Os autores gostariam de agradecer o Departamento de Biologia da Universidade de Syracuse e Marilyn Dr. Kerr por seus papéis na administração do curso de Biologia Comparada de Vertebrados. O laboratório Albertson é apoiada por conceder R21DE019223 dos Institutos Nacionais de Saúde / Instituto Nacional de Pesquisa Dental e Craniofacial, bem como conceder R01AG031922 do National Institutes of Health / National Institute on Aging.

1. Transformação plasmídeo do Target cDNA Parte I: Transformação de Plasmid (Tempo necessário: 3 horas mais de incubação durante a noite) <ol><li> Caldo quente SOC nutrientes em um banho de água 42 ° C (500 mL por reação) </li><li> Descongele as células competentes sobre o gelo </li><li> Adicionar 1 mL a 25 mL plasmídeo células competentes </li><li> Colocar no gelo por 20 minutos </li><li> Calor células de choque em 42 banho de água ° C por 45 segundos </li><li> Colocar imediatamente as células no gelo por 2 minutos </li><li> Adicionar 500 mL de 42 ° C caldo de nutrientes para cada frasco de células </li><li> Agite a 37 ° C por 2 horas a 255 rotações por minuto (rpm) </li><li> Placa 75 mL mix de transformação em Luria Bertani placas (LB) ágar </li><li> Incubar as placas invertidas a 37 ° C durante a noite </li></ol> Parte II: E. Cultura coli (Tempo necessário: 15 minutos acrescido de incubação durante a noite) <ol><li> Para cada reação, 3 alíquota caldo LB mL e 3 mL de 50 mg / mL ampicilina em um tubo de cultura </li><li> Raspe uma colônia de bactérias da placa de agar e adicionar a cada tubo de cultura </li><li> Agitar tubos de cultura a 37 ° C em 255 rpm durante a noite </li></ol> Parte III: Prep Plasmid (Tempo necessário: 1,5 horas) <ol><li> Isolar plasmídeo de culturas durante a noite usando o Kit 5 Mini Prime FastPlasmid (Catalog # 2300000) </li><li> Para verificar a presença de plasmídeo preparada, execute o DNA eluído do kit em um gel de 1% Tris-acetato-EDTA (TAE) corado com brometo de etídio </li></ol> 2. In Situ DIG marcado Síntese da sonda RNA Parte I: Linearização de Plasmid (Tempo necessário: 2,5 horas) <ol><li> Em um microtubo de 1,5 mL, combine: <table border="1"><tbody><tr><td> Preparado Plasmid </td><td> 20 mL </td></tr><tr><td> * Enzima de restrição </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> Tampão ** </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> 10X albumina bovina (BSA) </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> Dietil Pyrocarbonate Água (DEPC) </td><td> 58 mL </td></tr><tr><td></td><td> 100 mL </td></tr></tbody></table></li><li> Incubar a 37 ° C por 2 horas * Varia de acordo com plasmídeo ** Varia de acordo com enzima de restrição </li></ol> Parte II: Transcrição (Tempo necessário: 3 horas) <ol><li> Em um microtubo de 1,5 mL, combine: <table border="1"><tbody><tr><td> Linear Plasmid </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Tampão Transcrição 10X ** </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Digoxigenina Mix Etiqueta </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> * Polimerase </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> Inibidor de RNase </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> Água DEPC </td><td> 24 mL </td></tr><tr><td></td><td> 40 mL </td></tr></tbody></table></li><li> Incubar a 37 ° C por 1 hora </li><li> Adicione 2 mL da polimerase * </li><li> Incubar a 37 ° C por 1 hora </li><li> Adicione 2 mL de DNase </li><li> Incubar a 37 ° C por 20 minutos * Varia de