Gostaria de agradecer os muitos estudantes de graduação que tenham trabalhado em meu laboratório e contribuiu para a evolução destes protocolos. NAT recebeu o apoio da Rede Skidmore-União, um projeto criado com um avanço de NSF PAGO subvenção.

I. Mount RNA Total de hibridação in situ em Elasmobranchs Marinhas 1. Fixação embrião e Preparação <ol><li> Embriões de skate pode ser encenado de acordo com Ballard 7. Fases óptimas para a detecção da expressão do gene depende do tecido de interesse. Para acompanhar a expressão do gene no trato digestivo de skate, 27-30 estágios são óptimas 7. </li><li> Dissecar embriões em PBS, separando os embriões a partir do saco vitelino. </li><li> Fixar em 30 ml de frescos paraformaldeído a 4% (PFA) em um tubo cónico de 50 ml, a 4 ° C com agitação suave. Correção para 24 horas. </li><li> Lavar os embriões em PBT, por duas vezes, durante 15 min, à temperatura ambiente, rotação. Todas as receitas de solução para a montagem de todo o RNA in situ &#39;s são incluídos (Tabela 1). </li><li> Desidratar embriões por lavagem de uma série de metanol de 25%, 50% e 75% de metanol: PBT oscilante à temperatura ambiente. A duração das lavagens depende da fase dos embriões. Para pré-neurulation encenado embriões, 5 min de cada lavagem da série metanol é suficiente. Para embriões com mais de 30 fases, lavagens pode durar até 30 minutos. Para determinar se os embriões são suficientemente penetrada e aclimatados a cada lavagem, mantenha o tubo na posição vertical na sua mão. Se os embriões vão para o fundo do tubo, então você está pronto para a próxima lavagem. Se os embriões flutuar para o topo da solução, mudar a solução e repetir esse passo particular desidratação. </li><li> Lavar duas vezes em metanol a 100% durante 10 min suavemente balanço. </li><li> Uma vez desidratado à solução de metanol a 100%, os embriões devem ser armazenadas a -20 ° C durante pelo menos 24 horas antes de prosseguir com o protocolo. Os embriões foram sucesso armazenado a -20 ° C e utilizada para montagens inteiras de RNA durante até 1 ano. </li></ol> 2. Síntese de RNA Probe <ol><li> Gerar um fragmento linear do gene cuja expressão que você deseja detectar. Isto pode ser feito quer através de amplificação por PCR ou linearizar o plasmídeo com um gene suade interesse. Para amplificar por PCR, escolher primers cujos locais de ligação do flanco do gene inserir e reter sítios de ligação da polimerase de RNA na região amplificada. Para os plasmídeos geralmente utilizados, tais como pBS ou pGEM, para a frente M15 e iniciadores inversos são ideais. Alternativamente, um plasmídeo linearizado por digestão de 15 ul de ADN de miniprep QIAGEN com uma enzima que cliva a extremidade 5 &#39;do gene. Extrair e purificar em gel utilizando o kit QIAquick apropriado. </li><li> A transcrição reversa do RNA a sonda com 8 ul de plasmídeo ou 100 ng de produto de PCR linear como um molde utilizando a polimerase de ARN adequado (ver Quadro 2 para a reacção de transcrição). </li><li> Incubar reacção de transcrição reversa, durante 2 horas a 37 ° C. </li><li> Para confirmar a reacção, correr 1 ul de reacção de transcrição em um gel de agarose a 1% / TAE. Executar gel a 100 mVolts até que o corante tem apenas correr no gel. Uma única banda de destaque deve ser visível. O fragmento linear de ADN molde pode ser fracamente visíveis em maior molecuLar de peso. </li><li> Adicionar 1 ml de RNAse-livre de DNAse I à reacção de transcrição e incubar a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Para precipitado, adicionar 100 ul de TE, pH 8, 10 uL de 4 M de LiCl, 300 ul de EtOH a 100% e incubado a -20 ° C durante pelo menos 60 minutos ou durante a noite. </li><li> Centrifugação durante 10 min a 4 ° C uma microcentrífuga a 14000 rpm. </li><li> Lavar pellet com 70% de EtOH e secar ao ar. </li><li> Ressuspender RNA sonda em 20 l de dH 2 O. Adicionar 80 ul de tampão de hibridação (tampão de hibridação deve ser pré-aquecido a 70 ° C). A sonda pode ser armazenado em tampão de hibridação de 80% durante vários meses à temperatura de -20 ° C ou mais, à temperatura de -80 ° C. </li></ol> 3. Embrião pré-tratamento e Hibridação <ol><li> Remover embriões armazenados em metanol a 100% a partir de -20 ° C. Para os embriões jovens prosseguir com a etapa (3.2). Para mais tarde encenado embriões (fase 29/30 &lt;), você pode ver uma camada da epiderme que &#39;levantou&#39; fora do corpo do embrião. Sob o microscópio, cuidadosamente chatearect fora a camada epidérmica para maximizar a penetração da sonda. </li><li> Embriões coloque em frascos de cintilação limpa vidro. Reidratar os embriões na série metanol reversa descrito acima: (75%, 50%, 25% de metanol: PBT) por balançar suavemente cada solução para 5-30 min cada, à temperatura ambiente. Reidratação completa com duas lavagens de PBT de 10 min cada, balançando suavemente. </li><li> Para remover qualquer pigmento, os embriões de branqueamento com peróxido de hidrogénio a 6% em PBT durante 1 hora à temperatura ambiente, agitando. </li><li> Remover o peróxido de hidrogénio através de lavagem por três vezes em PBT, (agitando à temperatura