Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Charles Luetje para fornecer o T-maze e da sala de comportamento. Este trabalho é apoiado pela American Heart Association (a YA), o Instituto Nacional de distúrbio neurológico e Grant Curso R01NS64269 (para RGZ), ea Fundação Pew Charitable (para RGZ).

1. Introdução Neste vídeo, vamos demonstrar dois ensaios comportamentais utilizando Drosophila para demonstrar a medição de locomoção e funções de aprendizagem e de memória que estão comprometidos em doenças neurodegenerativas. Primeiro, vamos mostrar como o comportamento locomotor pode ser medida utilizando o ensaio geotaxis negativo. Em segundo lugar, iremos avaliar o aprendizado ea memória habilidades usando moscas positivamente fototáxico que são treinados para associar luz com um sabor amargo aversivo e depois testados seis horas mais tarde para avaliar as funções de memória. Finalmente, discutiremos as implicações e limitações destes ensaios comportamento. 2. Equipamentos e reagentes <ol><li> Fly trabalho <ul><li> Âmbito estéreo (Zeiss) </li><li> Pequenos pincéis para empurrar moscas </li><li> Drosophila dióxido de carbono (CO 2) aparelho de anestesia (Geneseesci, Inc) </li></ul></li><li> Ensaio Geotaxis negativo <ul><li> 28,5 x 95 Vial Poliestireno mm (Vial Capitol, Inc.) </li><li> Mini Alarme-Timer / Cronômetro (VWR International) </li><li> Canetas Sharpie </li><li> Fita adesiva </li></ul></li><li> Aversivo Assay Supressão fototaxia <ul><li> Cloridrato de quinino (Sigma Aldrich; CAS Number: 6119-47-7) </li><li> Água destilada </li><li> Escala de medição digital para diluição precisos em peso </li><li> Quick Disconnect Connectors, polietileno de alta densidade (Nalgene VWR Catalog No. 62868-021) </li><li> 15 tubo de centrifugação mL (VWR International), corte na marca de 2 mL da extremidade fechada para se encaixar com o adaptador Rápida Conector Disconnect para fonte de luz </li><li> Single-channel pipeta 200 mL de solução de quinino carga em papel filtro de revestimento da câmara </li><li> T-Maze (Simple Sistemas comportamental; Figura 1) </li><li> Folha de alumínio </li><li> Fonte de luz (Zeiss) </li><li> Uma lâmpada com luz vermelha. </li><li> Papel de filtro </li><li> Mini Alarme-Timer / Cronômetro (VWR International) </li></ul></li></ol> 3. Preparando o Flies <ul><li> Moscas são mantidos em meio ágar-fubá-melaço de levedura-padrão a 25 ° C em um 12 hr ciclo claro / escuro. </li><li> Moscas virgem são isolados sob anestesia de dióxido de carbono no dia da eclosão. Para estudos de envelhecimento, as moscas são mantidos em grupos de vinte por frasco e transferido para um frasco de doce a cada 3 dias. É importante o uso de moscas irmão da cruz mesmo dos pais para os estudos de envelhecimento, para minimizar as diferenças decorrentes da base genética. </li><li> Para ambos os ensaios, as moscas são sexados e mantidos em grupos de dez moscas por frasco. A diferença de gênero no comportamento é significativo e é aconselhável não misturar as moscas macho e fêmea em um estudo de como os dados podem ser difíceis de interpretar e reproduzir 6. </li><li> Para o ensaio geotaxis negativo, as moscas são classificados em grupos de dez por frasco e testado uma hora após a anestesia. É importante para moscas para recuperar totalmente da anestesia, pois isso pode ter um efeito sobre as atividades locomotor. </li><li> Para o ensaio APS, moscas de cada grupo são colocadas em um tubo de poliestireno vazio com água papel de filtro umedecido para seis horas antes do ensaio é realizado. Isso garante que as moscas estão famintos antes do ensaio e será mais perceptiva ao gosto aversivo. Pouco antes de o ensaio é realizado, cada voar a partir de um grupo de dez é colocado em um tubo de centrífuga de 15mL vazio, que é então tampado frouxamente, para evitar a fuga. </li></ul> 4. Ensaio Geotaxis negativo <ul><li> Geotaxis geralmente é medido para 10-20 grupos de dez indivíduos de mesmo genótipo ou tratamento (100-200 moscas total para cada genótipo / tratamento) 7. Classificar grupos de dez moscas feminino ou masculino em um aparelho de anestesia CO 2 e colocar cada grupo em um frasco separado. Permitir que pelo menos uma hora para as moscas para recuperar da anestesia. </li><li> Prepare o aparelho de escalada para cada grupo, tanto que dois frascos de poliestireno vazias são unidos por fita vertical frente para o outro. É importante certificar-se que as aberturas dos frascos estão perfeitamente alinhados entre si para fornecer uma superfície uniforme escalada para as moscas. </li><li> Para a parte inferior do frasco, medir uma distância vertical