Este trabalho foi parcialmente financiado através do financiamento para a RAW a partir de cada um dos seguintes: NIH concede K01 DK083512, DP2 OD008470 e R01 DK100237; March of Dimes Basil O&#39;Connor Iniciado Scholar concessão de uma subvenção n º 5-FY12-75; arranque fundos da Universidade de Notre Dame Faculdade de Ciências e Departamento de Ciências Biológicas. Gostaríamos especialmente de agradecer Elizabeth e Michael Gallagher, junto com toda a família Gallagher, que concedeu uma generosa doação para a Universidade de Notre Dame para promover investigação em células estaminais. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Agradecemos aos funcionários do Departamento de Ciências Biológicas, pelo seu apoio, e do Centro de Pesquisa em Zebrafish Notre Dame para a sua notável dedicação no cuidado e bem-estar de nossa colônia de peixe-zebra. Finalmente, agradecemos aos membros de nosso laboratório de pesquisa para seus comentários, discussões e idéias sobre este trabalho, comobem como Marigold (Maripooka) e Zinnia Wingert para fornecer naturalmente derramou bigodes felinos para fazer ferramentas chicote mais excelentes para a nossa pesquisa.

<ol>
	<li>Laale, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+use+of+zebrafish,+Brachydanio+rerio+in+fisheries+research.+A+literature+review.">The biology and use of zebrafish, Brachydanio rerio in fisheries research. A literature review.</a> J Fish Biol. 10, 121-173 (1977).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).</li><li>Goldsmith, J. R., Jobin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Think+small:+zebrafish+as+a+model+system+of+human+pathology.">Think small: zebrafish as a model system of human pathology.</a> J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li><li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish.">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).</li><li>Wingert, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros.">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet 3. , (1922).</li><li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+nephrogenesis+involves+dynamic+spatiotemporal+expression+changes+in+renal+progenitors+and+essential+signals+form+retinoic+acid+and+irx3b.">Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b.</a> Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).</li><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooked!+Modeling+human+disease+in+zebrafish.">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).</li><li>Tamplin, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+screening+in+zebrafish:+swimming+in+potential+drug+therapies.">Small molecule screening in zebrafish: swimming in potential drug therapies.</a> WIREs Dev Biol. 1, 459-468 (2012).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. 3rd ed. , (2000).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nat Protoc. 3, 59-69 (2008).</li><li>Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+RNA+in+situ+hybridization+on+zebrafish+embryos:+probe+synthesis.">Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: probe synthesis.</a> CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5036. , (2008).</li><li>Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+RNA+in+situ+hybridization+on+zebrafish+embryos:+hybridization.">Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: hybridization.</a> CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5037. , (2008).</li><li>Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+RNA+in+situ+hybridization+on+zebrafish+embryos:+mounting.">Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: mounting.</a> CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5038. , (2008).</li><li>Machluf, Y., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+mRNA+expression+in+the+zebrafish+embryo.">Visualization of mRNA expression in the zebrafish embryo.</a> Methods Mol Biol. 714, 83-102 (2011).</li><li>Brend, T., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+whole+mount+high-resolution+double+fluorescent+in+situ+hybridization.">Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization.</a> J Vis Exp. 25 (25), (2009).</li><li>Lauter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems.">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev Biol. 11 (43), 1-11 (2011).</li><li>Lauter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescent+in+situ+hybridization+to+define+abutting+and+overlapping+gene+expression+in+the+embryonic+zebrafish+brain.">Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain.</a> Neural Dev. 6 (10), 1-13 (2011).</li><li>Lagendijk, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+details:+whole+mount+microRNA+in+situ+hybridization+protocol+for+zebrafish+embryos+and+adult+tissues.">Revealing details: whole mount microRNA in situ hybridization protocol for zebrafish embryos and adult tissues.</a> Biol Open. 1, 566-569 (2012).</li><li>Haffter, P., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+genetics+in+a+small+vertebrate,+the+zebrafish.">Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish.</a> Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).</li><li>Galloway, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Gata1+but+not+Gata2+converts+erythropoiesis+to+myelopoiesis+in+zebrafish+embryos.">Loss of Gata1 but not Gata2 converts erythropoiesis to myelopoiesis in zebrafish embryos.</a> Dev Cell. 8, 109-116 (2005).