ambiente, 10 min cada). </li><li> Tratar embriões com proteinase K para permitir a penetração da sonda durante a hibridação. A quantidade de proteinase K e a duração do tratamento depende do tecido que pretende examinar e a idade do embrião. Tecido mais superficial e embriões menores exigem K mais curta e menos proteinase, enquanto que os tecidos mais profundos e os embriões mais velhos exigem uma concentração mais elevada e maior tempo de tratamento time para a plena permeabilizar o embrião para a hibridização da sonda. Por exemplo, para detectar Shh no endoderma visceral de embriões em estágio 29 do patim, 30 ug / ml de proteinase K / PBT é incubada durante 20 min à temperatura ambiente. </li><li> Rapidamente lavar embriões em PBT para lavar proteinase K. </li><li> Para desactivar proteinase K, embriões postfix com 4% PFA, glutaraldeído a 0,2% em PBT durante 20 min, agitando suavemente. </li><li> Lavar duas vezes durante 10 min com PBT. </li><li><ol class="lalpha"><li> Para pré-hibridização, adicionar 2-3 ml de pré-aquecido solução de hibridização para os embriões, apenas o suficiente para cobri-los. Agitar suavemente num banho de água aquecida a 70 ° C durante 1 h. </li><li> Para preparar a solução de hibridização, de pré-aquecimento da sonda de ARN a 70 ° C durante 10 min e arrefecer em gelo. Diluir ul 15-20 de sonda de ARN de 2 ml de solução de hibridação fresco pré-aquecido, para obter uma concentração final de 0,5-1,0 ug / ml. Remover pré-hybe e adicionar sonda de RNA diluído para embriões. Embriões devem ser cobertos por apenas uma solução, umadd solução de hibridação mais se necessário. Tampa firmemente seguro do frasco de cintilação. Hibridizar balançando suavemente num banho de água aquecida a 70 ° C durante a noite. </li></ol></li></ol> 4. Mensagem lavagens de hibridação e hibridação Antibody <ol><li> Remover a solução de hibridação com a sonda a partir de embriões e colocar num frasco de cintilação de fresco ou o tubo de Eppendorf. A sonda pode ser armazenada a -20 ° C e reutilizada no futuro. Para pós-hibridação lavagens, embriões colocar num NetWell sentado numa placa de cultura de tecidos de 6 poços. </li><li> Lavar 3 vezes durante 30 min em cada pré-aquecido Solução # 1, agitando a 70 ° C. </li><li> Lavar 3 vezes durante 30 min em cada pré-aquecido Solução # 2, agitando a 70 ° C. </li><li> Lavar 3 vezes durante 5 min cada em TBST, balançando a temperatura ambiente. </li><li> Pré-bloqueio com soro de ovelha a 10% inactivado pelo calor, em TBST durante 1 hora, agitando à temperatura ambiente. </li><li> Transferir embriões de NetWell para um frasco de vidro de cintilação fresco. Adicionar anti-DIGFragmentos Fab (1:5000) no soro de ovelha 1% inactivado pelo calor / TBST de embriões. Agitar durante a noite a 4 ° C. </li></ol> 5. Hibridação de anticorpos pós Lava <ol><li> Remover o anticorpo e descarte. Embriões lugar de volta em NetWell para lavagens. </li><li> Lavar 3 vezes durante 5 min cada em TBST, agitando à temperatura ambiente </li><li> Lavar pelo menos 6 vezes, durante 1 h cada, agitando à temperatura ambiente. </li><li> Lavar durante a noite em TBST, agitando a 4 ° C. À medida que as lavagens de anticorpos pós ajudar a reduzir a coloração de fundo, a maximização do número e da duração da lavagem é preferível. Os embriões são rotineiramente lavados em TBST, a 4 ° C, durante o fim de semana. </li></ol> 6. Detecção de Sonda <ol><li> Maquiagem solução NTMT fresco e filtrar esterilizar. </li><li> Rejeitar a solução TBST lavagem e embriões lugar em um frasco de vidro limpo de cintilação. Lavar 3 vezes em embriões NTMT fresco durante 10 minutos cada, à temperatura ambiente, de balanço. </li><li> Remover NTMT lavar e adicionar mistura de reaçãode 1 x NBT / BCIP de 1 x NTMT. Uma vez que estes reagentes são sensíveis a luz, frasco de cintilação de cobertura em folha de rocha e à temperatura ambiente. </li><li> Monitorar reacção de cor a cada 15 minutos até que a expressão do gene desejado é claramente visível. Sondas fortes podem demorar tão pouco como 10 minutos para se desenvolver. Sondas fracos pode levar 1-2 horas. Não deixe reação ir por muito tempo ou coloração de fundo vão começar a aparecer (o embrião inteiro começa a virar uma cor maçante roxo ou marrom). </li><li> Lavar 2 vezes durante 10 minutos cada em PBT, à temperatura ambiente, de balanço. </li><li> Embriões Postfix em paraformaldeído a 4%, glutaraldeído a 0,1% durante 1 hora à temperatura ambiente. Os embriões podem ser indefinidamente loja em fixador, a 4 ° C. </li><li> Visualize embriões com um estereomicroscópio de dissecação. Para produzir um fundo azul claro para fotos, embriões lugar em um prato com pré-endurecido de agarose 1% / PBS. </li></ol> 7. Os resultados representativos para I. Mount RNA Total de hibridação in situ em elasmobrânquios marinhos RNA montagem inteira in situ A expressão de descrever de Sonic hedgehog (Shh) e Hoxa13 em embriões de skate são mostrados na Figura 1. A expressão de Shh em vertebrados superiores é encontrado no endoderma notocorda e intestino e este padrão de expressão é conservada no patim (Figura 1a) 8,9. Elasmobrânquios