de 8 cm acima da superfície do fundo e marcar cada frasco desenhando um círculo ao redor de toda a circunferência do frasco. </li><li> Transferência de um grupo de dez moscas no menor frasco com cuidado evitando a fuga de qualquer voar. Cobrir imediatamente o menor com o frasco superior e fita de segurança perto da aberturas de contato. Permitir que as moscas que se acostumar com o novo cenário para um minuto antes de realizar o ensaio. </li><li> Bata suavemente as moscas até o fundo do frasco e medir o número de moscas que pode subir acima da marca de 8 cm em 10 segundos após o toque. </li><li> Repita este teste para o mesmo grupo de dez vezes, permitindo um período de descanso de minutos entre cada teste. </li><li> Registrar o número de moscas por grupo que ultrapassou a marca de 8 cm, comopercentual de moscas total. </li></ul> 5. Aversivo Assay Supressão fototaxia (APS Assay) Originalmente adaptado de Le Bourg e Buecher (2002) 4, este ensaio explora o comportamento positivo em fototáxico voa para treiná-los para associar luz com estímulos aversivos (neste caso, gosto amargo do quinino). Após uma fase de formação / condicionado, as moscas do tipo selvagem será capaz de associar a área iluminada com sabor aversivo e evitá-lo. Voa com capacidades de aprendizagem comprometido vai deixar de fazer essa associação. Além disso, o ensaio APS também pode ser usado para medir a função de memória de curto prazo de moscas 5 submetendo já voa treinados para o mesmo teste 6 horas pós-condicionado para testar sua habilidade em se lembrar da tarefa aprendida. <ol><li> Preparar a Solução de Quinina <ul><li> Dissolver cloridrato de quinino em água destilada para fazer uma solução estoque 0,1 M (1.98g em 50 mL de água destilada). A solução de reserva podem ser mantidos a -20 ° C por até um ano, em pequenas alíquotas </li><li> Prepare uma solução de trabalho de 1 M por diluição da solução estoque em água destilada. </li></ul></li><li> Preparando o T-Maze <ul><li> T-maze consiste na coluna central com o alçapão e duas câmaras independentes, uma câmara de &quot;dark&quot; e uma câmara de &quot;iluminado&quot; (Figura 1). </li><li> Preparação de câmara: tomar dois tubos de centrífuga 15mL de plástico e corte em dois marca mL do fundo foi encerrada no final com um manual de serra. Fit os adaptadores de conector em cada extremidade, e selar a conexão com parafilme. O adaptador no final do tubo serve como abertura de entrada para a fonte de luz gooseneck. Conectar um tubo com a fonte de luz e este tubo será a câmara de &quot;iluminado&quot;. Enrole a outro tubo com papel alumínio para servir de câmara de &quot;dark&quot;. </li><li> Adicione 180uL de qualquer água destilada ou solução de quinina para filtro de papel e lugar na câmara de luz. </li><li> Montar o T-maze apertando as câmaras iluminado e escuro em cada lado da coluna central, com a porta da armadilha no meio fechado (Figura 1). </li><li> Inserir a fonte de luz para dentro da câmara iluminada. </li></ul></li><li> Treinamento voa para suprimir fototaxia com estímulos aversivos <ul><li> Desapertar a câmara escura do T-maze e transferência de uma única mosca para essa câmara e imediatamente o parafuso do tubo escuro de volta para o labirinto. </li><li> Desligue as luzes na sala e acender a luz vermelha. </li><li> Permitir a voar para aclimatar na câmara escura por 30 segundos e, lentamente, ligar a fonte de luz que ilumina a câmara iluminada. Abrir lentamente a porta da armadilha que separa as duas câmaras. </li><li> Se a mosca anda à câmara iluminada dentro de 10 segundos, considera-se positivamente fototáxico e está pronto para ser treinado para o ensaio. Falha na fototaxia indica problemas no sistema visual e voa com fototaxia negativos precisam ser excluídos do ensaio. </li><li> Aversivos para Supressão fototaxia formação (APS), toque a mosca que demonstrou fototaxia positivo de volta para a câmara escura, feche a porta da armadilha e desligar a luz. Aguarde 30 segundos de aclimatação. Durante esse tempo, colocar papel de filtro com a solução de quinino na câmara iluminada. Abrir lentamente a porta do alçapão e acenda a luz. Permitir a caminhada voar para o quinino câmara revestida iluminado. Após um minuto, toque no voar de volta para a câmara escura e repetir este 9 vezes mais. (Normalmente, as moscas do tipo selvagem evitar a câmara iluminada após 3-5 testes de formação.) </li><li> Imediatamente após o treinamento, cinco ensaios de teste será realizado. Em cada ensaio, permitem 10 segundos após a luz é acesa para a mosca treinados para andar para a câmara iluminada. Incapacidade de caminhar