</li><li>Barrallo-Gimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+survival+and+differentiation+in+zebrafish+depends+on+mont+blanc/tfap2a+gene+function.">Neural crest survival and differentiation in zebrafish depends on mont blanc/tfap2a gene function.</a> Development. 131, 1463-1477 (2003).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Zebrafish têm provado ser um organismo modelo extremamente valioso em toda a comunidade de pesquisa nos últimos anos. Zebrafish apresentam um elevado grau de conservação genética com a dos vertebrados superiores e vantagens pertinentes à sua anatomia, reprodução e ciclo de vida desta espécie fazem muito passíveis de análises experimentais. Além disso, o avanço das técnicas moleculares aplicáveis ​​para o peixe-zebra promoveu ainda a utilização deste organismo modelo na pesquisa científica. Por exemplo, uma grande variedade de linhas de zebrafish transgênicos foram gerados para estudar a progressão da doença e para responder a muitas questões fundamentais que estão por trás dos mecanismos-chave do desenvolvimento, incluindo a organogênese. Por conseguinte, com base na utilização dinâmica de peixe-zebra em ambas as doenças e de desenvolvimento da pesquisa, as metodologias de marcação de células e quantificação do sinal é um aspecto importante da análise dos dados. Enquanto os métodos que empregam uma fluorescentetibodies pode ser usado para detectar a expressão da proteína em peixes-zebra transgénicos, os investigadores geralmente dependem de procedimentos padrão como DESEJOS 12-16 para examinar a localização espaço-temporal dos transcritos do gene em uma amostra de peixe-zebra não transgénico fixo. Na verdade, o desejo é uma das técnicas mais utilizadas em biologia 16, e é uma ferramenta vital para caracterizar o fenótipo de mutações genéticas e perturbações genéticas químicos. No entanto, o desejo é associado com um número de potenciais armadilhas e desafios. Para confirmar a especificidade do anti-sentido ribroprobe, ribossondas de sentido pode ser utilizado como um controlo para avaliar a especificidade dos padrões de coloração ribossonda anti-sentido. Enquanto secções 4 e 5 são apresentados na ordem de rotulagem e a detecção de uma sonda marcada com digoxigenina seguido de sonda marcada com f luoresceina, esta ordem pode ser invertida. Tipicamente, os sinais mais fracos (genes com níveis de expressão inferiores) são melhor detectadas com sondas marcadas com digoxigenina e esta manchadesenvolvido pela primeira vez com um substrato roxo, seguido de detecção e coloração do sinal mais forte (mais gene abundantemente expresso), utilizando o substrato vermelho. No entanto, no caso de reacções de duas cores vai ser realizada, recomenda-se que várias combinações de rótulos e substratos são testados para encontrar o procedimento que é mais adequado para a recolha de dados e análise. Além disso, os tempos previstos de bloqueio, incubação do anticorpo e lavagem fornecidas nas seções 4-5 são adaptados para os embriões com menos de 24 horas após a fertilização; longos intervalos de estes mesmos passos com embriões mais velhos pode levar ao acúmulo de sal na amostra. Extensas dicas para solução de problemas DESEJO embrião de peixe-zebra padrão já foram documentados na literatura 12-16. Provavelmente o dilema mais comum é a alta fundo. Recomendamos o aumento do número de lavagens MABT no passo 4,7 para 15-20 lavagens, se necessário, no entanto, em nossa experiência, a adição do MABT overnight &#39;super-lavagem&#39;dá excelentes resultados quando utilizado em conjunto com 10 ou mais lavagens MABT curtos, antes de prosseguir para a etapa 4.8. Outro exemplo dilema é pobre infiltração da sonda, que pode ocorrer com longas ribosondas. Shearing o riboprobe seguinte Passo 3.6 através da hidrólise alcalina pode contrariar esta situação. Em nossa experiência com amostras pequenas, corte sonda não é normalmente necessária. No entanto, deve-se ter em mente que os parâmetros como isso pode ser factores que contribuem para o resultado de um experimento de desejo, e sugerimos exame destas instruções de solução de problemas úteis já disponíveis ao público na Comunidade, conforme necessário para refinar os parâmetros experimentais para DESEJO em seu próprio pesquisa 12. Em adição às técnicas tradicionais DESEJO 12-16, tem havido um surgimento contínuo de avanços nas metodologias de desejo e protocolos alternativos que têm sido formuladas. Estes incluem novos modos de detecção de sinal, tais como através da utilização de fluorescênciacência 17-19, de métodos que permitem a localização de microRNAs 20. Mesmo assim, apesar das muitas melhorias que foram feitas aos métodos de rotulagem celular atuais, a eficácia desses procedimentos são negados se a mancha (s) não pode ser facilmente visualizado dentro da amostra de interesse em um ponto de tempo desejado. Essa limitação é problemático para os investigadores, especialmente quando se refere aos estágios embrionários iniciais da ontogenia peixe-zebra, o que poderia levar a lacunas em nossa compreensão de vários processos de desenvolvimento que surgem nestes momentos. Durante o desenvolvimento normal de peixe-zebra, o saco vitelino diminui progressivamente em tamanho com a idade do embrião 11. Portanto, nestas fases posteriores de desenvolvimento (&gt; 24 horas após a fertilização), coloração desejo é bastante simples de analisar, porque o embrião é maior em