acordo com plasmídeo ** Varia de acordo com polimerase </li></ol> Parte III: Precipitação (Tempo necessário: 5 minutos mais duas horas de incubação durante a noite, uma hora para outra centrífuga e re-suspensão) <ol><li> Adicionar 4 mL de EDTA 0,2 M </li><li> Adicionar 5 mL de cloreto de lítio 4M </li><li> Adicionar 150 mL de etanol 100% gelado </li><li> Incubar a -80 ° C por 2 horas durante a noite </li><li> Centrifugar a 14.000 rpm por 30 minutos a 4 ° C, embora decante o sobrenadante </li><li> Pellet seco por 7 minutos </li><li> Re-suspender em 20 mL de água DEPC </li><li> Incubar a 37 ° C por 5 minutos </li></ol> Parte IV: Fracionamento - Executar apenas se o tamanho da sonda é superior a 0,6 kb (Tempo necessário: Varia com base no tamanho da sonda, geralmente não mais de 20 minutos) <ol><li> Em um microtubo de 1,5 mL, combine: <table border="1"><tbody><tr><td> RNA Probe </td><td> 20 mL </td></tr><tr><td> Água DEPC </td><td> 12 mL </td></tr><tr><td> Bicarbonato de sódio </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Carbonato de Sódio </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td></td><td> 40 mL </td></tr></tbody></table></li><li> Incubar em banho-maria a 60 ° C. O tempo de incubação de base na seguinte equação: Tempo (min.) = (partida kb - desejado kb) / (0,11 x de partida kb x desejado kb) Tamanho desejado média = 0,6 kb </li></ol> Parte V: Precipitação final (Tempo necessário: 5 minutes mais duas horas de incubação durante a noite, uma hora para outra centrífuga e re-suspender, 1 hora para eletroforese em gel) <ol><li> Adicionar 40 mL de água DEPC </li><li> Adicionar 8 mL de acetato de sódio </li><li> Adicionar 1,04 mL de ácido acético glacial </li><li> Adicionar 240 mL de gelo etanol frio a 100% </li><li> Incubar a -80 ° C por 2 horas durante a noite </li><li> Centrifugar a 14.000 rpm por 30 minutos a 4 ° C, embora decante o sobrenadante </li><li> Pellet seco por 7 minutos </li><li> Re-suspender em 20 mL de água DEPC </li><li> Vortex para misturar </li><li> Para verificar a presença de riboprobe, executar a solução re-suspensas em um gel corado 1% TAE com brometo de etídio </li></ol> 3. Monte todo Hibridização In Situ Parte I: A fixação de embriões e proteinase K Digestão (Tempo necessário: Fix horas durante a noite, mais 4 no dia seguinte para o armazenamento, 2,5 horas de armazenamento com a Parte II) <ol><li> Coletar embriões encenado zebrafish e corrigir em paraformaldeído 4% (PFA) durante a noite a 4 ° C </li><li> Lavar embriões fixados em tampão fosfato salina contendo 0,1% Tween-20 (PBST) 3 vezes por 10 minutos cada </li><li> Para garantir a exposição dos embriões aos reagentes experimental, embriões dechorionate manualmente (se necessário) usando uma pinça de ponta fina </li><li> Desidratar embriões por lavagem em uma série graduada de 25% e metanol 50% em PBST por uma hora cada lavagem, em seguida, armazenar em metanol 100% a -20 ° C </li><li> Quando estiver pronto para uso, reidratar embriões em PBST por lavagem em 50% (2 vezes) e 25% (1 vez) de metanol em PBST por 10 minutos cada. Finalmente, lavar 2 vezes durante 10 minutos cada, em PBST 100%. Momento exato não é importante para PBST / metanol lava </li><li> Bleach embriões em uma solução de peróxido de hidrogênio 10% em PBST, se necessário, para remover os pigmentos escuros. Embriões devem incubar em solução de peróxido de hidrogênio por 10-20 minutos, dependendo da idade do embrião, ea tampa do tubo de microcentrífuga