até o frasco iluminado será registrado como &quot;Pass&quot;, que é equivalente a &quot;tarefa aprendida através de reforço&quot;. A taxa de passagem ao longo de cinco provas consecutivas é gravado e mostrado abaixo na Figura 2 como PC0 (0 condicionado pós hr). </li></ul></li><li> Avaliação de Curto Prazo Função Memória em Flies <ul><li> Após o treinamento inicial e PC0 gravações, cada mosca é colocado de volta em seu frasco original e alimentos mantidos à parte durante seis horas. </li><li> Seis horas após a formação, cada assunto voar para cinco ensaios novamente da mesma maneira como antes, e registrar o número de vezes que o fly evita (passe) ou vai para (não) do frasco iluminado. Esta taxa de aprovação é registrado como PC6 (6 horas pós-condicionado), que é um indicador da memória de curto prazo. </li></ul></li></ol> 6. Interpretação de Dados e Análise Estatística <ol><li> Ensaio Geotaxis negativo <ul><li> Os dados brutos gerados a partir deste ensaio representa o número de moscas cruzar a marca de 8 cm em 10 segundos em cada grupo. Converter este percentual e calcular a taxa de aprovação média de cada grupo mais de 10 sessões. </li><li> Os dados são representados graficamente como uma taxa de aprovação média em cada grupo (genótipo, tratamento, etc) com o erro padrão da média (SEM). </li><li> Diferenças entre os grupospode então ser determinada a ser estatisticamente significativa ou não usando um teste t de Student ou ANOVA. </li></ul></li><li> Aversivo Assay Supressão fototaxia <ul><li> Os dados brutos a partir deste ensaio é representado como o número de vezes que cada mosca evita a câmara iluminada em cinco ensaios sucessivos. A taxa de aprovação é calculado como o percentual de evasão ensaios bem sucedidos ao longo dos ensaios total. Calcular a taxa de aprovação média desta forma para um mínimo de 15 moscas por grupo. </li><li> Os dados são representados graficamente como taxa de aprovação média PC0 (imediatamente após o condicionamento, &quot;aprendizagem&quot; indicador) ou taxa de aprovação média PC6 (6 horas após condicionado; &quot;memória&quot; indicador) com SEM respectivos. </li><li> Índices de aprendizagem e memória são comparados entre os grupos com o tipo selvagem e &quot;geneticamente manipulados benigno&quot; do grupo (como GFP superexpressão moscas) de forma apropriada. </li></ul></li></ol> 7. Resultados representante Nesta experiência de vídeo, estamos avaliando a aprendizagem ea memória e motor déficits em moscas superexpressão humana Tau no sistema nervoso central e comparar o seu desempenho para aqueles de moscas superexpressão GFP. Superexpressão neuronal do Tau humanos em Drosophila tem sido demonstrado que causam vacuolização grave no cérebro 8 e levar a déficits significativos na aprendizagem e funções de memória 9. Conforme mostrado na Figura 2A, 10 dias de idade do sexo masculino ou feminino moscas superexpressão humana Tau têm déficits locomotor significativo em comparação com pareados por idade GFP superexpressão de moscas. Além disso, estas moscas não conseguiu associar a luz com gosto amargo, como mostrado pelo PC0 taxa de aprovação em comparação ao grupo controle, bem como deixar de lembrar essa associação, como mostrado por um declínio na taxa de aprovação PC6 (Figura 2B). Este experimento confirma ainda mais que os modelos de Drosophila pode ser usado para estudar doenças neurodegenerativas humanas e recapitular alguns dos fenótipos comportamentais observadas em seres humanos e mamíferos. <img src="/files/ftp_upload/2504/2504fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. T-Maze configuração para aversivos Assay Supressão fototaxia. A. A configuração geral experimental para o experimento APSA com a fonte de luz ligado ao &quot;iluminado&quot; tubo falcon, forrada com papel filtro eo tubo &quot;dark&quot; do lado esquerdo (coberta em papel alumínio), separados por um alçapão. B. Durante a fase de treinamento e testes, a mosca é na câmara escura e do alçapão aberto após a luz é acesa na câmara iluminada. <img src="/files/ftp_upload/2504/2504fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Resultados representativos do geotaxis negativos e experimentar APS usando moscas superexpressão GFP ou Tau com um motorista pan-neuronal. A. No ensaio geotaxis negativos, 10 dias de idade do sexo masculino (coluna azul) ou feminino (coluna vermelha) voa superexpressão GFP apresentou maior atividade de escalada de Tau-superexpressão de moscas. B. feminino 20 dias de idade moscas superexpressão GFP mostrou uma melhor aprendizagem (PC0) e memória (PC6) funções de Tau superexpressão de moscas.

