1. Processo de hibridização Um tubo de hibridização terá 1 ou 2 membranas (tamanho 22 por 22 cm). Use 50 ml de mistura de hibridização e 0,5 mg de DNA sonda (10 concentração ng / ml final) por tubo de hibridização. Para melhores resultados, use gel de DNA purificado como sonda. Se ampliação preparação da sonda, aumentar o número de tubos em vez de aumentar a quantidade de reagentes por tubo. Sonda preparação (0,5 mg DNA): <ol><li> Diluir 15 mL de cross-linker solução com 60 mL de água. </li><li> Diluir DNA a 10 ng / mL com água a 50 mL de volume total em um microtubo com tampa de rosca. </li><li> Desnaturar DNA por 5 minutos em água fervente. </li><li> Transferir rapidamente para o gelo e deixe esfriar por 5 min. Girar por alguns instantes. </li><li> Adicionar 50 ul de tampão de reação e misture delicadamente. </li><li> Adicionar 10 ml de reagente de rotulagem e misture delicadamente. </li><li> Adicionar 50 ul da solução cross-linker diluída a partir do passo 1 e misture delicadamente. Vortex suavemente e girar rapidamente. </li><li> Incubar a 37 ° C por 30 min. </li><li> Manter em gelo por até 2 h ou adicionar um volume igual de 100% de glicerol e armazenar a -20 ° C. Nota: Utilize a água fornecida com o kit. Manter todos os reagentes no gelo, salvo indicação contrária. </li></ol> Preparação de membrana e hibridização <ol><li> Pré-aqueça 50 ml de tampão de hibridação e tubo de hibridação a 60 ° C. </li><li> Adicione o tampão de hibridação para o tubo de hibridização. Roll-up de membrana (s) e adicionar ao tubo de hibridização. (Se a adição de 2 membranas por tubo, primeiro rolo de uma membrana completamente, então arregaçar a membrana outros em cima na mesma direção.) </li><li> Incube o tubo de hibridação a 60 ° C por pelo menos ½ h. (Certifique-se de membrana (s) ficar encharcado completamente.) </li><li> Transferência de cerca de 1 ml de tampão de hibridação com uma pipeta longo do tubo de hibridização para o tubo contendo a sonda marcada. Vortex suavemente e girar rapidamente. Transfira a mistura de volta ao tubo de hibridização. </li><li> Incubar a 60 ° C durante a noite. Nota: Use uma pinça e luvas ao manusear membranas. Misture o conteúdo dos tubos de hibridização delicadamente, pois a agitação excessiva fará com que a formação permanente de espuma indesejável. Membranas devem ser adicionados em condições molhadas; mergulhar em tampão de hibridação ou água se necessário e drenar o excesso de líquido antes de acrescentar. </li></ol> 2. Procedimento de detecção Membranas de lavar <ol><li> Pré-aqueça o tampão de lavagem principal a 60 ° C. (Use o forno microondas e / ou placa de aquecimento.) </li><li> Se houver 2 membranas em um tubo de hibridização, a transferência de uma membrana para um ambiente limpo, pré-aquecido tubo de hibridização, vazio. </li><li> Brevemente lavar tubo de hibridização com cerca de 50 ml de tampão de lavagem primária. </li><li> Adicionar cerca de 100 ml de tampão de lavagem primária para tubo de hibridização e incubar a 60 ° C por 10 min. </li><li> Repita o passo 3 e 4. </li><li> Transferência de membrana para lavagem de contentores e incubar com pelo menos 250 ml de tampão de lavagem secundária em temperatura ambiente por 5 min. </li><li> Repita a etapa 6. Nota: As membranas podem ser mantidos no tampão de lavagem secundária em temperatura ambiente por até ½ h antes da geração do sinal. </li></ol> Geração de sinal e detecção (procedimento de uma membrana) <ol><li> Dois pedaços de fita SaranWrap flat para o tampo da mesa (uma para o passo 2 e um para a etapa 4). </li><li> Cuidadosamente drenar o tampão em excesso da membrana, tocando os cantos da membrana contra a lateral do recipiente e transferência da membrana para o SaranWrap (lado da amostra para cima). </li><li> Despeje 07/06 ml de reagente ECF sobre a membrana e enrole vezes Saran mais de membrana. Cuidadosamente distribuir ECF reagente sobre a membrana suavemente movendo um Kimwipe sobre o SaranWrap. Incubar por 5 min. </li><li> Drenar o excesso de reagente ECF da membrana e transferi-lo para novas SaranWrap, embrulhe vezes ao longo da membrana, e selar as bordas com fita adesiva. Cobrir a membrana com papel alumínio. Incubar por 1-2 horas. </li><li> Prepare o vidro do scanner através da distribuição de 1-2 ml de reagente ECF sobre a placa de vidro. Em seguida, transferir a membrana para a placa de vidro (lado da amostra para baixo) e distribuir outra ml de reagente ECF 02/01 sobre a membrana. Sobreposição com SaranWrap e empurre cuidadosamente todas as bolhas de ar longe da membrana. (Você pode colocar uma placa rígida em cima da membrana SaranWrap manter pressionada contra a placa de vidro.) </li><li> Use o Fuji FLA-5100 scanner de fluorescência (&quot;1 laser 1 imagem&quot; mode) com as seguintes configurações: excitação 473 nm, a detecção de filtro LPB (510 nm), resolução de 50 mm, graduação sinal de 16 bits, CH1 400 V. (Scan leva cerca de 15-20 minutos por membrana de tamanho 22 por 22 cm.) Opcional: </li><li> Deixe descansar por 2-4 horas (ou mais). </li><li> Repita scan como no passo 6. </li></ol> 3. Stripping e armazenamento de procedimento (NUF versão) <ol><li> Transferência de membrana para 100% ethanol e incubar em temperatura ambiente por 10 min com agitação suave. </li><li> Substituir com etanol 100% frescos e incubar overnight em temperatura ambiente. (Membrane pode permanecer em etanol por vários dias.) </li><li> Substituir de etanol com água destilada e incubar em temperatura ambiente por 10 min. </li><li> Adicione 100 ml de água e 5 ml de 10% SDS (final SDS 0,5%) a um tubo de hibridização e misture delicadamente. Adicionar membrana. </li><li> Incubar a 80 ° C por 1 h. </li><li> Transferência de membrana para um recipiente limpo e vazio. </li><li> Adicione 500 ml de água e 5 ml de SDS 10% (final SDS 0,1%) e um copo de calor a uma fervura vigorosa no forno de microondas. </li><li> Despeje o próximo ponto de ebulição 0,1% SDS solução sobre a membrana e agite suavemente por alguns minutos. Deixe esfriar até a temperatura ambiente. </li><li> Enxágüe em pelo menos 250 ml de estéril 100 mM Tris pH 8 por pelo menos 10 min. </li><li> Enrole membrana em SaranWrap e bordas cuidadosamente estreita com fitas. Armazenar a 4 ° C. (Membranas nunca deve secar.) </li></ol>

