Este trabalho tem sido apoiado por K08 prêmio CA116429-04 para MC e por uma concessão do Cancer Conquer Now (preocupação) # fundação 8501

<ol>
	<li>Camps, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+ColE1-like+plasmid+replication+for+recombinant+gene+expression.">Modulation of ColE1-like plasmid replication for recombinant gene expression.</a> Recent Pat DNA Gene Seq. 4, 58-73 (2010).</li><li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+replication+of+plasmid+ColE1+DNA+by+RNA+polymerase,+ribonuclease+H,+and+DNA+polymerase+I.">Initiation of replication of plasmid ColE1 DNA by RNA polymerase, ribonuclease H, and DNA polymerase I.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 1, 409-417 (1979).</li><li>Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ColE1+replication+control+circuitry:+sense+from+antisense.">ColE1 replication control circuitry: sense from antisense.</a> Cell. 55, 929-932 (1988).</li><li>Camps, M., Naukkarinen, J., Johnson, B. P., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+evolution+in+Escherichia+coli+using+a+highly+error-prone+DNA+polymerase+I.">Targeted gene evolution in Escherichia coli using a highly error-prone DNA polymerase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 9727-9732 (2003).</li><li>Shinkai, A., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mutagenesis+by+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I.+Ile(709)+in+motif+A+functions+in+base+selection.">In vivo mutagenesis by Escherichia coli DNA polymerase I. Ile(709) in motif A functions in base selection.</a> J Biol Chem. 276, 46759-46764 (2001).</li><li>Uyemura, D., Lehman, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+mutant+forms+of+DNA+polymerase+I+from+Escherichia+coli.+I.+The+polA12+mutation.">Biochemical characterization of mutant forms of DNA polymerase I from Escherichia coli. I. The polA12 mutation.</a> J Biol Chem. 251, 4078-4084 (1976).</li><li>Sedgwick, B., Robins, P., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+removal+of+alkylation+damage+from+DNA+by+AlkB+and+related+DNA+dioxygenases.">Direct removal of alkylation damage from DNA by AlkB and related DNA dioxygenases.</a> Methods Enzymol. 408, 108-120 (2006).</li><li>Aharoni, A., Gaidukov, L., Khersonsky, O., Mc, Q. G. S., Roodveldt, C., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+'evolvability'+of+promiscuous+protein+functions.">The 'evolvability' of promiscuous protein functions.</a> Nat Genet. 37, 73-76 (2005).</li><li>Elena, S. F., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+experiments+with+microorganisms:+the+dynamics+and+genetic+bases+of+adaptation.">Evolution experiments with microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation.</a> Nat Rev Genet. 4, 457-469 (2003).</li><li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoFormation+of+an+RNA+primer+for+initiation+of+replication+of+ColE1+DNA+by+ribonuclease+H.">FoFormation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 2450-2454 (1980).</li><li>Bryan, S. K., Moses, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sufficiency+of+the+Klenow+fragment+for+survival+of+polC(Ts)+pcbA1+Escherichia+coli+at+43+degrees.">Sufficiency of the Klenow fragment for survival of polC(Ts) pcbA1 Escherichia coli at 43 degrees.</a> C. J Bacteriol. 170, 456-458 (1988).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este artigo apresenta um protocolo de mutagênese que permite a geração de grandes bibliotecas de mutantes aleatórios sem a necessidade de clonagem ou PCR. Este método baseia-se propenso a erros de replicação de um plasmídeo uma seqüência de interesse. Em teoria, as mutações devem ser em grande parte restrita à 100-300 pb, localizado imediatamente a jusante do interruptor de RNA / DNA, o tamanho do líder vertente intermediários produzidos por Pol I 2,10. Descobrimos que nas condições apresentadas neste protocolo, mutações Pol I ocorrem em todo o plasmídeo, embora diminuindo em freqüência como a distância entre os aumentos plasmídeo ori (Figura 3). Este achado implica que a transição ou &quot;switch&quot; de Pol I Pol III ColE1 durante a replicação do plasmídeo é muito mais gradual do que o anteriormente reportado, pelo menos, nas nossas condições experimentais 2, e concorda com estudos anteriores sugerindo uma redundância funcional entre I e Pol Pol III 11. Nosso protocolo original descrito mutagênese em culturas de líquido (4). Este protocolo produz mutações 0,41 / kb para d &lt;1000, ou seja, dentro da bp 1000 ao lado do RNA / DNA switch (Tabela 1). Hypersaturation deixando a cultura líquido no shaker durante 3 dias sem a adição de qualquer mídia fresco aumenta a freqüência de mutação para 0,70 mutações / kb, mas resulta em muito pobre rendimento plasmídeo (menos de 1% em relação ao dia 1; dados não mostrados) ( Tabela 1). Aqui apresentamos um protocolo simplificado baseado diretamente plating a transformação do plasmídeo em ágar-alvo sólido a 37 ° C (Figura 1). Este procedimento produz a maior freqüência de mutação / ciclo de mutagênese (0,92 mutações / kb para d &lt;1,000) e facilita muito a iteração. Mudanças nas condições de cultura para meios sólidos também afeta o espectro de mutação (Tabela 2). Mutagênese plaqueamento direto reduz a marcada assimetria entre substituições de bases complementares par visto na cultura líquida (compare C → T vs G → A e A → G vs T → C). Por outro lado, plaqueamento direto produzido indels mais (de menos de 0,5% a 4%) e diminuiu o número de mutações A → G em 3 vezes, levando a uma super-representação de G / C mutações (74%). No geral, acreditamos que a maior simplicidade e maior eficiência do protocolo de plaqueamento direto aqui apresentados superam os benefícios do espectro de mutação um pouco mais equilibrada produzidos por mutagênese líquido. Dentro da meta plasmídeo, as mutações geradas pelo nosso método não se restringem à seqüência alvo desejado. No entanto, a evolução do romance de atividades bioquímicas deve ser dependente de mutações no gene alvo, uma vez que representa uma mais qualitativa do que uma mudança quantitativa. Assim, combinando a nossa mutagênese plasmídeo com a triagem de mutantes em placas gradiente capitaliza os pontos fortes do nosso sistema (grandes bibliotecas e disponibilidade de seleção) para a evolução de novas propriedades bioquímicas. Outras aplicações de mutagênese aleatória como a otimização existentes atividades enzimáticas ou randomizing áreas específicas de um gene exigem clonagem seguintes mutagênese aleatória. Neste caso, tendo a biblioteca em um plasmídeo, por oposição a um produto de amplificação PCR melhora a eficiência da clonagem, facilitando a amplificação e restrição. Em suma, nós demonstramos um protocolo simples para criar uma biblioteca aleatória mutante de um gene-alvo, dado que se destaca por sua simplicidade e pela diversidade das bibliotecas geradas. Nós mostramos como esse método pode ser acoplado com seleções funcionais para a evolução eficiente de novas atividades bioquímicas. Além disso, nossa in vivo gerado bibliotecas podem ser facilmente clonados, permitindo site-specific mutagênese ou otimização das atividades existentes.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>carbenicillin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CellGro</td>
<td>46100R6</td>
<td>0.1mg/ml final</td>
</tr>
<tr>
<td>tetracycline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP7640</td>
<td>0.05mg/ml final</td>
</tr>
<tr>
<td>chloramphenicol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genlantis</td>
<td>M120100</td>
<td>0.03mg/ml final</td>
</tr>
<tr>
<td>LB Agar Miller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP1425</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB Broth Miller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>244620</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Soft Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>214580</td>
<td>Made in house</td>
</tr>
<tr>
<td>Acridine Orange</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A38401-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antifoam B emulsion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros</td>
<td>332030025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100x100x15mm sq dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>0875711A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100mm rnd dish </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>0875712A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope slide 25x75x1mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gold Seal</td>
<td>3048</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electroporator 2510</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electroporator 2510</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2mm gap tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MolBioproducts</td>
<td>5520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zippy mini prep kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zymo </td>
<td>D4020</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