<ol>
	<li>Bonini, N. M., Fortini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+neurodegenerative+disease+modeling+using+Drosophila.">Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila.</a> Annual Review of Neuroscience. 26, 627-656 (2003).</li><li>Lloyd, T. E. &. a. m. p. ;. a. m. p., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flightless+flies:+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease.">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).</li><li>Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+mutants+of+Drosophila+isolated+by+countercurrent+distribution.">Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 58, 1112-1119 (1967).</li><li>Le Bourg, E., Buecher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learned+suppression+of+photopositive+tendencies+in+Drosophila+melanogaster.">Learned suppression of photopositive tendencies in Drosophila melanogaster.</a> Animal Learning &#38; Behavior. 30, 330-341 (2002).</li><li>Seugnet, L., Suzuki, Y., Stidd, R., Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aversive+phototaxic+suppression:+evaluation+of+a+short-term+memory+assay+in+Drosophila+melanogaster.">Aversive phototaxic suppression: evaluation of a short-term memory assay in Drosophila melanogaster.</a> Genes Brain Behav. 8, 377-389 (2009).</li><li>Nilsen, S. P., Chan, Y. -. B., Huber, R., Kravitz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender-selective+patterns+of+aggressive+behavior+in+Drosophila+melanogaster.">Gender-selective patterns of aggressive behavior in Drosophila melanogaster.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12342-12347 (2004).</li><li>Leal, S. M., Neckameyer, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+evidence+for+GABAergic+regulation+of+specific+behaviors+in+Drosophila+melanogaster.">Pharmacological evidence for GABAergic regulation of specific behaviors in Drosophila melanogaster.</a> J Neurobiol. 50, 245-261 (2002).</li><li>Wittmann, C. W., Wszolek, M. F., Shulman, J. M., Salvaterra, P. M., Lewis, J., Hutton, M., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tauopathy+in+Drosophila:+Neurodegeneration+Without+Neurofibrillary+Tangles.">Tauopathy in Drosophila: Neurodegeneration Without Neurofibrillary Tangles.</a> Science. 293, 711-714 (2001).</li><li>Mershin, A., Pavlopoulos, E., Fitch, O., Braden, B. C., Nanopoulos, D. V., Skoulakis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+and+memory+deficits+upon+TAU+accumulation+in+Drosophila+mushroom+body+neurons.">Learning and memory deficits upon TAU accumulation in Drosophila mushroom body neurons.</a> Learn Mem. 11, 277-287 (2004).</li><li>Ganetzky, B., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+Suppression+Involving+Behavioral+Mutants+with+Altered+Nerve+Excitability+in+DROSOPHILA+MELANOGASTER.">Indirect Suppression Involving Behavioral Mutants with Altered Nerve Excitability in DROSOPHILA MELANOGASTER.</a> Genetics. 100, 597-614 (1982).</li><li>Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholinesterase+mutants+in+Drosophila+and+their+effects+on+the+structure+and+function+of+the+central+nervous+system.">Acetylcholinesterase mutants in Drosophila and their effects on the structure and function of the central nervous system.</a> J Comp Neurol. 189, 741-774 (1980).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Ambos geotaxis negativos e ensaios APS são robustos testes comportamentais para medir as mudanças na locomotor ou de aprendizagem e capacidades de memória decorrentes da manipulação genética ou ambiental. No entanto, existem algumas desvantagens para esses testes, que esperam uma maior otimização. No ensaio geotaxis negativo, mutações em determinados genes podem tornar disfunções motoras graves em moscas. Nesses casos, as moscas dificilmente pode escalar as paredes em resposta à gravidade sobre a agitação. Ensaios outro comportamento que medir diretamente o movimento pode ser mais apropriado. Estes ensaios incluem corrigir o comportamento reflexo de que as medidas de paralisia e convulsões 10, 11 e comportamento optomotor que registra perda de coordenação dos movimentos. No ensaio de APS, o primeiro obstáculo pode ser moscas aleatoriamente parar na entrada da câmara iluminada, sem avançar. Isso se torna mais um problema se o envelhecimento é uma das condições estudadas, uma vez que voa mais velhos são menos ativas em geral e tendem a parar e descansar por longos períodos de tempo. Neste caso, o pesquisador tem de fornecer estímulos mecânicos para promover o movimento, o que nem sempre é eficaz. Segundo, pode-se argumentar que a falta de ir para os resultados câmara iluminada de uma perda de fototaxia positivo. Raramente é esse o caso, já que trabalhos anteriores mostraram que as moscas voltar para a luz uma vez que a resposta negativa é removida reforçar 4. Terceiro, a duração do contato com o estímulo aversivo pode variar de julgamento para julgamento. Esta variação pode geralmente ser reduzido circundando a parede interna da câmara com papel filtro embebido para evitar moscas de evitar o quinino. Além disso, o pesquisador pode assegurar que cada mosca passar tempo suficiente em contato com o papel de filtro, aumentando a quantidade de tempo gasto na câmara do contrário um minuto. Em resumo, geotaxis negativos e ensaios APS são maneiras simples e rápida de avaliar os déficits comportamentais e quantitativamente indicam locomotor e aprendizagem e habilidades de memória em Drosophila. Estes ensaios são particularmente úteis na modelagem de doenças neurodegenerativas em humanos Drosophila.