marinhos têm um único método de regulação osmótica que usa a glândula rectal para sais secretam. Hoxa13 expressão é elevada na glândula desenvolvimento rectal (Figura 1b) 10. Hoxa13 papel produto do gene na padronização da glândula retal permanece desconhecida. II. Inclusão em parafina e Seccionamento Tissue Elasmobranch 1. Colheita e preparação do tecido <ol><li> Dissecar tecido desejado e fixar em formol 10% por 24-48 horas, balançando a temperatura ambiente. Paraformaldeído a 4% (PFA) pode também ser usado como um fixador(Ver discussão). </li><li> Lavar a fixador de lavagem em PBS, três vezes, durante 30 minutos cada. Dependendo do tamanho do tecido, os tempos de lavagem pode ser diminuído para 10 min ou aumentada para 1 hr. </li><li> Desidratar embriões por lavagem através de uma série de etanol a 25%, 50% e 75% de etanol: PBS de balanço à temperatura ambiente. Mais uma vez, o tempo para cada lavagem dependerá do tamanho do tecido. Por 0,5 cm 3 de tecido, incubar cada lavagem durante 15 min. Aumentar o tempo de pedaços maiores. Se o armazenamento a longo prazo do tecido é desejada, um adicional de lavar duas vezes em etanol a 75% e armazenar a -20 ° C durante até um ano. Caso contrário, prossiga para a próxima etapa. </li><li> Além disso desidratar por lavagem 3 vezes em etanol a 100% durante 15 minutos cada, agitando. </li></ol> 2. Inclusão em parafina e Seccionamento <ol><li> Esclarecer tecido por lavagem duas vezes em xilol durante 5 minutos cada em frascos de vidro com tampas de cintilação com tampa de rosca. Xileno tornará o tecido frágil, portanto, não exceder um total de 10 minutos para sehes. O tecido deve olhar translúcido quando você segurá-la contra a luz. Se o tecido é ainda muito opaco após duas lavagens, fazer uma lavagem adicional em xileno durante 5 minutos e, em seguida, continuar com o protocolo. Apenas lidar com xileno dentro de uma capela com luvas. </li><li> Remover xileno e preencher o frasco de cintilação 2/3 cheio com parafina derretida. Incubar em forno a 60 ° C durante 30 min. Ao colocar parafina no frasco, você vai notar a parafina solidificar ao longo das laterais do frasco. Colocar o frasco no forno e permite a parafina para re-dissolver-se durante alguns minutos. Tomar o frasco para fora do forno e dar a solução de um redemoinho para misturar rápida e substitua no forno por resto de incubação. </li><li> Parafina Repeat incubações mais duas vezes durante 30 min. </li><li> Incubar em parafina duas vezes por uma hora cada. Parafina alterar uma última vez e incubar durante a noite nos 60 ° C forno. </li><li> No dia seguinte, colocar o tecido em uma câmara aquecida e banho de parafina se sob vácuo durante 2-3 hr. Isto irá facilitar a infiltração de parafina para o tecido e remover quaisquer bolhas de ar. Para alguns tipos de tecido magro, de um passo de vácuo pode não ser necessária, mas é necessário que os embriões inteiros ou do tracto digestivo e outros órgãos com compartimentos luminais. </li><li> Após vácuo facilitada a infiltração de tecido tecido local, num molde de metal com parafina fundida e arrefecer sobre uma placa de gelo. Deixar em gelo ou a 4 ° C durante a noite, antes de tentar remover o tecido a partir do molde. Os blocos de parafina do tecido pode ser armazenado indefinidamente a 4 ° C. </li><li> Colocar o bloco de parafina em um micrótomo e cortar 8 seções jam. Secções deve ser lançada sobre um banho de água aquecida a 48 ° C e montados em lâminas de vidro SuperFrost * Plus. </li><li> Lâminas secas durante a noite num forno de 37 ° C. </li><li> Secções armazenar a 4 ° C até ser necessário. </li></ol> III. Alcian Blue / Red Rápido Nuclear mancha de tecido Elasmobranch 1. Alcian Blue Stain para mucinas <ol><li> Lugar desliza com seções voltadas para cima em um aquecedor de slides. Derreter durante 45 min. </li><li> Lugar desliza em um suporte de slides. Todas as soluções conseqüentes estão contidas em banheiras dentro de uma capela. As lâminas são lavadas por transferi-los de uma cuba com uma solução para o outro. Certifique-se de que os níveis de solução nas banheiras de cobre os slides, os tecidos dos slides são completamente submerso. Dissolver parafina por lavagem 2 vezes as lâminas em xileno durante 5 minutos cada. </li><li> Lavar as lâminas duas vezes com etanol a 100% durante 1 minuto cada. </li><li> Rehidratar as lâminas em uma série de etanol (75%, 50%, etanol a 25%) de lavagem em cada solução durante 1 min. Lave em dH2O durante 1 min. </li><li> Mancha de solução de azul Alcian, pH 2,5, durante 15 min. </li><li> Desenvolver a mancha de lavagem em água corrente durante 3 min. Mergulhe de vez em dH 2 O. </li><li> Contracoloração em solução contracoloração Nuclear Fast Red, durante 10 min. </li><li> Lavar em água corrente durante 3 minutos e mergulhe em dH2O uma vez. </li><li> Desidrataçãodrate em séries de etanol (25%, 50%, 75%, 100%, 100%), durante 20 depressões cada, ou 1 min cada. Lavar duas vezes em xilol durante 5 minutos cada. Monte com DPX meio de montagem e lamínulas. Permitir a montagem de médio a seco e endurecer por 48 horas na capela antes de manipular slides. </li></ol>