deve permanecer aberta para evitar acumulação de pressão de ar </li><li> Embriões Digest com 50 mg / mL de Proteinase K diluído 1:5000 em PBST de 15/03 minutos, dependendo da idade do embrião </li><li> Re fix-embriões em PFA 4% por 30 minutos, e depois lave 3 vezes em PBST por 5 minutos cada </li></ol> Parte II: A hibridação de Riboprobes (Tempo necessário: 3 horas mais durante a noite para hibridação, 1,5 horas no dia seguinte com a Parte III) <ol start="9"><li> Prehybridize embriões com solução prehybridization (PHS), em pré-aquecido a 70 · Banho de água C por 2-3 horas </li><li> Remover PHS, adicionar 0,5 mL de solução de hibridização e 1,5 mL previamente sintetizado digoxigenina riboprobes rotulados, incubar a 70 ° C durante a noite. Temperatura poderá variar dentro de alguns graus, dependendo do alvo riboprobe </li><li> No dia seguinte, lave embriões a 70 ° C em soluções graduais de 75%, 50% e 25% PHS em citrato de sódio, solução salina 2X (SSC) por 10 minutos cada, em seguida, lave em 0,2 X SSC por 30 minutos a 68 ° C </li><li> Lavar em tampão de ácido maleico (MAB) 2 vezes por 10 minutos cada em temperatura ambiente </li></ol> Parte III: Anti-digoxigenina (DIG-α) Incubação de anticorpos (Tempo necessário: 3 horas mais durante a noite para bloco, 2,5 horas no dia seguinte com a Parte IV) <ol start="13"><li> Transferência de embriões para uma placa de 12 poços </li><li> Bloco pré-embriões em solução mL 1-2 bloqueio por pelo menos 3 horas à temperatura ambiente </li><li> Ao mesmo tempo, pré-bloco do anticorpo preparando um segundo volume de solução de bloqueio e diluindo o anticorpo anti-digoxigenina 1:2000 nesta solução </li><li> Remover pré-bloco e adicionar 1-2 mL de pré-bloqueados solução α-DIG, incubar overnight a 4 ° C </li><li> No dia seguinte, lave embriões no MAB. Permitir que os embriões para incubar no MAB por 5 minutos em primeiro lugar, em seguida, executar alterações no buffer e incubar por dois minutos 10, uma 30 minutos e um intervalo de 60 minutos. Momento exato não é necessário </li><li> Lavar embriões 3 vezes por 5 minutos cada em tampão Fosfatase Alcalina (AP) </li></ol> Parte IV: Coloração e Processamento Final (Tempo necessário: uma hora durante a noite para a coloração, dependendo da riboprobe usado, quatro horas para o início de lavagens glicerol, 10/06 horas por lavagem de glicerol, podem ser armazenados em glicerol) <ol start="19"><li> Adicione 1-2 mL de solução de coloração para os embriões, embrulhe a placa em papel alumínio, e verificar a coloração em intervalos regulares (a cada 20 minutos) até que a coloração é suficiente </li><li> Lavar embriões com PBST 2 vezes por 5 minutos cada um para parar a reação de coloração </li><li> Desidratar embriões usando 10 lavagens minutos em 25% (1 vez) e 50% (2 vezes) metanol em PBST, em seguida, em metanol 100%, para remover a coloração de fundo </li><li> Permitir que embriões para incubar em metanol 100% por pelo menos duas horas em temperatura ambiente </li><li> Reidratar em PBST com 10 lavagens minutos em 50% (2 vezes) e 25% (1 vez) de metanol em PBST, em seguida, lave em 100% PBST 2 vezes </li><li> Transferência e manchadambryos a uma solução de glicerol 80% em PBST, usando uma série graduada de lavagens, e armazenar a 4 ° C. </li></ol> Receitas: <ul><li> Placas-10 LB agar agar LB g + 250 mL de água destilada, autoclave, quando fria ao toque juntar 250 mL ampicilina, despeje solução mL 15-20 quente em cada placa de Petri, permitem