Este protocolo apresenta os métodos de menor custo e tecnologia mais baixos para servir o envelhecimento em elegans marinhos. Um organismo modelo influente na biologia do envelhecimento. A maior vantagem desses métodos é a facilidade de implementação, utilizando equipamentos e materiais de baixo custo.
Tornando-os favoráveis a qualquer pesquisador, independentemente da experiência ou do financiamento disponível. Como estudos antigos de envelhecimento, há variabilidade natural na saúde dentro das populações. Portanto, é essencial que os experimentos sejam realizados em animais saudáveis, bem alimentados e fortemente sincronizados.
Para garantir a incapacidade de rip Comece a preparação de uma mídia de crescimento de nematoide de um litro ou placa de NGM auger. Adicione 2,5 gramas de tom de pep, 3,0 gramas de cloreto de sódio e 20 gramas de auger em um frasco de um litro com uma barra de mexida e adicione água destilada a um volume final de 970 mililitros. Esterilize a solução de NGM auger em um frasco de um litro usando uma autoclave padrão ou esterilizador de mídia.
E deixe a solução mexer até esfriar a 60 a 75 graus Celsius. Enquanto a solução esfria, aqueça um banho de contas de 65 a 70 graus Celsius. Uma vez que a solução NGM auger esfria a 60 a 75 graus Celsius.
Adicione os aditivos líquidos e deixe a solução se misturar completamente por cinco minutos. Em seguida, submergir o frasco em um banho de contas a 65 a 70 graus Celsius para evitar que a mídia se solidifique enquanto derrama na placa. Pipeta de 9 a 11 mililitros da solução em cada placa de 60 mililitros.
Quando terminar, coloque a pipeta de volta na solução aquecida para manter a temperatura e para evitar que qualquer mídia se solidifique na pipeta. Repita o procedimento para todas as placas e deixe que as placas de NGM se solidifiquem durante a noite. Uma vez solidificado, use-os para semear placas com bactérias ou armazene as placas em recipientes selados por até três meses a quatro graus Celsius para sincronizar os vermes através do branqueamento.
Colete os nematoides despejando uma pequena quantidade de solução M9 em uma placa contendo os vermes sem encher demais a placa de Petri. Em seguida, gire a solução M9 suavemente para soltar vermes dos gramados bacterianos. Em seguida, colete vermes gravid adultos em um tubo de 15 mililitros com uma pipeta sorológica.
Evitando perfurar o auger com a ponta da pipeta. Pellule os animais por centr por 30 segundos a 1100 vezes G, e aspire o supernatante. Adicione cinco mililitros da solução de branqueamento recém-preparada para a pelota de verme, e verifique os vermes sob um microscópio dissecando a cada poucos minutos, juntamente com um tremor vigoroso intermitente até que todos os corpos de vermes adultos sejam dissolvidos e apenas ovos são deixados na mistura.
Em seguida, pelota os ovos girando para baixo a mistura de alvejante de ovo por 30 segundos a 1100 vezes G e aspirar a solução de branqueamento. Em seguida, lave os ovos pelotados somando 15 mililitros de solução M9 e invertendo o tubo quatro ou cinco vezes para dispersar os ovos e a solução. Novamente, centrifufique o tubo por 30 segundos a 1100 vezes G para pelotar os ovos e aspirar a solução M9.
Faça a lavagem quatro vezes para eliminar qualquer alvejante da mistura de ovos. Após a quarta lavagem centrífuga aspira a solução M9 de 100 microliters para dois mililitros, dependendo do número total de vermes branqueados. Agite bem os ovos para quebrar os aglomerados e garantir que os ovos estejam totalmente ressuspendidos na solução M9.
Alternativamente, os animais podem ser L um preso por uma sincronização temporal mais apertada adicionando 10 a 12 mililitros de solução M9 à pelota de ovo em um tubo de crônica de 15 mililitros. Deixe os vermes girarem em um rotador por até 24 horas a 20 graus Celsius. Para aproximar o ovo ou l uma pipeta de concentração quatro microlitrais da mistura de ovos em uma placa NGM sentada com bactérias.