comparação com o seu vizinho saco vitelino. No entanto, este não é o caso de a fase de botão de cauda somitogénese precoce (quando o embriãomassa está posicionada à volta da gema), onde o saco vitelino opaco pode, por vezes, obscurecer a visualização da mancha. Por conseguinte, o método de montagem plana foi concebido para ajudar a aliviar os problemas de imagem e análise de dados associados com a caracterização de amostras de embriões de peixes-zebra precoces (esquematizados na Figura 1 e Figura 2), e tem sido amplamente utilizada desde a fenotipagem sistemática de mutações genéticas isoladas a partir das primeiras telas genéticos grande escala 21. Desde o advento das técnicas de montagem plana, a análise das fases iniciais de desenvolvimento foi significativamente melhorada. Uma vez que a gema é removido do embrião, é possível estabelecer o plano de embriões em uma lâmina de vidro com a orientação desejada para a imagiologia. Esta posição bidimensional permite a visualização de todo o embrião de uma só vez, o que elimina a necessidade de rodar a amostra. Vários tecidos estão localizados em amplos domínios de embrião, tais como oos precursores que formam o sangue e rim. Além disso, pode-se precisar de comparar vários tecidos em desenvolvimento diferentes ao mesmo tempo. Montagem plana permite ao pesquisador visualizar simultaneamente todo o domínio de tais grupos de células, e, portanto, pode ajudar muito quantificações como uma medição da área de um tecido ou de células conta. Esta técnica tem, em última análise ajudou a levar a muitas descobertas a respeito de uma variedade de mecanismos de desenvolvimento importantes subjacentes hematopoiese, neurogênese e organogénese. Assim, uma vez dominado, as aplicações para esta técnica simples para os pesquisadores são bastante consideráveis. Por exemplo, em um estudo sobre a escolha linhagem durante hematopoiese, montagem plana preparações de embriões de peixes-zebra nas fases somito (SS) 14 e 18 foram utilizados para ilustrar as mudanças que ocorreram no padrão do fator de transcrição dedo PU.1 zinco entre a expressão de tipo selvagem e GATA1 morfolino embriões injectados 22.Este método permitiu a detecção de um domínio PU.1 expandida em 18 ss, indicando que GATA1 é mais provável que regula a expressão de PU.1 na massa celular intermediária (ICM) em torno deste ponto de tempo. Embriões plana adicionais montados coradas para diferentes genes eritróides incluindo gtpbp1 e epsin demonstraram uma perda na expressão destes genes mutantes que eram vlt GATA1 - / -. Outras análises mostraram qualquer alteração na expressão de genes, como erythoid biklf e testhymin que eram conhecidos como sendo independente da actividade gata. Portanto, em conjunto com os seus outros resultados experimentais, foi revelado que GATA1 é essencial na regulação da diferenciação de células dentro da linhagem mielo-eritróides. Em um estudo do desenvolvimento da crista neural, montagens planas foram usados ​​para examinar a expressão Crestin em mont blanc (mob M610) mutantes em um estudoexaminar os papéis de mont blanc e função do gene tfap2a 23. Aos 10 e 20 ss, expressão Crestin foi totalmente revogada na cabeça e diminuiu na região do tronco de mutantes M610 mob em comparação com a expressão normal, do tipo selvagem, em última análise, ajudar este grupo a concluir sobre a importância da mont blanc e tfap2a regulação durante a formação da crista neural. Além disso, em termos de organogénese, montagens planas permitiram a descoberta da presença de domínios distintos no campo progenitora renal precoce durante o desenvolvimento do rim embrionário do peixe-zebra, conhecidos como os pronefros. O embrião do peixe-zebra fornece um sistema conservado e ainda anatomicamente simples para estudar como progenitoras renais dar origem a unidades de nefrónios funcionais que compreendem os pronefros, um processo conhecido como nefrogênese 6,7 (Figura 4). Análise de montagem plana tem sido útil para os domínios de documentos de reprogenitores nal e para dissecar o resultado de mudanças na sinalização RA durante pronefros padronização 6,7 (Figura 5), o que era até então desconhecida. Tomados em conjunto, estes exemplos sugerem que há de fato muitas amplas aplicações para esta montagem plana protocolo do estudo de diversos processos que ocorrem durante o desenvolvimento normal e estados doentes. Conceitualmente, este procedimento plana de montagem é bastante simples em geral. No entanto, as manipulações e grau de finesse necessários para dominar este método pode ser bastante difícil de dominar, na ausência de demonstração visual. Portanto, este protocolo foi elaborado para permitir aos investigadores, especialmente aqueles que são novos para o modelo de peixe-zebra, com a oportunidade de entender melhor como executar esta técnica e partilhar o nosso aconselhamento sobre os reagentes que podem otimizar a manipulação de tecidos. Esperamos que este protocolo acabará por permitir que outros na comunidade para refinar as condições da amostra mais ideal para ser used para geração de imagens premium, análise de dados e comunicação dos seus resultados em publicações. Em última análise, isso deve permitir aos investigadores para superar os obstáculos anatômicos do peixe-zebra durante a embriogênese precoce, o que pode obscurecer a apresentação de resultados experimentais, e resolver estes através do uso desta técnica simples, mas significativo.