<table border="1"><tbody><tr><th> Materiais </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentário </th></tr><tr><td> Frasco de poliestireno </td><td> Vial Capitol, Inc. </td><td> 28Fly </td><td> 28,5 x 95 Vial Poliestireno mm; qualidade do material importante, mal se demasiado escorregadio para moscas a subir. </td></tr><tr><td> Dissecando Stereoscope </td><td> Zeiss </td><td> 000000-1432-979 </td><td> 2 ramos de guia de luz pescoço de ganso (12V/30W) </td></tr><tr><td> Cloridrato de quinino </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 6119-47-7 </td><td> Dissolver em água destilada. </td></tr><tr><td> Quick Disconnect Conectores </td><td> Nalgene (VWR) </td><td> 62868-021 </td><td> Polietileno de alta densidade </td></tr><tr><td> T-Maze </td><td> Sistemas simples Behavioral </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Single-channel pipeta 200 mL </td><td> Eppendorf </td><td> 022443305 </td><td></td></tr></tbody></table>

assaying locomotor, learning, and memory deficits in drosophila models of neurodegeneration

Avanços nos métodos de genética têm permitido o estudo dos genes envolvidos em doenças neurodegenerativas humanas utilizando Drosophila como um sistema modelo 1. A maioria dessas doenças, incluindo Alzheimer, Parkinson e doença de Huntington são caracterizados por idade-dependente deterioração na aprendizagem e memória funções e coordenação do movimento 2. Aqui usamos os testes comportamentais, incluindo o ensaio geotaxis negativo 3 e do ensaio de supressão phototaxic aversivo (APS ensaio) 4,5, para mostrar que algumas das características de comportamento associado a neurodegeneração humano pode ser recapitulada em moscas. No ensaio geotaxis negativo, a tendência natural de moscas para mover contra a gravidade, quando agitada é utilizado para estudar genes ou condições que possam prejudicar a capacidade locomotora. No ensaio de APS, as funções de aprendizagem e memória são testadas em positivamente fototáxico-moscas treinados para associar luz com sabor amargo aversivo e, portanto, evitar essa tendência de outra forma natural de mover em direção a luz. Testar estes treinados voa 6 horas pós-treino é utilizado para avaliar as funções de memória. Com estes ensaios, a contribuição de qualquer fatores genéticos ou ambientais para a neurodegeneração em desenvolvimento podem ser facilmente estudada em moscas.

Watch this Scientific Journal Video about Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration at JoVE.com

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Ensaios de comportamento para as funções de medição de locomoção, aprendizado e habilidades de memória em<em&gt; Drosophila</em&gt;.

Locomotor ensaio, Aprendizagem e Memória Os déficits no Drosophila Modelos de neurodegeneração

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

assaying-locomotor-learning-memory-deficits-drosophila-models

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

33.2K visualizações.  University of Miami, Miller School of Medicine. Ensaios de comportamento para as funções de medição de locomoção, aprendizado e habilidades de memória em Drosophila.

