Este protocolo passo-a-passo mostra como detectar e caracterizar funcionalmente a atividade enzimática das ligaduras de ubiquína tipo RING, tanto in vitro quanto em planta, através de uma abordagem mutagênese direcionada ao local. Ao introduzir mutação em um domínio RING através da mutagênese dirigida ao local, o mutante deficiente do E3 pode ser testado em paralelo com a proteína do tipo selvagem para vincular a atividade enzimática com a funcionalidade. Elucidar a base bioquímica e mecânica das ligaduras de ubiquitina tipo RING E3 pode contribuir muito para nossa compreensão de sua significância biológica no desenvolvimento, sinalização de estresse e manutenção da homeostase.
Com uma pequena modificação do sistema de expressão in vivo, este protocolo pode ser aplicado à análise de qualquer liga ligase E3 tipo RING, independentemente de sua origem. Comece identificando os Ciácidos conservados e seus aminoácidos no domínio RING e projetando primers que carregam o codon de substituição de interesse ladeado por 15 pares de base em ambos os lados do local da mutação. É fundamental identificar adequadamente o domínio RING, particularmente seus resíduos de cisteína e histidina conservados.
Ferramentas online como o PROSITE podem ser usadas para fazê-lo. Use os primers mutagênicos na amplificação PCR para introduzir a mutação desejada no plasmídeo que abriga o gene de interesse, certificando-se de usar uma polimerase de DNA de alta fidelidade, como Pfu. Após o PCR, digerir o DNA metilado parental derivado de E.coli e semi-metilado adicionando três microliters de enzima de restrição dpnl diretamente à reação pcr e incubando-o a 37 graus Celsius por duas horas.
Purificar os plasmídeos mutagenizados com um kit comercial de extração de DNA, e elute o DNA em 50 microliters de água. Em seguida, transforme as células DH5-alfa E.coli quimicamente competentes com 0,5 microlitres do DNA plasmídeo mutagenizado recuperado de acordo com o protocolo do fabricante. Clone os genes de interesse do ring do tipo selvagem e do RING mutado no vetor pMAL-c2 para fundir esses genes com a tag de epítope MBP.
Em seguida, configure a reação in vitro de ubiquitina em um volume total de 30 microliters, como descrito no manuscrito, e incubar a mistura a 30 graus Celsius por duas horas. Termine a reação misturando a amostra com 7,5 microliters de 5x tampão de carga SDS-PAGE e fervendo-a por cinco minutos, em seguida, separe as proteínas com eletroforese de gel de 7,5%SDS-poliacrilamida. Transfira para a membrana PVDF e detecte a ubiquitinização com manchas ocidentais e anti-BANDEIRA.
Manche a membrana com azul Coomassie para verificar o carregamento igual da proteína do tipo MBP-RING testada. A raia das tumefaciens de agrobacterium carrega o gene de interesse marcado por epitope no meio LB contendo os antibióticos de seleção apropriados. Após dois dias de crescimento a 28 graus Celsius, escolha colônias únicas, e plante-as em meio líquido LB com antibióticos a 28 graus Celsius e 250 rpm por mais 24 horas.
Transfira 100 microliters de cultura agrobacteriana para três mililitros de LB frescos com antibióticos, e incubar a cultura por mais quatro a seis horas. Gire as células a 1.800 vezes g por seis minutos, descarte o supernasciente e resuspenque as células com três mililitros de tampão de lavagem. Repita a lavagem duas vezes, depois resuspenque as células no tampão de indução e incuba-as por mais 10 a 12 horas a 28 graus Celsius.
Após a incubação, centrifugar as células a 1.800 vezes g por seis minutos, e descartar o supernasce. Resuspend as células com dois mililitros de tampão de infiltração, e determinar a concentração de bactérias usando o valor OD600. Agroinfiltrar folhas nicotiana benthamiana de quatro semanas de idade, picando-as suavemente com uma agulha, e injetar a mão Agrobacterium com uma seringa, em seguida, circular a área infiltrada com um marcador.
Depois de 36 horas, recolha o tecido da folha infiltrado, e moer-o em um pó fino com nitrogênio líquido. Resuspengue o pó de tecido com 300 microliters de tampão de extração de proteínas, e centrífuga-o a 15.000 vezes g por 15 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o supernante para um tubo fresco, adicione 5x tampão de carga SDS-PAGE para uma concentração final de 1x e ferva a amostra por cinco minutos.
Em seguida, realize a análise da mancha ocidental para detectar na ubiquização da planta. Listrar as cepas de tumefaciens agrobacterium apropriadas carregando genes marcados de interesse ou vetor vazio, e injetar a Agrobacterium nas folhas de Nicotiana benthamiana, como descrito anteriormente. Para a degradação da proteína substrato dependente do E3, siga o protocolo descrito anteriormente e realize manchas ocidentais com anticorpos apropriados para detectar acúmulo de proteínas em células vegetais.
Para a inibição de morte celular mediada por resposta hipersensível e 3, monitore as folhas agroinfiltadas para sintomas de morte celular de dois a quatro dias após a infiltração. Um típico resultado de ensaio de ubiquização in vitro contém uma mancha multibanda começando pelo peso molecular da proteína testada e progredindo para cima. Como esperado, controles negativos que faltam componentes individuais ou o uso de MBP não demonstraram o sinal manchado.
Além disso, a coloração azul Coomassie da membrana PVDF mostrou carregamento igual de MBP-RHA1B ou MBP em todos os controles. 11 E2s diferentes foram testados para investigar como a ubiquização in vitro varia dependendo da combinação específica de E2 a E3. A atividade de ubiquização detectada variou de nenhum sinal a uma mancha multibanda começando em diferentes pesos moleculares, indicando diferentes padrões de ubiquização.
As versões RING-e K-mutante de RHA1B foram testadas para ubiquitina in vitro e em planta. A falta de atividade enzimática da versão mutante ring é suportada por sua incapacidade de gerar uma mancha multibanda in vitro ou promover o sinal de poli-ubiquização na planta. Embora um sinal de auto-ubiquização marginal tenha sido detectado in vitro para o mutante K, apenas a ubiquização de fundo foi detectada na planta, sugerindo que o resíduo de K146 também é essencial para a atividade E3.
Ao contrário do RHA1B do tipo selvagem, o mutante RING sem atividade ligase E3 não interferiu com a morte celular de resposta hipersensível. A mancha ocidental confirmou que o Gpa2 não se acumulou na presença de RHA1B tipo selvagem, mas o mutante RING não teve impacto na estabilidade da proteína. Dado que uma combinação E2-E3 adequada é necessária para a reação de ubiquização, ensaios de ubiquização in vitro devem ser realizados em paralelo com múltiplas enzimas E2 representando diferentes classes E2 para evitar resultados falsos negativos.
Um mutante com deficiência de ligase E3 facilita o teste de interações entre enzimas enzimes enzimes enzimes in vivo. Além disso, este mutante frequentemente confere um fenótipo negativo dominante que pode ser utilizado em estudos funcionais de nocaute como uma abordagem alternativa ao RNAi. Usando este protocolo, foi recentemente constatado que o efeito de nematode RHA1B interfere com a sinalização imunológica da planta de forma dependente do E3, mirando o imunorreceptor gpa2 da planta para ubiquitinação e degradação.