ágar para solidificar </li><li> Caldo-12.5 LB caldo LB g + 200 mL de água destilada, autoclave, deixe esfriar antes de usar </li><li> 1% TAE gel-agarose 0,4 g, 40 mL TAE 1X, 2 mL de brometo de etídio; carga 7 (Transformação Plasmid do Target cDNA) plasmídeo mL ou 3 mL riboprobe e 4 mL de água DEPC (In situ DIG marcado Síntese Probe RNA) + um corante de carregamento mL, 5 mL escada de DNA </li><li> Formamida Prehybridization solução de 50%, SSC 5X, 9.2mm ácido cítrico, 1% Tween-20 </li><li> Solução de hibridização solução prehybridization-plus 500 mcg / mL tRNA e 50 mcg / mL de heparina </li><li> MAB-100mM ácido maleico, 150mm NaCl, NaOH 0,2 M, 0,1% Tween-20, pH para 7,5 </li><li> Bloqueando-Solução 3 partes MAB, 1 parte de 10% de reagente Boehringer bloqueio no MAB, uma parte do calor desativado cordeiro soro </li><li> AP-buffer 60mm pH Tris-HCl a 9,5, NaCl 60mm, 30mm MgCl 2, 0,1% Tween-20 </li><li> Solução-5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato de coloração (BCIP) e Nitro blue tetrazolium (NBT) em tampão AP </li></ul> 4. RESULTADOS REPRESENTANTE Quando realizada corretamente, a reação entre o NBT, BCIP, e fosfatase alcalina formará um precipitado roxo que deve aparecer no embrião do zebrafish como uma mancha roxa. Riboprobes deve ser previamente sintetizado a partir do cDNA correspondente ao gene de interesse. Portanto, pode-se concluir qualquer visualizadas mancha representa áreas do paulistinha em que o gene de interesse foi transcrita nessa fase especial de desenvolvimento. Para os fins deste curso, riboprobes foram sintetizados a partir aldh1a2 (anteriormente raldh2; Begemann et al, 2001;. Figura 1); fgf8a (Reifers et al, 1998;. Figura 2); deltaC (Oates et al, 2005.); myod1 (Weinberg et al, 1996.); shha (. Krauss et al, 1993), pax2a (Brand et al, 1996;. Figura 3) e myl7 (anteriormente cmlc2;. Yelon et al, 1999) cDNA. Coloração era esperado na linha média e em estruturas anatômicas, incluindo os somitos, tailbud, myotome, cérebro e coração. Mutantes Ace/fgf8a Esperava-se que têm defeitos em muitas destas estruturas. Coloração foi facilmente visualizado através de um microscópio padrão de dissecação. Fontes adicionais contêm mais informações e solução de problemas em WISH técnicas semelhantes às descritas aqui (Clark, 2003;. D&#39;Costa et al, 2009; Schmoldt et al, 2009;. Schoenwolf, 2009). <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Um embrião zebrafish 24 horas após a fecundação, que tem sido hibridizado com riboprobes específicas para aldh1a2. Coloração específica pode ser visto nos olhos, cérebro posterior, peitoral fin bud primórdios, e somitos. Anterior é para o topo, é posterior ao fundo. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Um embrião zebrafish na fase somito 13 de desenvolvimento que tem sido hibridizado com uma sonda específica para fgf8a. Coloração específica é visto no telencéfalo, diencéfalo dorsal, mesencéfalo rombencéfalo-limite, somitos, e tailbud. Ventral é para a esquerda, dorsal é para a direita. <img src="/files/ftp_upload/2533/2533fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. A 22 horas após a fecundação do embrião zebrafish que foi hibridizada com uma específica para riboprobe pax2a, um marcador robusto útil para visualizar o sistema nervoso. Coloração específica pode ser visto na fissura coróide, mesencéfalo rombencéfalo-limite, vesícula ótica, e os neurônios da medula espinhal. Vista dorsal, com anterior para a esquerda.

