Este protocolo permite a criação consistente de micro padrões proteicos de alta fidelidade de qualquer forma desejada, notadamente ilhas isoladas de padrão para estudo de aglomerados celulares. Esta técnica pode ser usada para fazer micro padrões isolados da ilha de qualquer forma e tamanho em apenas uma etapa, enquanto anteriormente fazer tais padrões exigia dois passos separados. Comece misturando PDMS na correta relação agente de cura com a razão base, conforme descrito nas instruções do fabricante.
Incubar à temperatura ambiente e à pressão por 15 minutos, depois desarmar a mistura sob vácuo por 15 minutos. Despeje o PDMS no molde mestre e transfira-o para uma incubadora fixada a 37 graus Celsius para curar durante a noite. Remova o molde mestre da incubadora e deixe esfriar até a temperatura ambiente.
Enquanto o molde mestre está esfriando, sonicate 25 milímetros cobre deslizamentos em etanol por 10 minutos. Use tantas tampas quanto o número de selos que estão sendo preparados. Enxágue completamente as tampas com água DI e seque-as usando uma pistola de ar filtrada.
Trate as tampas com plasma por um minuto usando o limpador de plasma sob um vácuo alto. Solte lentamente o vácuo após o tratamento para evitar que as tampas se movam dentro da câmara. Cubra cada tampa com 100 microliters da solução de proteína fluorescente rotulada em uma sala desprovida de luz solar direta ou iluminação aérea.
Cubra as amostras para proteção extra contra a luz e incuba-as por 20 minutos em temperatura ambiente. Enxágue bem cada mancha com água DI. Remova o excesso de água da superfície tocando suavemente as laterais de cada mancha de cobertura sobre uma toalha de papel ou um material absorvente semelhante.
Deixe as tampas secarem completamente, deixando-as descobertas no escuro por pelo menos 30 minutos. Enquanto as tampas revestidas de proteína secam, remova o carimbo PDMS do molde mestre cortando-o com um bisturi ou qualquer lâmina afiada. Trate os selos PDMS com plasma por dois minutos sob um vácuo alto.
Coloque os selos em um recipiente com uma tampa sob o capô da fumaça, em seguida, cubra cada carimbo com uma fina camada de 10%3-APTMS diluída em 100% etanol. Cubra o recipiente com os selos e incubar em temperatura ambiente por cinco minutos. Enxágue minuciosamente cada carimbo em ambos os lados com água DI.
Coloque os selos em um recipiente limpo e cubra-os com 2,5% de glutaraldeído preparado em água DI. Cubra os selos e incuba-os em temperatura ambiente por 30 minutos. Enxágüe bem os selos com água DI.
Remova o excesso de água da superfície como descrito anteriormente e permita que os selos sequem descobertos por 30 minutos. Se depois de 30 minutos as tampas revestidas de proteína ou os selos não estiverem completamente secos, use uma pistola de ar filtrada para secá-las completamente. Empurre o lado padrão dos selos para as tampas com pressão suficiente para que eles façam contato completo.
Deixe-o intacto por 15 minutos. Em seguida, retire cuidadosamente os selos PDMS das tampas. Usando um microscópio fluorescente com o filtro apropriado, verifique a fidelidade das tampas padronizadas.
Use as tampas padronizadas imediatamente ou armazene-as longe da luz direta até que use mais. Antes de preparar o precursor do hidrogel PAA, remova o éster de ácido acrílico NHS da geladeira para atingir a temperatura ambiente antes de ser aberto. Prepare um prato de deslizamento intercambiável, esterilizando-o com 70% de etanol, em seguida, incuba-o sob luz UV em um armário de biossegurança por pelo menos 30 minutos antes do uso.
Sob o capô da fumaça, adicione 1,25 mililitros de 40% de acrilamida preparado em água DI a um tubo cônico de 15 mililitros. Ao mesmo tubo, adicione 175 microliters de solução de bis-acrilamida preparada em água DI. Em seguida, adicione 500 microliters de 10X PBS, seguido por 2.915 mililitros de água DI.
Pipeta 969 microliters deste precursor em um tubo de microcentrífugo de 1,5 mililitro e armazenar o resto a quatro graus Celsius por até duas semanas. Meça de 50 a 100 miligramas de APS em um tubo de microcentrífuga fresco e dilua-o a 100 miligramas por mililitro em água DI. Abra o éster NHS no capô e meça cuidadosamente até três miligramas de NHS em um tubo de microcentrifusagem.
Diluir o éster NHS para um miligrama por mililitro em 1X PBS. Sob a capa de fumaça, adicione dois microliters de TEMED ao tubo de microcentrifuuge contendo a alíquota de 969 microliter do precursor paa. Adicione 15 microlitres de um HCL molar para diminuir o pH da solução de hidrogel e evitar a hidrólise do éster NHS.
Adicione 10 microliters da solução de éster NHS ao tubo. Execute as seguintes etapas em um gabinete de biossegurança. Coloque cuidadosamente o deslizamento de cobertura de 30 milímetros dentro da parte média do conjunto de pratos de deslizamento com o 3-APTMS e glutaraldeído tratado lado para cima e parafuso o anel de plástico em cima.
Configure o deslizamento de cobertura padronizado com exposição mínima à luz para se preparar para o próximo passo. Pipeta cinco microliters de solução APS no tubo de alíquota precursora paa, em seguida, inverter e misturar. Imediatamente pipeta 35 microliters desta solução no deslizamento de cobertura de 30 milímetros.
Coloque a mancha de cobertura padronizada na solução com o lado da proteína para baixo. Tenha cuidado para não criar bolhas de ar no hidrogel. Proteja o hidrogel da luz e deixe polimerizar por 90 minutos.
Uma vez que o hidrogel tenha polimerizado, use uma lâmina de barbear ou bisturi para remover o deslizamento superior, certifique-se de que o deslizamento não caia para trás ou deslize para fora do gel uma vez removido para evitar arruinar o padrão na superfície do gel. Para passivar qualquer éster NHS restante no hidrogel, adicione dois mililitros de PBS estéreis ao gel e incubar a 37 graus Celsius por 45 minutos. Prepare imediatamente os géis para experimentos ou armazene-os durante a noite em PBS estéril a quatro graus Celsius até que use mais.
Os hidrogéis foram indiretamente padronizados com fibronectina fluorescente para visualizar e medir as forças de tração celular dentro de clusters e criar padrões insulares de tamanho e forma predeterminados. A qualidade do padrão estava diretamente relacionada à fidelidade do molde mestre a partir do qual o selo PDMS foi lançado. Este método poderia fabricar padrões isolados e bem definidos de ilhas de forma predeterminada.
Os pontos de adesão à fibronectina estavam presentes apenas na área desejada da ilha. Essas ilhas isoladas de pontos de adesão permitiram ainda melhor controle da forma do cluster. O revestimento de selos PDMS com dois pequenos 3-APTMS é fundamental porque limitará a eficácia do método de remoção, enquanto muito criará um resíduo de laranja na superfície do selo.
Os padrões criados aqui podem ser usados para determinar forças de tração celular em células individuais e aglomerados, o que dá uma visão de sua capacidade de manter a homeostase mecânica.