mutagenesis and functional selection protocols for directed evolution of proteins in e. coli

A geração eficiente de diversidade genética representa uma ferramenta valiosa molecular que pode ser usado para rotular a síntese de DNA, para criar assinaturas única molecular, ou a evoluir proteínas no laboratório. Aqui, apresentamos um protocolo que permite a geração de grandes (&gt; 10 11) bibliotecas mutante para uma seqüência alvo. Este método é baseado na replicação de um plasmídeo codificando ColE1 a seqüência desejada por uma variante de baixa fidelidade da DNA polimerase I (LF-Pol I). O alvo do plasmídeo é transformada em uma cepa de E. mutator coli e semeadas em meios sólidos, rendendo entre 0,2 e 1 mutações / kb, dependendo da localização do gene alvo. Freqüências mais altas de mutação são alcançados por iteração deste processo de mutagênese. Em comparação com métodos alternativos de mutagênese, nosso protocolo destaca-se pela sua simplicidade, como nenhuma clonagem ou PCR estão envolvidos. Assim, nosso método é ideal para a rotulagem de mutação de plasmídeos ou modelos I, com Pol ou para explorar grandes seções de espaço de seqüência para a evolução das actividades não presentes no alvo original. O rígido controle espacial que PCR ou randomizado oligonucleotídeos baseados em oferecer métodos também podem ser alcançados por meio da clonagem posterior de seções específicas da biblioteca. Aqui nós fornecemos protocolos mostrando como criar uma biblioteca de mutantes aleatórios e como estabelecer droga baseada em seleções em E. coli para identificar mutantes exibindo novas atividades bioquímicas.

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Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Aqui demonstramos um protocolo simples para criar uma biblioteca aleatória mutante para uma seqüência alvo. Nós mostramos como esse método, que é realizado in vivo em Escherichia coli, pode ser acoplado com seleções funcional para evoluir novas atividades enzimáticas.

Mutagênese e Funcional Protocolos de Seleção para a Evolução Dirigida de proteínas em E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

mutagenesis-functional-selection-protocols-for-directed-evolution

Research

JoVE Journal

Biology

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

30.2K visualizações.  University of California Santa Cruz - UCSC. Aqui demonstramos um protocolo simples para criar uma biblioteca aleatória mutante para uma seqüência alvo. Nós mostramos como esse método, que é realizado in vivo em Escherichia coli, pode ser acoplado com seleções funcional para evoluir novas atividades enzimáticas.