the exo-beta-1,4-glycanase from Cellulomonas fimi.</a> Biochemistry. 33, 6363-6370 (1994).</li><li>Martinez, A., Bradley, A. S., Waldbauer, J. R., Summons, R. E., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteorhodopsin+photosystem+gene+expression+enables+photophosphorylation+in+a+heterologous+host.">Proteorhodopsin photosystem gene expression enables photophosphorylation in a heterologous host.</a> PNAS. 104, 5590-5595 (2007).</li><li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+Insert+Environmental+Genomic+Library+Production.">Large Insert Environmental Genomic Library Production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Martinez, A., Tyson, G. W., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+known+and+novel+phosphonate+utilization+pathways+in+marine+bacteria+revealed+by+functional+screening+and+metagenomic+analyses.">Widespread known and novel phosphonate utilization pathways in marine bacteria revealed by functional screening and metagenomic analyses.</a> Environ Microbiol. 12, 222-238 (2010).</li><li>Wild, J., Hradecna, Z., Szybalski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+amplifiable+BACs:+Switching+from+single-copy+to+high-copy+vectors+and+genomic+clones.">Conditionally amplifiable BACs: Switching from single-copy to high-copy vectors and genomic clones.</a> Genome Research. 12, 1434-1444 (2002).</li><li>Johnson, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sacchirification+of+complex+cellulosic+substrates+by+the+cellulase+system+from+Clostridium+thermocellum.">Sacchirification of complex cellulosic substrates by the cellulase system from Clostridium thermocellum.</a> Appl Environ Microbiology. 43, 1125-1132 (1982).</li><li>Stutzenberger, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulase+Production+by+Thermomonospora+curvata+isolated+from+municipal+solid+waste+compost.">Cellulase Production by Thermomonospora curvata isolated from municipal solid waste compost.</a> Appl Environ Microbiol. 22, 147-152 (1971).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Uma tela de alto rendimento para a detecção rápida da atividade celulolítica de uma biblioteca genômica inserir grandes metagenomic DNA expressa em E. coli é descrita neste protocolo. Este método é uma melhoria em relação ao ensaio de Red CMC / Congo comumente utilizados na literatura. É solução baseada, e permite um pot-triagem química em 384 poços pratos, com o resultado final como leituras de absorbância de um leitor de placas permitindo a análise quantitativa. A automação de cada etapa de...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>qPix2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>With 384-pin gridding head</td>
</tr>
<tr>
<td>qFill3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>With 384-well manifold</td>
</tr>
<tr>
<td>Varioskan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RapidStak</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo-Fisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Connected to Varioskan</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro90 Detergent</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cole-Parmer</td>
<td>18100-00</td>
<td>Diluted to 2% in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Major Lab Supplier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diluted to 80% in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Chloramphenicol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C0378</td>
<td>12.5mg/mL in ethanol</td>
</tr>
<tr>
<td>LB broth, Miller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP1426-2</td>
<td>25g/L, autoclaved</td>
</tr>
<tr>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>384-well flat bottom plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3680</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-(+)-Arabinose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3256</td>
<td>100mg/mL in water</td>
</tr>
<tr>
<td>Potassium Acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>P171</td>
<td>50mM in water, autoclaved, adjusted to pH 5.5 with HCl</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizma hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T3253</td>
<td>In TE buffer solution, 100mM</td>
</tr>
<tr>
<td>EDTA disodium salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E5134</td>
<td>In TE buffer solution, 10mM</td>
</tr>
<tr>
<td>2,4-dinitrophenyl cellobioside</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Provided by Dr. Steve Withers, UBC</td>
</tr>
<tr>
<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D8418</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a high throughput screen for biomining cellulase activity from metagenomic libraries