Vídeo: Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) pacemakers or clocks. Malfunctions in the human circadian system are associated with numerous diseases or disorders. Much progress towards our understanding of the mechanisms underlying circadian rhythms has emerged from genetic screens whereby an easily measured behavioral rhythm is used as a read-out of clock function. Studies using Drosophila have made seminal contributions to our understanding of the cellular and biochemical bases underlying circadian rhythms. The standard circadian behavioral read-out measured in Drosophila is locomotor activity. In general, the monitoring system involves specially designed devices that can measure the locomotor movement of Drosophila. These devices are housed in environmentally controlled incubators located in a darkroom and are based on using the interruption of a beam of infrared light to record the locomotor activity of individual flies contained inside small tubes. When measured over many days, Drosophila exhibit daily cycles of activity and inactivity, a behavioral rhythm that is governed by the animal's endogenous circadian system. The overall procedure has been simplified with the advent of commercially available locomotor activity monitoring devices and the development of software programs for data analysis. We use the system from Trikinetics Inc., which is the procedure described here and is currently the most popular system used worldwide. More recently, the same monitoring devices have been used to study sleep behavior in Drosophila. Because the daily wake-sleep cycles of many flies can be measured simultaneously and only 1 to 2 weeks worth of continuous locomotor activity data is usually sufficient, this system is ideal for large-scale screens to identify Drosophila manifesting altered circadian or sleep properties.

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

We describe procedures for recording daily locomotor activity rhythms of Drosophila and subsequent data analysis. Locomotor activity rhythms are a reliable behavioral output of animal circadian clocks and are used as the standard readout of clock function when studying circadian mutants or examining how the environment regulates the circadian system.

Assaying atividade locomotora para estudar ritmos circadianos e sono Parâmetros em Drosophila</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

Neurociência

Morris Water Maze Test for Learning and Memory Deficits in Alzheimer&#39;s Disease Model Mice

The Morris Water Maze (MWM) was first established by neuroscientist Richard G. Morris in 1981 in order to test hippocampal-dependent learning, including acquisition of spatial memoryand long-term spatial memory 1. The MWM is a relatively simple procedure typically consisting of six day trials, the main advantage being the differentiation between the spatial (hidden-platform) and non-spatial (visible platform) conditions 2-4. In addition, the MWM testing environment reduces odor trail interference 5. This has led the task to be used extensively in the study of the neurobiology and neuropharmacology of spatial learning and memory. The MWM plays an important role in the validation of rodent models for neurocognitive disorders such as Alzheimer&#x2019;s Disease 6, 7. In this protocol we discussed the typical procedure of MWM for testing learning and memory and data analysis commonly used in Alzheimer&#x2019;s disease transgenic model mice.

Morris Water Maze Test for Learning and Memory Deficits in Alzheimer&#039;s Disease Model Mice

The Morris Water Maze is a behavioral task to test hippocampal-dependent learning and memory. It has been widely used in the study of neurobiology, neuropharmacology and neurocognitive disorders in rodent models.

