Reconhecemos centros banco de Bloomington para a tensão mosca. Este trabalho foi financiado pela bolsa de pesquisa da BBSRC (BB / G008973 / 1).

1. Fly Preparação <ol><li> Outcross todos os mutantes, Gal4 / UEA e outras linhas com uma cepa do tipo selvagem, como CSw-, por pelo menos seis gerações antes dos experimentos comportamentais para controlar para o fundo genético 26. </li><li> Cresça sobre moscas uma farinha de milho, levedura e melaço dieta padrão sob um ciclo de luz-escuro de 12:12 hr a 25 ° C, a menos manipulações específicas requerem uma temperatura diferente. <ol><li> Para determinar os efeitos da expressão do transgene: Utilização de 18 ° C para evitar a expressão de transgenes em Gal4 Gal80 ts (sistema alvo) por meio do desenvolvimento e, em seguida, mover as moscas a uma incubadora a 30 ° C de 1-2 dias antes da experiência comportamental. Realizar o ensaio a 30 ° C para determinar o efeito da expressão do transgene 3,4,6,7,14. </li><li> Para as experiências que utilizam canais de TRPA1 activado por calor para estimular os neurónios: Levante as moscas a 23 ° C, que é uma temperatura conhecidapara manter um canal inactivo, e então mudar para uma sala de comportamento, a 30 ° C para activar o TRPA1 expressando neurónios. </li><li> Para experimentos com temperatura Shibire sensível para bloquear a saída sináptica 11, 14,24: Rear as moscas a 18 ° C e realizar testes a 30 ° C. </li></ol></li><li> Recolha as moscas 1-2 dias antes do experimento e contá-los em grupos de cerca de 25 sob a luz de CO 2 anestesia. Armazenar as moscas, pelo menos, S / N, em frascos de comida (sem levedura) a 25 ° C (a menos que as manipulações específicas necessária uma temperatura diferente) e uma humidade de 70% em relação a um ambiente controlado, com luz 0:12 horas: condições de escuridão até à hora da experiência. Nota: Este armazenamento permite que as moscas para se acostumar com o teste de aprendizagem subseqüente realizada na sala de ambiente controlado, que tinha as condições ideais para Drosophila aprendizagem e, sobretudo, remove qualquer envi diáriavariações am- que podem ter afetado o fenótipo comportamental. </li></ol> 2 Preparação antes do experimento <ol><li> Execute as experiências em um perspex T-labirinto feito por encomenda (Figura 1). </li><li> Verifique regularmente o tubo de montagem para garantir que uma vedação hermética é obtido durante o experimento. Se necessário, altere os anéis de vedação que vedam os compartimentos dentro do T-maze. </li><li> Coloque grades de cobre feitos por dentro dos tubos de treinamento. Verifique e limpe regularmente essas grades, e substitua se oxidado. Prenda as grades de cobre para cabos via clipes de crocodilo que correm para uma caixa de interruptor conectado a um estimulador elétrico. Usar um voltímetro para assegurar que o aparelho está a fornecer o choque necessária. </li><li> Utilize G-braçadeiras para segurar o labirinto firmemente para evitar qualquer fuga de ar. </li><li> Anexar labirinto em T para tubagens que corre a uma bomba de ar, para permitir que os odores para ser traçada entre as moscas e subsequentemente removido do labirinto-T. Manter ar suavefluir em ~ 2 L / min </li></ol> 3. Odor diluições <ol><li> Usar dois odores diferentes em concentrações tais que as moscas apresentam uma preferência igual para ambos os odores. Use 4-metilciclo-hexanol (1:67) e 3-octanol (1: 100) diluída em óleo mineral 7,13. Nota: Determine cuidadosamente estas concentrações, que variam de laboratório. Por exemplo, outros usam 1:10 para ambos os odores 24. Outros odores comumente utilizados incluem acetato de etilo e acetato de iso-amilo. </li><li> Pipetar 30 ul de odor diluído em um copo de odores feito por encomenda colocada num bloco de odor coberto por um tubo de plástico com uma parte superior perfurada que permite que o ar seja arrastado através do odor no copo, expondo assim as moscas a uma pluma de odor. </li></ol> 4. protocolo de treinamento (Figuras 1 e 2) <ol><li> Para o adulto choque condicionado olfativo, realizar todos os experimentos sob uma fraca luz vermelha (ou seja., LED vermelho), o que permite ao pesquisador a ver, mas impede que o fly de vista, permitindo assim que as moscas se concentrar no olfacto, por oposição às entradas visuais. </li><li> Apresente as moscas dentro do tubo de formação e, em seguida, anexar ao