<ol>
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W., Mellinger, J., Lechenault, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+for+development+of+Scyliorhinus+canicula,+the+lesser+spotted+dogfish+(Chondrichthyes;+Scyliorhinidae).">A series of normal stages for development of Scyliorhinus canicula, the lesser spotted dogfish (Chondrichthyes; Scyliorhinidae).</a> J. Exp. Zool. 267, 318-336 (1993).</li><li>Echelard, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog,+a+member+of+a+family+of+putative+signaling+molecules,+is+implicated+in+the+regulation+of+CNS+polarity.">Sonic hedgehog, a member of a family of putative signaling molecules, is implicated in the regulation of CNS polarity.</a> Cell. 75, 1417-1430 (1993).</li><li>Riddle, R. D., Johnson, R. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+7.">Ch. 7.</a> Molecular Cloning; A Laboratory Manual. 1, 7.82 (2001).</li><li>Zhang, G., Miyamoto, M. M., Cohn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamprey+type+II+collagen+and+Sox9+reveal+an+ancient+origin+of+the+vertebrate+collagenous+skeleton.">Lamprey type II collagen and Sox9 reveal an ancient origin of the vertebrate collagenous skeleton.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3180-3185 (2006).</li><li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Theory and practice of histotechnology. , (1980).</li><li>Theodosiou, N. 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Eu não tenho nada para divulgar.