Morris Teste Maze Água para déficits de aprendizagem e memória em camundongos Alzheimer Disease Modelo

The Morris Water Maze (MWM) was first established by neuroscientist Richard G. Morris in 1981 in order to test hippocampal-dependent learning, including ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also propagation of suprathreshold spiking activity involves populations of neurons. Empirical studies addressing cortical function directly thus require recordings from populations of neurons with high resolution. Here we describe an optical method and a deconvolution algorithm to record neural activity from up to 100 neurons with single-cell and single-spike resolution. This method relies on detection of the transient increases in intracellular somatic calcium concentration associated with suprathreshold electrical spikes (action potentials) in cortical neurons. High temporal resolution of the optical recordings is achieved by a fast random-access scanning technique using acousto-optical deflectors (AODs)1. Two-photon excitation of the calcium-sensitive dye results in high spatial resolution in opaque brain tissue2. Reconstruction of spikes from the fluorescence calcium recordings is achieved by a maximum-likelihood method. Simultaneous electrophysiological and optical recordings indicate that our method reliably detects spikes (&gt;97% spike detection efficiency), has a low rate of false positive spike detection (&lt; 0.003 spikes/sec), and a high temporal precision (about 3 msec) 3. This optical method of spike detection can be used to record neural activity in vitro and in anesthetized animals in vivo3,4.

Understanding the function of the vertebrate central nervous system requires recordings from many neurons because cortical function arises on the level of populations of neurons. Here we describe an optical method to record suprathreshold neural activity with single-cell and single-spike resolution, dithered random-access scanning. This method records somatic fluorescence calcium signals from up to 100 neurons with high temporal resolution. A maximum-likelihood algorithm deconvolves the underlying suprathreshold neural activity from the somatic fluorescence calcium signals. This method reliably detects spikes with high detection efficiency and a low rate of false positives and can be used to study neural populations in vitro and in vivo.

A gravação ótica da atividade neural supraliminares com resolução de uma única célula e um único pico

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Aprendizagem associativa apetitiva olfativa em<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the elucidation of the molecular mechanisms involved in cognitive diseases1-7. Learning and memory can be assayed in larvae to study the effect of neurodevelopmental genes8-10 and in flies to measure the contribution of adult plasticity genes1-7. Furthermore, the short lifespan of Drosophila facilitates the analysis of genes mediating age-related memory impairment5,11-13. The availability of many inducible promoters that subdivide the Drosophila nervous system makes it possible to determine when and where a gene of interest is required for normal memory as well as relay of different aspects of the reinforcement signal3,4,14,16.
Studying memory in adult Drosophila allows for a detailed analysis of the behavior and circuitry involved and a measurement of long-term memory15-17. The length of the adult stage accommodates longer-term genetic, behavioral, dietary and pharmacological manipulations of memory, in addition to determining the effect of aging and neurodegenerative disease on memory3-6,11-13,15-21.
Classical conditioning is induced by the simultaneous presentation of a neutral odor cue (conditioned stimulus, CS+) and a reinforcement stimulus, e.g., an electric shock or sucrose, (unconditioned stimulus, US), that become associated with one another by the animal1,16. A second conditioned stimulus (CS-) is subsequently presented without the US. During the testing phase, Drosophila are simultaneously presented with CS+ and CS- odors. After the Drosophila are provided time to choose between the odors, the distribution of the animals is recorded. This procedure allows associative aversive or appetitive conditioning to be reliably measured without a bias introduced by the innate preference for either of the conditioned stimuli. Various control experiments are also performed to test whether all genotypes respond normally to odor and reinforcement alone.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

The method to measure adult Drosophila associative memory is described. The assay is based on the ability of the fly to associate an odor presented with a negative reinforcer (electric shock) and then recall this information at a later time, allowing memory to be measured.