T-maze e permitir-lhes adaptar-se ao tubo e fluxo de ar por 90 segundos. </li><li> Apresentar o primeiro odor (4-metilciclohexanol, MCH) com um choque de 60-V (que consiste de doze pulsos 1,25 segundos com intervalos inter-pulso 3,75 seg) para uma duração total de 60 segundos. </li><li> Siga o choque com um período de descanso de 30 segundos sem odor ou choque. </li><li> Apresentar o segundo odor (3-octanol, OCT) para 60 segundos sem um choque. </li><li> Siga o choque com um período de descanso de 30 segundos sem odor ou choque. </li><li> Mover as moscas da câmara de formação no interior da câmara central do labirinto em T, rodando o labirinto em T de lado e batendo suavemente a parte inferior do labirinto em T com uma superfície macia, tal como um tapete de rato velho. Manter as moscas na câmara central para 90 seg. </li><li> Coloque os tubos de escolha para o bottom do aparelho para formar o labirinto-T. </li><li> Para medir a aprendizagem, mover as moscas para o ponto de escolha do labirinto em T, onde foram expostas simultaneamente a ambos os odores e avançar para um. Realizar um período de teste, durante 120 segundos. </li><li> Armadilha as moscas nos tubos de escolha, deslizando a câmara central-se, assim, bloquear as extremidades dos tubos de escolha. Recolher as moscas em cada braço do labirinto em T e no compartimento central em frascos de contagem e de alimentos. </li><li> Para medir a memória, coletar as moscas após o treinamento (4.6) e transferi-los a partir do T-maze para frascos de alimentos sem fermento. Loja opera no escuro a 25 ° C e 70% de humidade durante o restante tempo necessário para determinar a fase de memória de interesse (ver introdução). Reintroduzir as moscas para o labirinto em T como na etapa 4.7. </li><li> Para a memória de longo prazo, use um labirinto construído sob encomenda que permite que vários lotes de moscas para ser treinado em simultâneo. Administrar 5 ciclos de formação, com 15 min de intervalo inter-ciclo (spaced) ou sem um intervalo inter-ciclo (amontoados). Manter as moscas a 18 ° C e umidade de 70% no escuro até que o teste. Antes do teste, mover as moscas a 25 ° C, permitindo-lhes a aclimatar durante pelo menos 1 hr. Avaliar a memória de longo prazo de 24 horas após o treino. </li><li> Após os experimentos comportamentais, limpar os copos de odor com água quente e detergente sem cheiro. Após a secagem, revestimento das cápsulas com 10 mL Sigmacote. Seca-se a Sigmacote por aquecimento em um forno de microondas. Ocasionalmente, limpe a tubos de plexiglas e blocos de odor T-labirinto com água quente e detergente sem cheiro. </li></ol> 5 Cálculo do Índice de Desempenho: a Medida da Memória das Moscas <ol><li> Calcule o Índice de Desempenho (PI) para cada condição de que o número de moscas, evitando o odor emparelhado-choque (CS -) menos o número de moscas que escolhem o odor emparelhado-choque (CS +) dividido pelo número total de moscas (CS - + CS +) 1. PeÍndice rformance (PI) = (# CS - voa - # CS + voa) / (# Total de moscas) </li><li> Calcule o PI final do experimento, a média do PI do experimento em que MCH foi o odor emparelhado-choque e um em que outubro foi o odor emparelhado-choque. Isso elimina qualquer tendência das moscas que têm uma preferência maior por um odor. </li></ol> 6. Controles sensório-motor <ol><li> Realizar odor acuidade através da introdução de ~ 40-50 moscas em labirinto em T 6,7,17. </li><li> Depois de 90 segundos, mova as moscas para o ponto de escolha, e permitir-lhes dois minutos para escolher entre odores puros e ar. </li><li> Coletar e contar as moscas. Calcule a porcentagem evitar dividindo o número total de moscas que escolheram o odor por aqueles que participaram do teste. </li><li> Para choque reatividade 6,7,17, introduzir as moscas na câmara de choque. </li><li> Depois de 90 segundos de repouso, administra um choque eléctrico de 60 V DC, a partir do qual as moscas podem escapar para um semelhantetubo sem um choque. </li><li> Permitir 2 min para as moscas para escolher; recolher e contar as moscas. Calcula-se a percentagem de evasão de choque através da divisão do número de moscas que evitaram o choque por escapar do tubo de choque através do número total de moscas no experimento. Incluir as moscas que permanecem na câmara central no total de pessoas que escaparam do choque elétrico. </li></ol>