Celulose, a mais abundante fonte de carbono orgânico no planeta, tem amplas aplicações industriais, com ênfase crescente na produção de biocombustíveis 1. Métodos químicos para modificar ou degradar a celulose normalmente requerem ácidos fortes e altas temperaturas. Como tal, métodos enzimáticos tornaram-se proeminentes no processo de bioconversão. Enquanto a identificação de celulases ativa a partir de isolados de bactérias e fungos tem sido pouco eficaz, a grande maioria dos micróbios na natureza resistir cultivo de laboratório. Genômica ambiental, também conhecida como screening metagenomic abordagens, têm uma grande promessa para fazer a ponte de cultivo na busca de enzimas bioconversão romance. Abordagens triagem metagenomic com sucesso recuperado celulases romance de ambientes tão variados quanto os solos 2, 3 e rúmen de búfalo da região posterior do intestino de cupins 4 usando placas de carboximetilcelulose (CMC) agar coradas com corante vermelho congo (com base no método de Teather e Wood 5). No entanto, o método CMC é limitada em débito, não é quantitativa e manifesta um baixo sinal-ruído 6. Outros métodos têm sido relatados 7,8, mas cada um usa ensaio agar plate-based, o que é indesejável para high-throughput screening de bibliotecas genômicas grande inserção. Aqui nós apresentamos uma solução baseada em tela para a atividade celulase utilizando um dinitrofenol cromogênico (DNP)-cellobioside substrato 9. Nossa biblioteca foi clonado no controle de cópia pCC1 fosmid para aumentar a sensibilidade do ensaio através da indução no número de cópias 10. O método usa um pot-química em 384 poços microplacas com a leitura final, fornecida como uma medida de absorbância. Essa leitura é quantitativa, sensíveis e automatizados com um caudal de até 100X placas de 384 poços por dia, utilizando um manipulador de líquidos e leitor de placas com sistema de empilhamento em anexo.

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A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Este protocolo descreve um ecrã de alta taxa de transferência para a atividade celulolítica de uma biblioteca metagenomic expressa em Escherichia coli. A tela é solução baseada e altamente automatizado, e usa um pot-química em 384 microplacas bem com a leitura final como uma medida de absorbância.

A tela de elevada capacidade para Biomining Atividade da celulase de Bibliotecas metagenomic

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

a-high-throughput-screen-for-biomining-cellulase-activity-from

Research

JoVE Journal

Biology

15.0K visualizações.  University of British Columbia - UBC. Este protocolo descreve um ecrã de alta taxa de transferência para a atividade celulolítica de uma biblioteca metagenomic expressa em Escherichia coli. A tela é solução baseada e altamente automatizado, e usa um pot-química em 384 microplacas bem com a leitura final como uma medida de absorbância.

Vídeo: A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

Grande Escala Telas de Bibliotecas metagenomic

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Biologia

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

Alto rendimento Yeast Tela superexpressão Plasmid

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

High Throughput Screening da atividade endoglucanase de fungos em Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other genome-wide analyses. mRNA-Seq even opens the gate for gene expression analysis of non-sequenced genomes. mRNA-Seq offers high sensitivity, a large dynamic range and allows measurement of transcript copy numbers in a sample. Illumina&#x2019;s genome analyzer performs sequencing of a large number (&gt; 107) of relatively short sequence reads (&lt; 150 bp).The &quot;paired end&quot; approach, wherein a single long read is sequenced at both its ends, allows for tracking alternate splice junctions, insertions and deletions, and is useful for de novo transcriptome assembly.
One of the major challenges faced by researchers is a limited amount of starting material. For example, in experiments where cells are harvested by laser micro-dissection, available starting total RNA may measure in nanograms. Preparation of mRNA-Seq libraries from such samples have been described1, 2 but involves significant PCR amplification that may introduce bias. Other RNA-Seq library construction procedures with minimal PCR amplification have been published3, 4 but require microgram amounts of starting total RNA.
Here we describe a protocol for the Illumina Genome Analyzer II platform for mRNA-Seq sequencing for library preparation that avoids significant PCR amplification and requires only 10 nanograms of total RNA. While this protocol has been described previously and validated for single-end sequencing5, where it was shown to produce directional libraries without introducing significant amplification bias, here we validate it further for use as a paired end protocol. We selectively amplify polyadenylated messenger RNAs from starting total RNA using the T7 based Eberwine linear amplification method, coined &quot;T7LA&quot; (T7 linear amplification). The amplified poly-A mRNAs are fragmented, reverse transcribed and adapter ligated to produce the final sequencing library. For both single read and paired end runs, sequences are mapped to the human transcriptome6 and normalized so that data from multiple runs can be compared. We report the gene expression measurement in units of transcripts per million (TPM), which is a superior measure to RPKM when comparing samples7.

Here we describe a method for preparation of both single read and paired end Illumina mRNA-Seq sequencing libraries for gene expression analysis based on T7 linear RNA amplification. This protocol requires only 10 nanograms of starting total RNA and generates highly consistent libraries representing whole transcripts.

Leia única e emparelhados End mRNA-Seq Bibliotecas Illumina de 10 nanogramas RNA total

Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microinjeções de ouriço do mar zigotos

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

Um manual de tela pequena molécula Aproximando de alta capacidade Usando embriões Zebrafish

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Análise qPCRTag - A High Throughput, PCR em Tempo Real Ensaio para Sc2.0 Genotipagem

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

Um Protocolo de Avaliação Funcional da Whole-Protein saturação mutagênese Bibliotecas Utilizando-High Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;