Diese Arbeit wurde von K08 Auszeichnung CA116429-04 bis MC und durch einen Zuschuss aus dem Conquer Cancer Now (Sorge) Stiftung # 8501 unterstützt

<ol>
	<li>Camps, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+ColE1-like+plasmid+replication+for+recombinant+gene+expression.">Modulation of ColE1-like plasmid replication for recombinant gene expression.</a> Recent Pat DNA Gene Seq. 4, 58-73 (2010).</li><li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+replication+of+plasmid+ColE1+DNA+by+RNA+polymerase,+ribonuclease+H,+and+DNA+polymerase+I.">Initiation of replication of plasmid ColE1 DNA by RNA polymerase, ribonuclease H, and DNA polymerase I.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 1, 409-417 (1979).</li><li>Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ColE1+replication+control+circuitry:+sense+from+antisense.">ColE1 replication control circuitry: sense from antisense.</a> Cell. 55, 929-932 (1988).</li><li>Camps, M., Naukkarinen, J., Johnson, B. P., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+evolution+in+Escherichia+coli+using+a+highly+error-prone+DNA+polymerase+I.">Targeted gene evolution in Escherichia coli using a highly error-prone DNA polymerase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 9727-9732 (2003).</li><li>Shinkai, A., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mutagenesis+by+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I.+Ile(709)+in+motif+A+functions+in+base+selection.">In vivo mutagenesis by Escherichia coli DNA polymerase I. Ile(709) in motif A functions in base selection.</a> J Biol Chem. 276, 46759-46764 (2001).</li><li>Uyemura, D., Lehman, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+mutant+forms+of+DNA+polymerase+I+from+Escherichia+coli.+I.+The+polA12+mutation.">Biochemical characterization of mutant forms of DNA polymerase I from Escherichia coli. I. The polA12 mutation.</a> J Biol Chem. 251, 4078-4084 (1976).</li><li>Sedgwick, B., Robins, P., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+removal+of+alkylation+damage+from+DNA+by+AlkB+and+related+DNA+dioxygenases.">Direct removal of alkylation damage from DNA by AlkB and related DNA dioxygenases.</a> Methods Enzymol. 408, 108-120 (2006).</li><li>Aharoni, A., Gaidukov, L., Khersonsky, O., Mc, Q. G. S., Roodveldt, C., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+'evolvability'+of+promiscuous+protein+functions.">The 'evolvability' of promiscuous protein functions.</a> Nat Genet. 37, 73-76 (2005).</li><li>Elena, S. F., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+experiments+with+microorganisms:+the+dynamics+and+genetic+bases+of+adaptation.">Evolution experiments with microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation.</a> Nat Rev Genet. 4, 457-469 (2003).</li><li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoFormation+of+an+RNA+primer+for+initiation+of+replication+of+ColE1+DNA+by+ribonuclease+H.">FoFormation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 2450-2454 (1980).</li><li>Bryan, S. K., Moses, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sufficiency+of+the+Klenow+fragment+for+survival+of+polC(Ts)+pcbA1+Escherichia+coli+at+43+degrees.">Sufficiency of the Klenow fragment for survival of polC(Ts) pcbA1 Escherichia coli at 43 degrees.</a> C. J Bacteriol. 170, 456-458 (1988).</li></ol>