<ol>
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Os autores não têm nada a revelar.

O ensaio de aprendizagem olfactiva choque Drosophila adulta aqui apresentada permite a análise dos mecanismos moleculares subjacentes diferentes fases de memória, incluindo a memória de longo prazo 15-17. Bem como a determinação do efeito do ritmo circadiano do sono, 18, ​​19, 20,21 dieta senescência 11-13, doença neurodegenerativa 5 e tratamentos com medicamentos 5,6,19 na memória. Muitas abordagens poderosas foram recentemente desenvolvidos para a imagem funcional dos circuitos neurais que mediam a memória olfativa em moscas 3,4,7,11,16,27. Estas técnicas optogenetic utilizar o vasto repertório de diferentes promotores de Drosophila disponíveis em 14,16. Estes promotores são usados ​​para expressar cálcio e Camp repórteres geneticamente codificados nos neurônios da memória 16,27 para estudar o efeito de mutações genéticas específicas em traços de memória. The utilização de promotores e mutações em adultos condicionais permite o estudo do papel ao nível pós-desenvolvimento de um produto do gene na memória 3,4,6,7,13,14. Imagem e abordagens comportamentais podem ser combinados com os canais leves e activado por calor para estimular ou inibir a diferentes neurónios, no circuito de memória 11,14,16,22-24 para elucidar ainda mais a sua função. Além disso, os neurônios da memória do corpo cogumelo são acessíveis a célula inteira gravações patch clamp 28 e técnicas matemáticas e computacionais estão sendo usados ​​para modelar Drosophila memória olfativa 29. Esses avanços experimentais, combinadas com as diferentes formas de protocolos de memória associativa introduzidas aqui, permitir Drosophila a ser usado para modelar os molecular-e no nível do circuito alterações na memória associativa que ocorrem em resposta à recompensa, punição, a motivação, o vício, o envelhecimento ea doença 5,6,11-13,16,30-31.

O método aqui apresentado é o descrito por Tully e Quinn com algumas pequenas modificações 1. A experiência é realizada em duas fases: as moscas são formados na primeira fase, e que as moscas são treinados testados na segunda fase. Durante o treinamento, um grupo de moscas são simultaneamente expostos a um odor (CS +) e um choque elétrico (US) em um tubo de treinamento. As moscas, então, receber odor 2 (CS -) sem um choque elétrico. Este único emparelhamento de um odor especial com o choque é chamado de treinamento de 1 ciclo, e os odores que são mais frequentemente utilizados são de 4 metilciclohexanol (MCH) e 3-octanol (OCT). A formação de um ciclo, conduz à formação de uma fase lábil de memória que pode ser detectado por até 7 horas; no entanto, a memória é normalmente testado imediatamente para determinar o que é chamado de aprendizagem, aquisição ou 2 min de memória. Memória medida a 30 min ou 1 hora é conhecido como a memória de curto prazo, enquanto3 hr memória é referido como a memória intermédia. A exposição de moscas para ciclos de treinamento repetitivos com intervalos entre os ciclos de formação (formação espaçada) leva a uma forma consolidada de memória de longo prazo, que é dependente de transcrição CREB e dura até uma semana. Formação sem lacunas (treino concentrado) conduz à formação de memória anestesia-resistente (MRA), que semelhante ao da memória de longa duração, é tipicamente medida 24 horas após 5 ciclos de formação 7,13,15-17,20,21. Com esta abordagem, o efeito de várias mutações do gene sobre estas diferentes fases de memória pode ser determinada. A expressão-driven promotor de transgenes-luz ou sensíveis à temperatura para ativar ou bloquear a atividade neural de neurônios específicos permite investigar quais neurônios são necessários para a aquisição de memória, consolidação e recuperação 3,4,11,15,16,20, 22-24. Memória em 1 hora é normalmente medido quando se estuda perda de memória relacionada com a idade, porque este fORM de memória parece ser particularmente vulneráveis ​​aos efeitos do envelhecimento 11-13. A gama completa dos controlos comportamentais e genéticos são realizados com experiências de memória, por exemplo, para determinar se um defeito do desempenho é devido a um defeito de memória central ou de um defeito sensorial periférica que impede a mosca de detecção do choque ou sugestão olfactiva 5 -7, 1 7, 25,26.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:28px;">Materials</td>
			<td style="width:139px;height:28px;">Source</td>
			<td style="width:116px;height:28px;">Cat. No.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">3-Octanol</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">218405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">4-Methyl cyclohexanol</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">15,309-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">Benzaldehyde</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">418099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">Mineral Oil</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Fluka</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">BP2629-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">Hexyl acetate</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">108154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:20px;">Fructose</td>
			<td style="width:139px;height:20px;">Sigma</td>
			<td style="width:116px;height:20px;">F0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:189px;height:22px;">Agarose</td>
			<td style="width:139px;height:22px;">Bioline</td>
			<td style="width:116px;height:22px;">BIO-41025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drosophila adult olfactory shock learning