Em seguida, conte e calcule os ovos presentes por microliter de mídia. Repita a contagem três ou quatro vezes para melhorar a aproximação, com base na placa de aproximação, no número apropriado de ovos ou L um animais presos na placa de NGM auger semeada com bactérias de escolha. Para medir o comportamento da locomotiva dos vermes através de espancamento.
Mova um pequeno número de worms adultos do dia um de uma placa de NGM para 10 a 20 microliters de solução M9 sob um escopo de dissecação. Em seguida, concentre-se em um verme de cada vez e conte o número de vezes que o espécime muda de côncavo para formação convexa em 15 segundos. Use um contador de mão e um temporizador e repita o procedimento para 10 a 15 worms.
Aduca os vermes até a idade desejada e repita as medidas de espancamento em todas as idades desejadas. Como visualizado, vermes mais velhos batem em velocidades significativamente mais lentas. Para medidas de quantidade e fertilidade.
Em 10 a 15 vermes elegans caenorhabditis, desloque l quatro vermes em uma placa ngm auger separada semeada com bactérias de escolha. Permita que os animais cresçam durante a noite a 20 graus Celsius e certifique-se de que um lote recém-semeado de placas esteja pronto para o dia seguinte. Para medir a quantidade de ovos colocados por Caenorhabditis elegans transfira os vermes adultos para uma lâmina de NGM fresca semeada com essa bactéria saqueada a cada 12 a 24 horas por sete a oito dias ou até que os ovos não sejam mais visíveis e conte o número de ovos colocados nas placas.
Para medir o tamanho da ninhada de Caenorhabditis elegans Transfira os vermes adultos para uma placa de NGM fresca semeada com bactérias a cada 12 a 24 horas, ou sete a oito dias ou até que a prole não seja mais visível. Mantenha todas as placas contendo ovos a 20 graus Celsius. Dois dias depois de transferir vermes.
Conte a descendência desenvolvida na placa. Conte todos os vermes vivos e em desenvolvimento na fase L quatro ou antes para garantir que a geração F duas não confluna resultados. Remova todos os vermes da placa como são contados.
Mantenha as placas por mais um a dois dias antes de pontuá-las novamente para garantir que quaisquer animais com eclosão ou desenvolvimento atrasados não sejam perdidos. O efeito do método de esterilização sobre a vida útil dos nematoides tipo N2 selvagem mostrou que as mudanças na vida útil dos vermes cultivados nas placas de NGM auger foram semelhantes às dos vermes cultivados nas placas ngm auger FUDR ou no glp quatro animais mutantes BN2 cultivados nas placas de NGM auger. O animal knockdown de curta duração do HSF mostrou um declínio significativo na vida útil de todas as condições.
Uma diminuição substancial no número de ovos colocados e tamanho de ninhada foi encontrada no HSF um sobre animais de expressão em comparação com os controles do tipo selvagem. Alguns animais de HSF um sobre expressão apresentaram esterilidade completa indicando que a saúde reprodutiva pode ser inversamente correlacionada com a longevidade. A taxa de desarmamento forneceu um método confiável para medir a saúde durante o envelhecimento, medida por uma diminuição significativa da surra em animais velhos em comparação com os jovens.
A sobrevida ao estresse são ensaios confiáveis para medir a saúde do organismo, a tunicamiciccin que causa estresse reticúlume resultou em uma redução da vida útil, independentemente da concentração em comparação com o controle do DMSO. Os altos níveis de paraquat encurtaram significativamente a vida útil, enquanto as baixas concentrações de paraquat aumentaram a vida útil devido ao efeito hormótico. Nos ensaios de tolerância termo, a expressão sobre a HSF aumentou a tolerância termo a 37 graus Celsius Para todos os experimentos de vida e envelhecimento.
É importante lembrar que as técnicas de esterilização podem ter um efeito pleiotrópico na saúde do organismo, o que impacta os resultados. Existem muitas abordagens adicionais e complementares para medir o tempo de saúde se os equipamentos e a infraestrutura estiverem disponíveis, incluindo medições de transcrição, agregação de proteínas de tradução, organela, morfologia e funções metabólicas.