Os protocolos apresentados são os métodos clássicos para monitorar a expressão de genes e identificação de tipos de células diferenciadas, e têm sido adaptadas para utilização em elasmobrânquios marinhos. Outras modificações destes protocolos pode ser necessária para se adaptar a diferentes espécies de elasmobrânquios. A preocupação mais comum em relação a todo o RNA mount in situ &#39;s é o risco de contaminação por RNase e assim a degradação da sonda de RN...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 x transcription buffer</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11-465-384-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DIG-RNA labeling mix</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11-277-073-910</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNAse inhibitor</td>
 <td>Roche</td>
 <td>03-335-399-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNA polymerase - SP6</td>
 <td>Roche</td>
 <td>10-810-274-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNAseI, RNAse-free </td>
 <td>Roche</td>
 <td>10-776-785-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Yeast RNA</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15401-029</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>EMD-Millipore</td>
 <td>220201</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>heparin</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H4784</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEPC (diethyl pyrocarbonate)</td>
 <td>Research Organics</td>
 <td>2106D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Moria Perforated Spoon</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>10370-17</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Netwell inserts</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>64713-00</td>
 <td>Netwells for use in 6-well tissue culture dishes</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-well tissue culture plate</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass scintillation vials with screw-cap lids</td>
 <td>Weaton Science Products</td>
 <td>986540</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>formamide</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP227500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Proteinase K</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>59895 (AM2542)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NBT</td>
 <td></td>
 <td>11585029001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BCIP</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11585002001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrogen peroxide, 30%</td>
 <td>EMD</td>
 <td>HX0635-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sheep serum</td>
 <td>VWR</td>
 <td>101301-478</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>glutaraldehyde</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G5882</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>tRNA</td>
 <td>Roche</td>
 <td>10-109-541-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-DIG Fab Fragments</td>
 <td>Roche</td>
 <td>1137-6623</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>26323-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclear Fast Red</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>26078-05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DPX Mountant</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>13510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraffin (Paraplast X-tra)</td>
 <td>McCormick Scientific</td>
 <td>39503002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10% Formalin, NBF</td>
 <td>VWR</td>
 <td>95042-908</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass scintillation vials with screw-cap lids</td>
 <td>Weaton Science Products</td>
 <td>986540</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stainless steal base molds</td>
 <td>Tissue-Tek</td>
 <td>4161-4165</td>
 <td>Multiple sizes available.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cassettes </td>
 <td>Tissue-Tek</td>
 <td>4170</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Slide warmer</td>
 <td>Fisher-Scientific</td>
 <td>12-594Q</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue Embedder</td>
 <td>Leica Microsystems</td>
 <td>EG1160</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microtome, rotary</td>
 <td>Leica Microsystems</td>
 <td>RM2235</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue-Tek Slide Staining Set</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>62540-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue-Tek 24-Slide Holder</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>62543-06</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Superfrost*Plus slides</td>
 <td>Fisherbrand</td>
 <td>12-550-17</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