Drosophila têm sido utilizados em experiências de condicionamento clássicos para mais de 40 anos, assim, facilitando grandemente a nossa compreensão da memória, incluindo a elucidação dos mecanismos moleculares envolvidos em doenças cognitivas 1-7. Aprendizagem e memória pode ser testada em larvas de estudar o efeito de genes do desenvolvimento neurológico 8-10 e nas moscas para medir a contribuição de genes plasticidade adultos 1-7. Além disso, o curto tempo de vida da Drosophila facilita a análise de genes medeiam relacionada com a idade perda de memória 5,11-13. A disponibilidade de vários promotores indutiveis que subdividem o sistema nervoso Drosophila torna possível determinar quando e onde um gene de interesse é necessária para a memória normal, bem como relé de diferentes aspectos do sinal de reforço 3,4,14,16. Memória Estudar no adulto Drosophila permite uma análise detalhada docomportamento e circuitos envolvidos e uma medida da memória de longa duração 15 -17. A duração da fase adulta acomoda manipulações genéticas, comportamentais, alimentares e farmacológicos de longo prazo de memória, para além de determinar o efeito do envelhecimento e das doenças neurodegenerativas em memória 3-6,11-13,15-21. O condicionamento clássico é induzida pela apresentação simultânea de um sinal de odor neutro (estímulo condicionado, CS +) e um estímulo de reforço, por exemplo., Um choque eléctrico ou de sacarose, (estímulo não condicionado, EUA), que passam a ser associados um com o outro pelo animal 1,16. Um estímulo segunda condicionado (CS -) é posteriormente apresentado sem os EUA. Durante a fase de testes, Drosophila são simultaneamente apresentados com CS + e odores CS. Após o tempo de Drosophila são fornecidos para escolher entre os odores, a distribuição dos animais é gravado. Esta al procedimentobaixos associativas condicionamento aversivo ou apetitivo a ser mensurado de forma confiável sem um viés introduzido pela preferência inata por um dos estímulos condicionados. Várias experiências de controlo são também realizadas para testar se todos os genótipos de responder normalmente a odor e de reforço sozinha.