Dieser Artikel stellt eine Mutagenese-Protokoll, das die Erzeugung von großen zufälligen Mutanten-Bibliotheken ermöglicht, ohne die Notwendigkeit zum Klonen oder PCR. Diese Methode basiert auf fehleranfällige Replikation eines Plasmids kodierend für eine Sequenz von Interesse basiert. In der Theorie Mutationen weitgehend sollten von 100-300 bp unmittelbar hinter dem RNA / DNA-Schalter befindet eingeschränkt werden, produziert von der Größe des Führers Strang Intermediat durch Pol I 2,10. Wir fanden, dass unter den Bedingungen in diesem Protokoll vorgestellt, Pol I-Mutationen in der ganzen Plasmid auftreten, obwohl abnehmende Häufigkeit der Entfernung aus dem Plasmid ori erhöht (Abbildung 3). Diese Erkenntnis impliziert, dass der Übergang oder &quot;switch&quot; von Pol I zu Pol III während ColE1 Plasmidreplikation viel langsamer als bisher berichtet wird, zumindest unter unseren experimentellen Bedingungen 2, und stimmt mit früheren Studien, in denen eine funktionelle Redundanz zwischen Pol I und Pol III 11. Unsere ursprüngliche Protokoll beschriebene Mutagenese in flüssigen Kulturen (4). Dieses Protokoll liefert 0,41 Mutationen / kb für d &lt;1000, also innerhalb der 1000 bp neben dem RNA / DNA-Schalter (Tabelle 1). Hypersaturation, indem man die Flüssigkeit Kultur in den Shaker für 3 Tage ohne den Zusatz von frischen Medien stellt sich die Mutationsrate auf 0,70 Mutationen / kb aber die Ergebnisse in einem sehr schlechten Plasmidausbeute (weniger als 1% im Vergleich zu Tag 1; Daten nicht gezeigt) ( Tabelle 1). Hier präsentieren wir ein vereinfachtes Protokoll direkt plating die Umwandlung der Zielplasmid auf Agar bei 37 ° C auf (Abbildung 1). Dieses Verfahren produziert die größte Häufigkeit der Mutation / Zyklus von Mutagenese (0,92 Mutationen / kb für d &lt;1000) und erleichtert Iteration. Ändern Kulturbedingungen auf festen Medien wirkt sich auch auf die Mutation Spektrum (Tabelle 2). Direkte Beschichtung Mutagenese reduziert die deutliche Asymmetrie zwischen komplementären Basenpaar-Substitutionen in flüssiger Kultur gesehen (vgl. C → T vs G → A und A → G vs T → C). Auf der anderen Seite, produziert direkte Beschichtung mehr indels (von weniger als 0,5% bis 4%) und verringerte sich die Zahl der A → G Mutationen durch 3-fache, was zu einer Überrepräsentation von G / C-Mutationen (74%). Insgesamt glauben wir, dass der größere Einfachheit und erhöhte Effizienz der direkten Beschichtung Protokoll hier präsentierten die Vorteile der etwas ausgeglichener Mutationsspektrum mit flüssigem Mutagenese erzeugt überwiegt. Im Rahmen des Ziels Plasmid, sind die Mutationen, die durch unsere Methode generiert nicht zu dem gewünschten Ziel-Sequenz beschränkt. Allerdings sollte die Entwicklung von neuartigen biochemischen Aktivitäten abhängig sein Mutationen innerhalb des Zielgens, da es eine eher qualitative als quantitative Veränderung darstellt. So kombinieren wir unsere Plasmid Mutagenese mit Screening von Mutanten auf Gradienten-Platten nutzt die Stärken unseres Systems (große Bibliotheken und Verfügbarkeit der Auswahl) für die Entwicklung von neuen biochemischen Eigenschaften. Weitere Anwendungen von Zufallsmutagenese wie die Optimierung der bestehenden enzymatischen Aktivitäten oder randomizing bestimmte Bereiche eines Gens erfordern Klonen folgenden Zufallsmutagenese. In diesem Fall haben die Bibliothek in ein Plasmid zu einer PCR-Amplifikation Produkt Gegensatz verbessert die Effizienz des Klonens durch die Erleichterung Verstärkung und Beschränkung. In Summe zeigen wir ein einfaches Protokoll, um eine zufällige Mutantenbibliothek für einen bestimmten Zielgens, das sich durch seine Einfachheit und für die Vielfalt der Bibliotheken generiert erstellen. Wir zeigen, wie diese Methode mit funktionellen Selektionen für die effiziente Entwicklung von neuen biochemischen Aktivitäten gekoppelt werden kann. Darüber hinaus können unsere in vivo generierten Bibliotheken werden einfach geklont, so dass ortsspezifische Mutagenese oder Optimierung der bestehenden Aktivitäten.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>carbenicillin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CellGro</td>
<td>46100R6</td>
<td>0.1mg/ml final</td>
</tr>
<tr>
<td>tetracycline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP7640</td>
<td>0.05mg/ml final</td>
</tr>
<tr>
<td>chloramphenicol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genlantis</td>
<td>M120100</td>
<td>0.03mg/ml final</td>
</tr>
<tr>
<td>LB Agar Miller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP1425</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LB Broth Miller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>244620</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Soft Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>214580</td>
<td>Made in house</td>
</tr>
<tr>
<td>Acridine Orange</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A38401-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antifoam B emulsion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5757</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acros</td>
<td>332030025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100x100x15mm sq dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>0875711A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100mm rnd dish </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>0875712A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope slide 25x75x1mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gold Seal</td>
<td>3048</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electroporator 2510</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electroporator 2510</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2mm gap tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MolBioproducts</td>
<td>5520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zippy mini prep kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zymo </td>
<td>D4020</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