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	<li>Albertson, R. C., Yelick, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+for+fgf8+signaling+in+left-right+patterning+of+the+visceral+organs+and+craniofacial+skeleton.">Roles for fgf8 signaling in left-right patterning of the visceral organs and craniofacial skeleton.</a> Dev. Biol. 283, 310-321 (2005).</li><li>Aramaki, M., Kimura, T., Udaka, T., Kosaki, R., Mitsuhashi, T., Okada, Y., Takahashi, T., Kosaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+expression+profile+of+chicken+CHD7,+the+ortholog+of+the+causative+gene+for+CHARGE+syndrome.">Embryonic expression profile of chicken CHD7, the ortholog of the causative gene for CHARGE syndrome.</a> Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 79, 50-57 (2007).</li><li>Begemann, G., Schilling, T. F., Rauch, G. J., Geisler, R., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+neckless+mutation+reveals+a+requirement+for+raldh2+in+mesodermal+signals+that+pattern+the+hindbrain.">The zebrafish neckless mutation reveals a requirement for raldh2 in mesodermal signals that pattern the hindbrain.</a> Development. 128, 3081-3094 (2001).</li><li>Brand, M., Heisenberg, C. P., Jiang, Y. J., Beuchle, D., Lun, K., Furutani-Seiki, M., Granato, M., Haffter, P., Hammerschmidt, M., Kane, D. A., Kelsh, R. N., Mullins, M. C., Odenthal, J., van Eeden, F. J., Kane, D. A., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+zebrafish+genes+affecting+the+formation+of+the+boundary+between+midbrain+and+hindbrain.">Mutations in zebrafish genes affecting the formation of the boundary between midbrain and hindbrain.</a> Development. 123, 179-190 (1996).</li><li>Clark, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ Hybridization: Laboratory Companion. , (2003).</li><li>D'Costa, A., Shepherd, I. 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Não há conflitos de interesse declarados.