O índice de desempenho (PI) serve como uma medida da memória. A Tabela 1 ilustra um cálculo representativo de PI. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> MCH associado a um choque </td><td> 3-OCT associado a um choque </td></tr><tr><td> Moscas evitando MCH (em tubo de outubro) = 80 Moscas preferindo MCH (em tubo MCH) = 20 PI 1 - (80-20) / 80 + 20) = 0,6 </td><td> Moscas evitando outubro (em tubo MCH) = 75 Moscas preferindo outubro (em tubo de outubro) = 25 PI 2 = (75-25) / (75 + 25) = 0,5 </td></tr><tr><td> PI do experimento = (0,6 + 0,5) /2=0.55 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1 Um representante de cálculo do índice de desempenho utilizando os dados ilustrativos. Índices de desempenho para experiências diferentes podem ser comparados para elucidar os efeitos de memória. Uma vez que talde comparação é mostrado na Figura 3, que contém os resultados de uma série de experiências realizadas com Canton S moscas de tipo selvagem (WT) adulto e adulto burro aprendizagem mutante voa 1. A média de 10 IPs é fornecido, com barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). Estes resultados demonstram que as moscas burro mostram uma redução na aprendizagem em comparação com o tipo selvagem. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50107/50107fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50107/50107fig1.jpg" /> Figura 1 O adulto experimental set-up. As moscas são treinados e testados em um labirinto T. A formação envolve a apresentação de um odor com um choque eléctrico, seguido por um segundo, sem odor B choque eléctrico. Após um período de repouso na câmara intermediária que as moscas são apresentados com ambos os odores simultaneamente. As moscas são presosnos dois tubos e recolhido e contado para obter pontuação de aprendizagem / memória. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50107/50107fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50107/50107fig2.jpg" /> Figura 2 O protocolo de formação de adultos. As moscas estão treinando em dois passos. A primeira etapa onde as moscas receber um odor (CS +) emparelhado com choque elétrico (US) por 60 seg. Na próxima etapa, as moscas recebem uma segunda odor (CS), sem choques eléctricos. As moscas são, em seguida, deixado em repouso durante 90 segundos, após os quais foram testados para a sua escolha entre CS + e CS. <img alt="Figura 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50107/50107fig3highres.jpg" width="400" /> Figura 3 Um gráfico representativo mostrando burro e aprendizagem wildtype em adultos Drosophila. </strong&gt; WT e moscas burro foram testados após uma sessão de treinamento. Burro moscas mostram uma redução na aprendizagem em comparação com o WT (n = 10).

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Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

O método para medir adulto Drosophila memória associativa é descrito. O ensaio é baseado na capacidade de tempo real para associar um odor apresentado com um reforçador negativa (choque eléctrico) e depois recupera esta informação numa altura posterior, permitindo que a memória a ser medido.

Drosophila Adulto Olfativo Choque Aprendizagem

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

drosophila-adult-olfactory-shock-learning

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

27.8K visualizações.  University of Bristol.  O método para medir adulto Drosophila memória associativa é descrito. O ensaio é baseado na capacidade de tempo real para associar um odor apresentado com um reforçador negativa (choque eléctrico) e depois recupera esta informação numa altura posterior, permitindo que a memória a ser medido. 

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Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of these diseases, including Alzheimer's, Parkinson's and Huntington's disease are characterized by age-dependent deterioration in learning and memory functions and movement coordination2. Here we use behavioral assays, including the negative geotaxis assay3 and the aversive phototaxic suppression assay (APS assay)4,5, to show that some of the behavior characteristics associated with human neurodegeneration can be recapitulated in flies. In the negative geotaxis assay, the natural tendency of flies to move against gravity when agitated is utilized to study genes or conditions that may hinder locomotor capacities. In the APS assay, the learning and memory functions are tested in positively-phototactic flies trained to associate light with aversive bitter taste and hence avoid this otherwise natural tendency to move toward light. Testing these trained flies 6 hours post-training is used to assess memory functions. Using these assays, the contribution of any genetic or environmental factors toward developing neurodegeneration can be easily studied in flies.

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Behavior assays for measuring locomotor functions, learning, and memory abilities in Drosophila.

Locomotor ensaio, Aprendizagem e Memória Os déficits no Drosophila Modelos de neurodegeneração

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Neurociência

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Transdução Viral seletiva de Adultos-nascido neurônios olfativos de crônica In vivo Estímulo Optogenetic

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Aprendizagem associativa apetitiva olfativa em<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

Dissecção e imunohistoquímica de larvas, pupa e adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Monte todo imunomarcação de Neurônios Receptores Olfatórios no<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores e Interneurônios à luz Estímulos<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

Comportamentos olfativos ensaiadas pelo monitoramento do computador de<em&gt; Drosophila</em&gt; Em um olfatômetro de quatro quadrantes