mutagenesis and functional selection protocols for directed evolution of proteins in e. coli

Die effiziente Erzeugung der genetischen Vielfalt stellt einen unschätzbaren molekulare Werkzeug, um die DNA-Synthese-Label, um einzigartige molekulare Signaturen zu erstellen oder Proteine ​​im Labor entwickelt werden können. Hier präsentieren wir ein Protokoll, das die Erzeugung von großen (&gt; 10 11) Mutantenbibliotheken für eine bestimmte Zielsequenz ermöglicht. Diese Methode basiert auf der Replikation eines ColE1 Plasmid-Kodierung der gewünschten Reihenfolge von einer low-fidelity-Variante der DNA-Polymerase I (LF-Pol I). Das Ziel Plasmid wird in eine Mutatorstamm von E. verwandelt coli und verchromt auf festen Medien, wodurch zwischen 0,2 und 1-Mutationen / kb, je nach Lage des Zielgens. Höhere Mutation Frequenzen werden durch Iteration dieses Prozesses der Mutagenese erreicht. Im Vergleich zu alternativen Methoden der Mutagenese, steht unser Protokoll durch seine Einfachheit, da keine Klonen oder PCR beteiligt sind. So ist unsere Methode ideal für Mutationsanalysen Kennzeichnung von Plasmiden oder anderen Pol I-Vorlagen oder um große Teile der Sequenz Raum für die Entwicklung der Tätigkeiten, die nicht in das ursprüngliche Ziel zu erkunden. Die enge räumliche Steuerung, die PCR oder randomisierte Oligonukleotid-basierte Methoden bieten auch durch nachfolgende Klonierung von bestimmten Abschnitten der Bibliothek erreicht werden. Hier bieten wir Protokolle zeigen, wie man einen zufälligen Mutanten-Bibliothek zu erstellen und wie Drogen-Selektionen in E. etablieren coli Mutanten ausstellenden neuen biochemischen Aktivitäten zu identifizieren.

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Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Hier zeigen wir ein einfaches Protokoll, um eine zufällige Mutantenbibliothek für eine bestimmte Zielsequenz zu schaffen. Wir zeigen, wie diese Methode, die in vivo in Escherichia coli durchgeführt wird, mit funktionellen Selektionen gekoppelt werden kann, um neue enzymatische Aktivitäten entwickeln.

Mutagenese und Functional Selection Protocols for Directed Evolution von Proteinen in E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

mutagenesis-functional-selection-protocols-for-directed-evolution

Research

JoVE Journal

Biology

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

30.1K Aufrufe.  University of California Santa Cruz - UCSC. Hier zeigen wir ein einfaches Protokoll, um eine zufällige Mutantenbibliothek für eine bestimmte Zielsequenz zu schaffen. Wir zeigen, wie diese Methode, die in vivo in Escherichia coli durchgeführt wird, mit funktionellen Selektionen gekoppelt werden kann, um neue enzymatische Aktivitäten entwickeln.