O procedimento de stripping não foi otimizado. No entanto, o procedimento de stripping dada na instrução do fabricante (2 lavagens cada uma, 10 min em etanol 100%, uma lavagem de 1 hora a 60 ° C em 0,5% SDS) é insuficiente. Pelo menos de incubação durante a noite em etanol a 100% é necessário para dissolver o produto da reação ECF; de incubação de vários dias em etanol 100% parece não ter efeitos adversos sobre a capacidade de reprobe da membrana. Tratamento do fabricante SDS também parece ser insuficiente. NUF tentou 1 hora...

Combinação pacote RPN3692 = RPN3680 + RPN3685

large-scale screens of metagenomic libraries

Metagenomic bibliotecas fragmentos contíguos grande arquivo de seqüências genômicas de microrganismos de cultivo sem a necessidade de prévio. Gerando um procedimento simplificado para a criação de bibliotecas e triagem metagenomic é, portanto, útil para eficiente de alto rendimento investigações sobre as propriedades genéticas e metabólicas dos agenciamentos microbiana inculta. Aqui, protocolos de chave são apresentados em vídeo, o que propomos é o formato mais útil para descrever com precisão um longo processo que depende alternadamente instrumentação robótica e intervenções (humano) manual. Primeiro, nós empregada robótica para detectar clones biblioteca para as membranas de alta densidade macroarray, cada um dos quais pode conter colônias duplicar 20-4 biblioteca placas de 384 poços. Automação é essencial para este procedimento não só quanto à precisão e velocidade, mas também devido à miniaturização de escala necessária para atender o grande número de clones de biblioteca em alta densidade arranjos espaciais. Uma vez gerado, o próximo demonstrou como as membranas macroarray podem ser selecionados para genes de interesse usando versões modificadas de protocolos padrão para rotulagem sonda, hibridação da membrana e detecção do sinal. Complementou-se o demonstração visual desses procedimentos com descrição escrita pormenorizada das etapas envolvidas e os materiais necessários, os quais estão disponíveis on-line ao lado do vídeo.

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Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Grande Escala Telas de Bibliotecas metagenomic

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...