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival. The most obvious application of these chemosenses is to be able to distinguish good food sources from potentially dangerous food sources. Gustation requires physical contact with a chemical compound which is able to signal through taste receptors that are expressed on the surface of neurons. In insects, these gustatory neurons can be located across the animal's body allowing taste to play an important role in many different behaviors. Insects typically prefer compounds containing sugars, while compounds that are considered bitter tasting are avoided. Given the basic biological importance of taste, there is intense interest in understanding the molecular mechanisms underlying this sensory modality. We describe an adult Drosophila taste assay which reflects the preference of the animals for a given tastant compound. This assay may be applied to animals of any genetic background to examine the taste preference for a desired soluble compound.

Taste Preference Assay for Adult Drosophila

Taste is an important sensory process which facilitates attraction to beneficial substances and avoidance of toxic substances. This protocol describes a simple ingestion assay for determining Drosophila gustatory preference for a given chemical compound.

Ensaio de Preferência gosto para Adulto<em&gt; Drosophila</em

Olfactory and gustatory perception of the environment is vital for animal survival.  The most obvious application of these chemosenses is to be able to ...

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model organisms such as the fruit fly, Drosophila melanogaster. Drosophila is useful for understanding the basic neurobiology underlying cognitive deficits resulting from mutations in genes associated with human cognitive disorders, such as intellectual disability (ID) and autism. This work describes a methodology for testing learning and memory using a classic paradigm in Drosophila known as courtship conditioning. Male flies court females using a distinct pattern of easily recognizable behaviors. Premated females are not receptive to mating and will reject the male&#39;s copulation attempts. In response to this rejection, male flies reduce their courtship behavior. This learned reduction in courtship behavior is measured over time, serving as an indicator of learning and memory. The basic numerical output of this assay is the courtship index (CI), which is defined as the percentage of time that a male spends courting during a 10 min interval. The learning index (LI) is the relative reduction of CI in flies that have been exposed to a premated female compared to na&#239;ve flies with no previous social encounters. For the statistical comparison of LIs between genotypes, a randomization test with bootstrapping is used. To illustrate how the assay can be used to address the role of a gene relating to learning and memory, the pan-neuronal knockdown of Dihydroxyacetone phosphate acyltransferase (Dhap-at) was characterized here. The human ortholog of Dhap-at, glyceronephosphate O-acyltransferase (GNPT), is involved in rhizomelic chondrodysplasia punctata type 2, an autosomal-recessive syndrome characterized by severe ID. Using the courtship conditioning assay, it was determined that Dhap-at is required for long-term memory, but not for short-term memory. This result serves as a basis for further investigation of the underlying molecular mechanisms.

Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory

This protocol describes a Drosophila learning and memory assay called courtship conditioning. This classic assay is based on a reduction of male courtship behavior after sexual rejection by a non-receptive premated female. This natural form of behavioral plasticity can be used to test learning, short-term memory, and long-term memory.

Drosophila Courtship Acondicionamento Como Medida de Aprendizagem e Memória

Many insights into the molecular mechanisms underlying learning and memory have been elucidated through the use of simple behavioral assays in model ...

An Objective and Reproducible Test of Olfactory Learning and Discrimination in Mice

Olfaction is the predominant sensory modality in mice and influences many important behaviors, including foraging, predator detection, mating, and parenting. Importantly, mice can be trained to associate novel odors with specific behavioral responses to provide insight into olfactory circuit function. This protocol details the procedure for training mice on a Go/No-Go operant learning task. In this approach, mice are trained on hundreds of automated trials daily for 2&#8211;4 weeks and can then be tested on novel Go/No-Go odor pairs to assess olfactory discrimination, or be used for studies on how odor learning alters the structure or function of the olfactory circuit. Additionally, the mouse olfactory bulb (OB) features ongoing integration of adult-born neurons. Interestingly, olfactory learning increases both the survival and synaptic connections of these adult-born neurons. Therefore, this protocol can be combined with other biochemical, electrophysiological, and imaging techniques to study learning and activity-dependent factors that mediate neuronal survival and plasticity.

Here, we train mice on an associative learning task to test odor discrimination. This protocol also allows for studies on learning-induced structural changes in the brain.