O peixe-zebra, Danio rerio, tornou-se um organismo largamente utilizado no estudo da biologia do desenvolvimento. Zebrafish estão tropicais, espécies de vertebrados de água doce pertencente à família Cyprinidae. Zebrafish foram originalmente usado para a pesquisa ambiental para obter informações sobre os riscos potenciais de poluentes da água, como eram facilmente obtidos, barato e fácil de manter um. Ao longo dos últimos trinta anos, o peixe-zebra tornou-se reconhecido como um sistema modelo de vertebrados geneticamente tratável por uma série de razões. Zebrafish mostram um alto grau de conservação anatômica e fisiológica com vertebrados superiores, incluindo mamíferos 2,3. Anotação recente sequência do genoma revelou que aproximadamente 70% dos genes humanos têm, pelo menos, um peixe-zebra contraparte 4. Por exemplo, muitos genes ortólogos que desempenham um papel importante durante o desenvolvimento do rim foram identificados entre estas espécies 5-7. Este dramatic grau de conservação no que diz respeito à biologia celular e molecular tem possibilitado aos pesquisadores para criar modelos para uma ampla gama de doenças humanas no peixe-zebra 8 e zebrafish tornaram-se uma ferramenta valiosa para identificar potenciais terapias medicamentosas usando telas genéticos químicas 9. Além disso, o modelo de zebrafish não só é capaz de recapitular uma variedade de processos de desenvolvimento complexos e estados de doença que são vistos em humanos, mas vários atributos adicionais também aumentam o seu apelo como um organismo modelo para estudos de embriologia. Zebrafish são ovíparos e se reproduzir através de desova de transmissão, o que fornece aos pesquisadores, com fácil acesso aos embriões desde o início da fertilização 10. Outras vantagens incluem o tamanho do embrião, transparência e desenvolvimento rápido, externo 10. Além disso, o peixe-zebra adultos possuem alta fecundidade e normalmente produzem relativamente grandes tamanhos de embreagem que pode variar entre 200-500por semana, em última análise, permitindo aos pesquisadores a realização de experimentos de alto rendimento, como telas químicas fenótipo base, com facilidade 9. Mesmo assim, apesar da infinidade de vantagens que são exibidos pelo modelo peixe-zebra, há desafios que dizem respeito à análise e comunicação dos resultados experimentais obtidos a partir de estágios iniciais de desenvolvimento. Em alguns casos, a anatomia inerente do embrião do peixe-zebra pode obscurecer a visualização de um dos dados. Após a fecundação, a célula inicial passa por vários eventos de clivagem como o desenvolvimento progride 11. Seguindo a gastrulação, o eixo embrionário surge na fase tailbud (10 CGA) tal que ele é enrolado à volta da gema 11. Como desenvolvimento posterior avança ao longo do período de segmentação, o tronco vai crescer em massa e também prolongar por alongamento axial de tal modo que uma cauda, ​​juntamente com uma porção do saco vitelino em si estendem para fora a partir do centro de massa de gema11. Entre o tailbud e 20 fase somito (hpf 19), as tentativas para observar características específicas do desenvolvimento, após a utilização de vários protocolos de coloração, como desejar, pode ser um desafio, tanto para visualizar e fotografia, devido à geometria do embrião e opacidade o saco vitelino. Uma maneira de eliminar esses desafios é retirar a gema e depois achatar o embrião para uma amostra de duas dimensões que pode ser analisada de uma forma mais simples. Os seguintes recursos de protocolo e de vídeo fornecem um guia para saber como deyolk sucesso e plana montar um embrião após fixação e coloração, usando o exemplo de uma ou duas cores DESEJO coloração. Desejo é uma técnica amplamente utilizada que permite a detecção de ácidos nucleicos específicos em amostras conservadas e, portanto, permite que o sítio (s) de expressão do gene a ser detectado nos tecidos. DESEJO técnicas têm sido extensivamente descritas, e pode ser realizada com vários substratos de cores, bem como a gripeOs sistemas de detecção orescent 12-20. Aqui nós fornecemos o nosso protocolo DESEJO modificado usado para embriões de peixe-zebra entre os tailbud e segmentação estágios de desenvolvimento. Protocolos alternativos DESEJO, no entanto, são compatíveis com o processo de montagem descrito aqui plana, como se referiu no início do protocolo abaixo. Além disso, a montagem plana pode ser utilizado em conjunção com qualquer número de técnicas de visualização existentes, como por exemplo imuno-histoquímica conjunto de montagem, ou etiquetas de rastreamento de linhagem celular, que não são descritos neste protocolo. No geral, a técnica de montagem plana pode permitir uma melhor análise superior e apresentação dos dados obtidos a partir de experimentos com os primeiros estágios do desenvolvimento embrionário no peixe-zebra.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="760">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:163px;">50 X E3</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">1 X E3</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">Dilute 50 X E3 in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">mesh tea strainer</td>
			<td style="width:96px;">English Tea Store</td>
			<td style="width:119px;">SKU #ASTR_KEN, MPN#1705</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">embryo incubation dish</td>
