Questo lavoro è stato sostenuto da CA116429 premio K08-04 a MC e da una sovvenzione da parte del Conquer Cancer Now (preoccupazione) fondazione # 8501

<ol>
	<li>Camps, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+ColE1-like+plasmid+replication+for+recombinant+gene+expression.">Modulation of ColE1-like plasmid replication for recombinant gene expression.</a> Recent Pat DNA Gene Seq. 4, 58-73 (2010).</li><li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+replication+of+plasmid+ColE1+DNA+by+RNA+polymerase,+ribonuclease+H,+and+DNA+polymerase+I.">Initiation of replication of plasmid ColE1 DNA by RNA polymerase, ribonuclease H, and DNA polymerase I.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 1, 409-417 (1979).</li><li>Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ColE1+replication+control+circuitry:+sense+from+antisense.">ColE1 replication control circuitry: sense from antisense.</a> Cell. 55, 929-932 (1988).</li><li>Camps, M., Naukkarinen, J., Johnson, B. P., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+evolution+in+Escherichia+coli+using+a+highly+error-prone+DNA+polymerase+I.">Targeted gene evolution in Escherichia coli using a highly error-prone DNA polymerase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 9727-9732 (2003).</li><li>Shinkai, A., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mutagenesis+by+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I.+Ile(709)+in+motif+A+functions+in+base+selection.">In vivo mutagenesis by Escherichia coli DNA polymerase I. Ile(709) in motif A functions in base selection.</a> J Biol Chem. 276, 46759-46764 (2001).</li><li>Uyemura, D., Lehman, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+mutant+forms+of+DNA+polymerase+I+from+Escherichia+coli.+I.+The+polA12+mutation.">Biochemical characterization of mutant forms of DNA polymerase I from Escherichia coli. I. The polA12 mutation.</a> J Biol Chem. 251, 4078-4084 (1976).</li><li>Sedgwick, B., Robins, P., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+removal+of+alkylation+damage+from+DNA+by+AlkB+and+related+DNA+dioxygenases.">Direct removal of alkylation damage from DNA by AlkB and related DNA dioxygenases.</a> Methods Enzymol. 408, 108-120 (2006).</li><li>Aharoni, A., Gaidukov, L., Khersonsky, O., Mc, Q. G. S., Roodveldt, C., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+'evolvability'+of+promiscuous+protein+functions.">The 'evolvability' of promiscuous protein functions.</a> Nat Genet. 37, 73-76 (2005).</li><li>Elena, S. F., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+experiments+with+microorganisms:+the+dynamics+and+genetic+bases+of+adaptation.">Evolution experiments with microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation.</a> Nat Rev Genet. 4, 457-469 (2003).</li><li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoFormation+of+an+RNA+primer+for+initiation+of+replication+of+ColE1+DNA+by+ribonuclease+H.">FoFormation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 2450-2454 (1980).</li><li>Bryan, S. K., Moses, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sufficiency+of+the+Klenow+fragment+for+survival+of+polC(Ts)+pcbA1+Escherichia+coli+at+43+degrees.">Sufficiency of the Klenow fragment for survival of polC(Ts) pcbA1 Escherichia coli at 43 degrees.</a> C. J Bacteriol. 170, 456-458 (1988).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo articolo presenta un protocollo di mutagenesi che consente la generazione di grandi librerie casuali mutante senza la necessità di clonazione o PCR. Questo metodo è basato sul soggetto a errori di replica di un plasmide codifica di una sequenza di interesse. In teoria, le mutazioni devono essere in gran parte limitato ai 100-300 pb situato immediatamente a valle del DNA / RNA interruttore, la dimensione del leader filo intermedia prodotta da Pol I 2,10. Abbiamo trovato che, nelle condizioni presentate in questo protocollo, Pol mutazioni ho verificarsi in tutto il plasmide, anche se diminuisce la frequenza come la distanza dagli aumenti plasmide ori (Figura 3). Questa scoperta implica che la transizione o &quot;switch&quot; da Pol I, Pol III ColE1 durante la replicazione del plasmide è molto più graduale di quanto riportato in precedenza, almeno nelle nostre condizioni sperimentali 2, e concorda con studi precedenti suggeriscono una ridondanza funzionale tra Pol I e Pol III 11. Il nostro protocollo originale descritta mutagenesi in colture liquide (4). Questo protocollo produce mutazioni 0,41 / kb per d &lt;1000, cioè entro il 1000 bp adiacente al DNA / RNA interruttore (Tabella 1). Hypersaturation lasciando la coltura liquida nello shaker per 3 giorni senza l&#39;aggiunta di eventuali nuovi mezzi di comunicazione aumenta la frequenza di mutazione mutazioni a 0,70 / kb, ma si traduce in pessime resa plasmide (meno dell&#39;1% rispetto al giorno 1; dati non riportati) ( Tabella 1). Qui vi presentiamo un protocollo semplificato basato sulla placcatura direttamente la trasformazione del target plasmide su agar solido a 37 ° C (Figura 1). Questo procedimento produce la maggior frequenza di mutazione / ciclo di mutagenesi (0,92 mutazioni / kb per d &lt;1000) e facilita notevolmente l&#39;iterazione. Modifica condizioni di coltura di terreni solidi colpisce anche lo spettro di mutazione (Tabella 2). Mutagenesi placcatura diretta riduce la marcata asimmetria tra sostituzioni di coppie di basi complementari visto in coltura liquida (confrontare C → T vs G → A e A → G vs T → C). D&#39;altra parte, la placcatura diretto prodotto più indel (da meno 0,5% al ​​4%) e diminuito il numero di mutazioni G → A per 3 volte, portando ad una sovrarappresentazione di G / C mutazioni (74%). Nel complesso, crediamo che la maggiore semplicità e maggiore efficienza del protocollo placcatura diretta qui presentati supera i benefici dello spettro di mutazione leggermente più equilibrata prodotto da mutagenesi liquido. All&#39;interno dell&#39;obiettivo plasmide, le mutazioni generate dal nostro metodo non si limitano alla sequenza target desiderato. Tuttavia, l&#39;evoluzione del romanzo di attività biochimiche dovrebbe dipendere da mutazioni nel gene bersaglio, in quanto rappresenta una qualitativa piuttosto che un cambiamento quantitativo. Così, unendo le nostre mutagenesi plasmide con proiezione di mutanti su piastre gradiente sfrutta i punti di forza del nostro sistema (librerie di grandi dimensioni e disponibilità di selezione) per l&#39;evoluzione di nuove proprietà biochimiche. Altre applicazioni di mutagenesi casuale come ottimizzare gli attuali attività enzimatiche o randomizing aree specifiche di un gene hanno bisogno di clonazione seguenti mutagenesi casuale. In questo caso, essendo la biblioteca in un plasmide in contrapposizione ad un prodotto di amplificazione di PCR migliora l&#39;efficienza della clonazione, facilitando l&#39;amplificazione e restrizione. In sintesi, si dimostra un semplice protocollo per creare una libreria casuale mutante di un gene bersaglio, dato che si distingue per la sua semplicità e per la diversità delle librerie generate. Mostriamo come questo metodo può essere accoppiato con le selezioni per l&#39;evoluzione funzionale efficiente di nuove attività biochimiche. Inoltre, il nostro in vivo generata librerie possono essere facilmente clonati, permettendo mutagenesi sito-specifica o di ottimizzazione delle attività già esistenti.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>carbenicillin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CellGro</td>
<td>46100R6</td>
<td>0.1mg/ml final</td>
</tr>
<tr>
<td>tetracycline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP7640</td>
<td>0.05mg/ml final</td>
</tr>
<tr>
<td>chloramphenicol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genlantis</td>
<td>M120100</td>
<td>0.03mg/ml final</td>
</tr>
<tr>
<td>LB Agar Miller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP1425</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB Broth Miller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>244620</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Soft Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>214580</td>
<td>Made in house</td>
</tr>
<tr>
<td>Acridine Orange</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A38401-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antifoam B emulsion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros</td>
<td>332030025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100x100x15mm sq dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>0875711A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100mm rnd dish </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>0875712A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope slide 25x75x1mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gold Seal</td>
<td>3048</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electroporator 2510</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electroporator 2510</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2mm gap tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MolBioproducts</td>
<td>5520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zippy mini prep kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zymo </td>
<td>D4020</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