WISH foi usado em um comparativo curso de laboratório de Vertebrados Biologia para ajudar os alunos a compreender o papel da genética no desenvolvimento anatômico através da visualização dos padrões de expressão gênica conhecida. Para a primeira parte do curso, os alunos realizadas dissecções em organismos representando taxa chordate várias diferentes, permitindo-lhes tempo suficiente para estudar, compreender, comparar e anatomia de vertebrados contraste. Como uma introdução à segunda parte do curso, os alunos receberam uma palestra formal descrevendo o desenvolvimento zebrafish e anatomia. Os métodos e resultados esperados da experiência WISH também foram discutidas. Os alunos foram então dadas ao vivo em zebrafish somitogenesis e prim-6 estágios de desenvolvimento, e em 2 e 5 dias após a fertilização (DPF) para examinar sob o microscópio de dissecação. Isso era para dar aos alunos uma melhor compreensão do que embriões zebrafish aparência e os tipos de alterações morfológicas que ocorrem durante a ontogenia. Na sessão de laboratório próximo, os alunos receberam embriões zebrafish em que gostaria que tivesse sido previamente realizada. Eles foram convidados a estudar e descrever os padrões de expressão gênica para cada gene de interesse (riboprobe utilizado). Embriões utilizados para WISH foram derivadas de acasalamentos entre os membros de uma linha ace/fgf8a heterozigotos. Com base na herança mendeliana, 25% dos embriões dos acasalamentos ace/fgf8a deveriam ser mutantes homozigotos e exibir defeitos de muitas das estruturas anatômicas focada em neste curso. Com base em relatórios publicados e não publicados observações no laboratório Albertson, defeitos no cérebro e coração looping imprópria eram esperados, bem como defeitos na somitos (Brand et al, 1996;. Albertson e Yelick, 2005; observações pessoais). Os alunos foram convidados a examinar todas as amostras, de tipo selvagem (animais heterozigotos são indistinguíveis dos irmãos do tipo selvagem nos estágios iniciais de desenvolvimento) e os mutantes homozigotos, para cada padrão de expressão gênica apresentada. Eles foram, então, convidado a escrever relatórios de laboratório descrevendo seus resultados, e com base em seus conhecimentos de anatomia e genética, como a expressão do gene defeituoso pode ter precipitado malformações anatômicas. Alunos pareciam receber este exercício de laboratório com entusiasmo e curiosidade. A maioria nunca tinha usado antes e WISH estavam extremamente interessados ​​nesta parte do curso. Alunos encontraram os diferentes padrões de expressão gênica em embriões do zebrafish intrigante, alguns até mesmo descrito o padrão de coloração visualizado por associá-las com o bem conhecido desenhos e símbolos, como um rosto sorridente. Os relatórios de laboratório resultantes mostraram que os alunos tinham um entendimento geral do protocolo WISH ea expressão de genes específicos em estruturas anatômicas. Os estudantes também foram obrigados a entender as funções específicas dos genes estudados utilizando WISH durante o (Stickney et al, 2000 laboratório;. Huelsken et al, 2002;. Geetha-Loganathan et al, 2008a;.. Geetha-Loganathan et al, 2008b ). Era evidente no entanto, que alguns alunos tiveram conhecimento de fundo limitado das vias de sinalização e genes de interesse. Mais informações sobre esses conceitos no WISH aula introdutória pode ser uma adição bem-vinda ao uso de WISH, no futuro, cursos de Biologia Comparada de Vertebrados. Desde o protocolo geralmente leva quatro dias consecutivos, dependendo do horário do curso, os alunos só poderão ser capaz de completar uma parte da experiência em sala de aula eo professor deve ser responsável pelo restante. Em nossa classe da Biologia Comparada de Vertebrados, os alunos completaram a coloração reações em laboratório, enquanto o Assistente de Ensino realizou todas as etapas anteriores. Se é preferível que os alunos realizam WISH em sala de aula, o protocolo pode ser dividida em subunidades que podem ser realizadas em sessões de laboratório vários, dependendo do tempo da classe. Se não é viável para os alunos a realizar todo o protocolo, como foi aqui devido à reunião de laboratório apenas uma vez por semana, os alunos podem adicionar a solução de coloração no início da classe e, dependendo do riboprobe usado, tem a coloração completa dentro de uma hora. O tempo que leva para a mancha de desenvolver varia muito com cada riboprobe e uma variedade de condições experimentais, e deve ser determinado antes da aula. Nomeadamente, se os alunos só será desenvolver a mancha no laboratório, os instrutores serão responsáveis ​​por todas as etapas anteriores, o que exigirá tempo e esforços significativos fora da sala de aula. Se desejar, uma alternativa mais curta a WISH poderia ser imuno-histoquímica, utilizando rótulos de anticorpos para visualizar localização de proteínas, no entanto, neste momento, zebrafish anticorpos específicos para os genes de desenvolvimento não estão prontamente disponíveis. Outra opção seria realizar WISH em diferentes espécies de vertebrados umand que os alunos comparar os padrões de expressão dos mesmos genes em diferentes organismos (Pizard et al, 2004;. Aramaki et al, 2007;. organismos modelo Emergentes, 2008; Organismos modelo emergente, 2010). O objetivo maior do uso de WISH em um curso de Biologia Comparada de Vertebrados foi demonstrar aos alunos como técnicas da biologia molecular são utilizados para estudar o desenvolvimento anatômico. Ele também proporcionou uma oportunidade para os alunos a especular sobre a forma como alterou a expressão do gene pode conduzir não só a malformações do desenvolvimento, mas também à mudança evolutiva. Formalizado como biologia evolutiva do desenvolvimento (muitas vezes referida como &quot;evo-devo&quot;), este campo de rápido crescimento de estudo pretende ligar o genótipo eo fenótipo através do desenvolvimento, e para elucidar bases mecanicistas potencial de mudança evolutiva. Com a ascensão deste campo, os ecologistas mais, os biólogos do organismo, e fisiologistas estão empregando técnicas moleculares em suas pesquisas. Defendemos que o uso de WISH em um curso de Biologia Comparada de Vertebrados ajudará a manter o currículo atualizado com atuais avanços tecnológicos e conceituais na pesquisa, e para facilitar um melhor alinhamento horizontal dos cursos de biologia de nível superior, combinando subcampos biológica. Além disso, esta abordagem integrativa irá proporcionar aos alunos a oportunidade de aprender uma variedade de técnicas de pesquisa biológica em um curso, levando a uma educação mais diversificada e a promoção da investigação interdisciplinar futuro científico.