rna in situ hybridization in whole mount embryos and cell histology adapted for marine elasmobranchs

Elasmobrânquios marinhos são avaliados modelos animais para estudos biomédicos e genômica, como eles são os vertebrados mais primitivos para ter imunidade adaptativa e ter mecanismos exclusivos para osmorregulação 1-3. Como as mais primitivas de vida mandibulados-vertebrados com apêndices pareados, elasmobrânquios são um modelo evolutivo importante, especialmente para estudos em evolução e desenvolvimento. Elasmobrânquios marinhos também têm sido utilizados para estudar toxicologia aquática e fisiologia stress em relação a 4 alterações climáticas. Assim, o desenvolvimento e adaptação de metodologias é necessário para facilitar e ampliar o uso destes vertebrados primitivos para várias disciplinas biológicas. Aqui I apresentam a capacidade de adaptação do RNA montagem inteira de hibridação in situ e de técnicas histológicas para estudar a expressão do gene e histologia de células em elasmobrânquios. Monitorando a expressão do gene é uma ferramenta de cunho biol desenvolvimentoogists, e é amplamente utilizada para investigar os processos de desenvolvimento 5. RNA montagem inteira de hibridação in situ, permite uma visualização e localização de transcritos de genes específicos nos tecidos do embrião em desenvolvimento. O padrão de expressão da mensagem de um gene pode fornecer uma visão do que os processos de desenvolvimento e decisões destino da célula um gene pode controlar. , Comparando o padrão de expressão de um gene em diferentes fases de desenvolvimento, a percepção pode ser adquirida na forma de um papel a alterações dos genes durante o desenvolvimento. Enquanto todo montagem in situ &#39;s fornece um meio para localizar a expressão do gene ao tecido, técnicas histológicas permitir a identificação de tipos de células diferenciadas e de tecidos. Manchas histológico têm funções variadas. Manchas gerais são utilizadas para realçar a morfologia das células, por exemplo, hematoxilina e eosina para corar geral dos núcleos e do citoplasma, respectivamente. Outras manchas podem destacar célula específicatipos. Por exemplo, o azul alcian mancha relatado no presente artigo é uma mancha amplamente utilizado para identificar mucosaccharides catiônica. A coloração do tracto digestivo com alcian azul pode identificar a distribuição de células caliciformes produtoras de mucosaccharides. Variações na constituintes mucosaccharide em péptidos curtos distinguir células caliciformes por função dentro do tracto digestivo 6. Usando RNA montagem inteira métodos in situ &#39;s e histoquímicas simultaneamente, as decisões do destino das células pode ser ligado ao gene a expressão específica. Apesar de RNA in situ &#39;s e histoquímica são amplamente utilizados por pesquisadores, sua adaptação e utilização em elasmobrânquios marinhos encontraram sucesso limitado e variada. Aqui eu apresento protocolos desenvolvidos para elasmobrânquios e usado em uma base regular em meu laboratório. Embora a modificação adicional do RNA in situ o método de hibridação pode ser necessária para se adaptar a diferentes espécies, os protocolos aqui descritos provide um forte ponto de partida para pesquisadores que querem adaptar o uso de elasmobrânquios marinhos para suas investigações científicas.

Exemplos de coloração com azul de alcian em diferentes regiões do L. trato digestivo erinacea são mostrados na Figura 2. Mucina ácida contendo células globlet são claramente visíveis pelo alcian azul mancha ao longo do trato digestivo. A distribuição das mucinas ácidas difere em diferentes regiões do tracto digestivo, o que reflecte diferenças na função. Mucinas ácidas são escassamente produzido no intestino e cloaca espiral, enquanto que uma alta concentração de muc...

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RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Através da combinação de métodos para a montagem de toda RNA<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação e histologia, a expressão do gene pode estar relacionada com as decisões celulares destino no embrião em desenvolvimento. Estes métodos têm sido adaptados para elasmobrânquios marinhos e facilitar o uso desses animais como organismos-modelo para estudos de toxicologia, biomédicas e comparativo.

RNA<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridação em embriões de Mount inteiros e histologia de células Adaptado para Elasmobrânquios Marinhos

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

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Research

JoVE Journal

Biology

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

12.6K visualizações.  Union College. Através da combinação de métodos para a montagem de toda RNA In situ Hibridação e histologia, a expressão do gene pode estar relacionada com as decisões celulares destino no embrião em desenvolvimento. Estes métodos têm sido adaptados para elasmobrânquios marinhos e facilitar o uso desses animais como organismos-modelo para estudos de toxicologia, biomédicas e comparativo.

Vídeo: RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biologia

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Método para coloração Whole Mount anticorpos em Pintainho

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish Whole Mount Alta Resolução Duplo Fluorescente In Situ Hibridização

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

Usando Monte Whole In situ Hibridação a ligação de Biologia Molecular e Organísmicos

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Monte todo In Situ Hibridação de E8.5 de Embriões E11.5 rato

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Detecção de RNA viral por fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Análise de uma única célula de transcrição do gene pela RNA Fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridização (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Todo o Monte RNA Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; A hibridação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Alta resolução Monte Whole<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização dentro embriões Zebrafish para estudar a expressão gênica e função

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...

Methods Article

RNA