Drosophila Adulto Olfativo Choque Aprendizagem

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Determinação da atividade locomotora espontânea em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health worldwide. Although mammalian models have provided important insights into the underlying mechanisms of pathogenicity, the complexity of mammalian systems together with their high costs are limiting their use. Therefore, the simple but well-established Drosophila model-system&#160;provides an alternative for investigating the molecular pathways that are affected in these diseases. Besides behavioral deficits, neurodegenerative diseases are characterized by histological phenotypes such as neuronal death and axonopathy. To quantify neuronal degeneration and to determine how it is affected by genetic and environmental factors, we use a histological approach that is based on measuring the vacuoles in adult fly brains. To minimize the effects of systematic error and to directly compare sections from control and experimental flies in one preparation, we use the &#39;collar&#39; method for paraffin sections. Neurodegeneration is then assessed by measuring the size and/or number of vacuoles that have developed in the fly brain. This can either be done by focusing on a specific region of interest or by analyzing the entire brain by obtaining serial sections that span the complete head. Therefore, this method allows one to measure not only severe degeneration but also relatively mild phenotypes that are only detectable in a few sections, as occurs during normal aging.

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Drosophila is widely used as a model system to study neurodegeneration. This protocol describes a method by which degeneration, as determined by vacuole formation in the brain, can be quantified. It also minimizes effects due to the experimental procedure by processing and sectioning control and experimental flies as one sample.

Mass Histologia para quantificar neurodegeneração em<em&gt; Drosophila</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

Assessing Spatial Learning and Memory in Small Squamate Reptiles

Clinical research has leveraged a variety of paradigms to assess cognitive decline, commonly targeting spatial learning and memory abilities. However, interest in the cognitive processes of nonmodel species, typically within an ecological context, has also become an emerging field of study. In particular, interest in the cognitive processes in reptiles is growing although experimental studies on reptilian cognition are sparse. The few reptilian studies that have experimentally tested for spatial learning and memory have used rodent paradigms modified for use in reptiles. However, ecologically important aspects of the physiology and behavior of this taxonomic group must be taken into account when testing for spatially based cognition. Here, we describe modifications of the dry land Barnes maze and associated testing protocol that can improve performance when probing for spatial learning and memory ability in small squamate reptiles. The described paradigm and procedures were successfully used with male side-blotched lizards (Uta stansburiana), demonstrating that spatial learning and memory can be assessed in this taxonomic group with an ecologically relevant apparatus and protocol.

This paper describes a modification of the Barnes maze, a standard rodent paradigm used to assess spatial memory and learning, for use in small squamate reptiles.

Avaliando a aprendizagem espacial e memória em pequenas Squamata Répteis

Clinical research has leveraged a variety of paradigms to assess cognitive decline, commonly targeting spatial learning and memory abilities. However, ...

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model organisms such as the fruit fly, Drosophila melanogaster. Drosophila is useful for understanding the basic neurobiology underlying cognitive deficits resulting from mutations in genes associated with human cognitive disorders, such as intellectual disability (ID) and autism. This work describes a methodology for testing learning and memory using a classic paradigm in Drosophila known as courtship conditioning. Male flies court females using a distinct pattern of easily recognizable behaviors. Premated females are not receptive to mating and will reject the male&#39;s copulation attempts. In response to this rejection, male flies reduce their courtship behavior. This learned reduction in courtship behavior is measured over time, serving as an indicator of learning and memory. The basic numerical output of this assay is the courtship index (CI), which is defined as the percentage of time that a male spends courting during a 10 min interval. The learning index (LI) is the relative reduction of CI in flies that have been exposed to a premated female compared to na&#239;ve flies with no previous social encounters. For the statistical comparison of LIs between genotypes, a randomization test with bootstrapping is used. To illustrate how the assay can be used to address the role of a gene relating to learning and memory, the pan-neuronal knockdown of Dihydroxyacetone phosphate acyltransferase (Dhap-at) was characterized here. The human ortholog of Dhap-at, glyceronephosphate O-acyltransferase (GNPT), is involved in rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2, an autosomal-recessive syndrome characterized by severe ID. Using the courtship conditioning assay, it was determined that Dhap-at is required for long-term memory, but not for short-term memory. This result serves as a basis for further investigation of the underlying molecular mechanisms.

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

This protocol describes a Drosophila learning and memory assay called courtship conditioning. This classic assay is based on a reduction of male courtship behavior after sexual rejection by a non-receptive premated female. This natural form of behavioral plasticity can be used to test learning, short-term memory, and long-term memory.

Drosophila Courtship Acondicionamento Como Medida de Aprendizagem e Memória

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model ...