<ul><li> Autoclave </li><li> Micro-centrífuga </li><li> 37 ° C incubadora (com agitador) </li><li> 4 ° C micro-centrífuga </li><li> Banho de água </li><li> Vórtice </li><li> Aparelho de eletroforese em gel </li><li> -20 ° C freezer </li><li> -80 ° C freezer </li><li> Rocker / shaker </li><li> 4 ° C geladeira </li><li> Microscópio de dissecação (de preferência com uma tela de ensino ou da câmera) </li></ul>

using whole mount in situ hybridization to link molecular and organismal biology

Montar toda a hibridização in situ (WISH) é uma técnica comum em laboratórios de biologia molecular utilizadas para estudar a expressão do gene através da localização de transcrições de mRNA específicos dentro espécime montar todo. Esta técnica (adaptado de Albertson e Yelick, 2005) foi usado em um nível superior de graduação comparativa sala de aula Vertebrados laboratório de Biologia da Universidade de Syracuse. Os primeiros dois terços do comparativo de laboratório do curso de Vertebrados Biologia deram aos alunos a oportunidade de estudar a embriologia e anatomia dos diversos organismos que representam taxa chordate vários principalmente através dissecções tradicionais eo uso de modelos. A parte final do curso envolveu uma abordagem inovadora para ensinar anatomia através da observação do desenvolvimento dos vertebrados empregando técnicas moleculares em que WISH foi realizada em embriões do zebrafish. Um fator de crescimento de fibroblastos heterozigotos 8-A (fgf8a) linhagem mutante, ace, foi usado. Devido à herança mendeliana, ás intercrosses produzida tipo selvagem, heterozigoto, e os mutantes homozigotos ace/fgf8a em uma proporção de 01:02:01. Sondas de RNA com padrões de expressão conhecida na linha média e no desenvolvimento de estruturas anatômicas, como o coração, somitos, tailbud, miótomo e cérebro foram utilizados. WISH foi realizada utilizando zebrafish no somito 13 e prim-6 etapas, com os alunos realizar a reação de coloração em sala de aula. O estudo de embriões zebrafish em diferentes estágios de desenvolvimento deram aos alunos a capacidade de observar como estas estruturas anatômicas mudado ao longo da ontogenia. Além disso, alguns mutantes ace/fgf8a exibido looping coração imprópria, e defeitos em somito e desenvolvimento do cérebro. Os alunos neste laboratório observou o desenvolvimento normal de vários sistemas do órgão usando tanto a anatomia externa, bem como padrões de expressão gênica. Eles também identificaram e descreveram embriões exibindo desenvolvimento anatômico inadequado e de expressão gênica (ie, os mutantes putativos). Para instrutores em instituições que ainda não possuem o equipamento necessário ou onde os fundos de laboratório e de inovação curricular são limitados, o custo financeiro dos reagentes e aparelhos pode ser um fator a considerar, assim como o tempo eo esforço necessário por parte do instrutor, independentemente da configuração. No entanto, sustentamos que o uso de WISH neste tipo de ambiente de laboratório em sala de aula pode proporcionar uma importante ligação entre a genética do desenvolvimento e anatomia. Com o avanço da tecnologia ea capacidade de estudar o desenvolvimento do organismo em nível molecular se torna mais fácil, mais barato e cada vez mais popular, muitos biólogos evolutivos, ecologistas e fisiologistas estão se voltando para estratégias de pesquisa no campo da biologia molecular. Usando WISH em um comparativo de sala de aula de laboratório de Vertebrados Biologia é um exemplo de como as moléculas e anatomia podem convergir em um único curso. Isso dá a estudantes universitários de nível superior a oportunidade de praticar as modernas técnicas de pesquisa biológica, levando a uma educação mais diversificada e a promoção da investigação interdisciplinar futuro científico.

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Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Montar toda<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação (WISH) foi utilizado em um curso superior de Biologia Comparada de Vertebrados nível de graduação, além de vertebrados dissecções. Isso deu aos alunos a oportunidade de estudar padrões de expressão gênica, bem como anatomia, ligando o estudo da biologia molecular e do organismo dentro de um curso.

Usando Monte Whole In situ Hibridação a ligação de Biologia Molecular e Organísmicos

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

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Biology

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

21.5K visualizações.  Syracuse University. Montar toda In situ Hibridação (WISH) foi utilizado em um curso superior de Biologia Comparada de Vertebrados nível de graduação, além de vertebrados dissecções. Isso deu aos alunos a oportunidade de estudar padrões de expressão gênica, bem como anatomia, ligando o estudo da biologia molecular e do organismo dentro de um curso.

Vídeo: Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biologia

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Método para coloração Whole Mount anticorpos em Pintainho

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish Whole Mount Alta Resolução Duplo Fluorescente In Situ Hibridização

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Monte todo In Situ Hibridação de E8.5 de Embriões E11.5 rato

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

Alta capacidade mapeamento físico de cromossomos usando Automated<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Tempo cromossomo Replicando Combinado com Fluorescente<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Todo o Monte RNA Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; A hibridação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridação em embriões de Mount inteiros e histologia de células Adaptado para Elasmobrânquios Marinhos

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Alta resolução Monte Whole<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização dentro embriões Zebrafish para estudar a expressão gênica e função

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...