mutagenesis and functional selection protocols for directed evolution of proteins in e. coli

La generazione efficiente della diversità genetica rappresenta un prezioso strumento molecolare che può essere utilizzato per etichettare la sintesi del DNA, per creare uniche firme molecolari, o per evolvere le proteine ​​in laboratorio. Qui, vi presentiamo un protocollo che consente la generazione di grandi dimensioni (&gt; 10 11) biblioteche mutante per una sequenza bersaglio determinato. Questo metodo si basa sulla replica di un plasmide codifica ColE1 sequenza desiderata da una bassa fedeltà variante della DNA polimerasi I (LF-Pol I). L&#39;obiettivo plasmide si trasforma in un ceppo di E. mutatore coli e placcato su un supporto solido, producendo tra 0,2 e 1 mutazioni / kb, a seconda della posizione del gene bersaglio. Frequenze di mutazione superiori si ottengono iterando questo processo di mutagenesi. Rispetto a metodi alternativi di mutagenesi, il nostro protocollo si distingue per la sua semplicità, in quanto non la clonazione o PCR sono coinvolti. Così, il nostro metodo è ideale per l&#39;etichettatura mutazionali di plasmidi o altri modelli io Pol o per esplorare ampie sezioni di sequenza spazio per l&#39;evoluzione delle attività non presenti nel target originale. Lo stretto controllo dello spazio che la PCR o randomizzati oligonucleotide a base di offrire metodi possono anche essere ottenuto attraverso la clonazione di successive specifiche sezioni della biblioteca. Qui forniamo protocolli che mostra come creare una libreria casuale mutante e le modalità per stabilire farmaco a base di selezioni in E. coli per identificare mutanti espositrici nuove attività biochimiche.

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Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Qui mostriamo un semplice protocollo per creare una libreria casuale mutante per una sequenza bersaglio determinato. Mostriamo come questo metodo, che viene eseguita in vivo in Escherichia coli, possono essere accoppiati con selezioni funzionali ad evolvere nuove attività enzimatiche.

Protocolli di selezione mutagenesi e funzionale per l&#39;evoluzione Regia di proteine ​​in E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

mutagenesis-functional-selection-protocols-for-directed-evolution

Research

JoVE Journal

Biology

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

30.1K Views.  University of California Santa Cruz - UCSC. Qui mostriamo un semplice protocollo per creare una libreria casuale mutante per una sequenza bersaglio determinato. Mostriamo come questo metodo, che viene eseguita in vivo in Escherichia coli, possono essere accoppiati con selezioni funzionali ad evolvere nuove attività enzimatiche.

Protocolli di selezione mutagenesi e funzionale per l'evoluzione Regia di proteine ​​in E. coli

Protocolli di selezione mutagenesi e funzionale per l'evoluzione Regia di proteine in E. coli