			<td style="width:96px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">35-1005</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">transfer pipet</td>
			<td style="width:96px;">Samco</td>
			<td style="width:119px;">202, 204</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">flat-bottom microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:96px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">87003-300; 87003-298</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">glass vial</td>
			<td style="width:96px;">Wheaton</td>
			<td style="width:119px;">225012</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">1 X Pbst</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs, made by diluting 10 X Pbs in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Tween-20 stock</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB02038</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">10X Pbs&#160;</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB11072</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:96px;">Electron Microscopy Services</td>
			<td style="width:119px;">19210</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:163px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">Dissolve 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze aliquots for storage at -20 &#176;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">filter sterilization unit</td>
			<td style="width:96px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430516</td>
			<td style="width:383px;">1L filter system, 0.45 um CA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">MeOH</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">34860-4L</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">proteinase K</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">03-115-879-001</td>
			<td style="width:383px;">Dissolve in distilled water to make proteinase K stock (10 mg/mL) and store aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">HYB+</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 ug/ul heparin</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:163px;">DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11175025910; 11685619910</td>
			<td style="width:383px;">Refer to manufacturer instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">SP6 RNA polymerase</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11487671001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">T7 RNA polymerase</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10881775001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">T3 RNA polymerase</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11031171001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">RNase 1 inhibitor</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3335399001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4716728001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">glycogen</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">10901393001</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">Ethanol (EtOH)</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td style="width:383px;">Aliquot 50 ml aliquots of 100% EtOH and 70% EtOH (diluted with molecular grade water) and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">molecular grade distilled water</td>
			<td style="width:96px;">Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">25-055-CM</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">waterbath</td>
			<td style="width:96px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">51221073</td>
			<td style="width:383px;">Model 2831</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">nanodrop</td>
			<td style="width:96px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">ND-2000c</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;"></td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">formamide</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00600</td>
			<td style="width:383px;">Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">20X SSC</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB13156</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:163px;">MAB</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">2L formula: Into 1.5 L of distilled water, mix 23.2 g maleic acid, 17.5 g NaCl, 55.0 g Trisma base, then add 8 mLs of 1M Tris-HCl pH 9.5, and then fill to 2 L. Autoclave.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">MABT</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">MAB + 0.1% Tween-20&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:163px;">block solution</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">We make in 50 ml fresh aliquots: 10 mLs of BSA (from 10% lab stock), 5 mls of FCS (from stock), and 35 mLs of MABT. Save unused block at 4 &#176;C to use for antibody solution. Note: Thaw the BSA and FCS stocks at 37 &#176;C&#8212;if you thaw at a higher temperature they become a thick gel (do not use).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">FCS (fetal calf serum) stock</td>
			<td style="width:96px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16140089</td>
			<td style="width:383px;">Aliquot in 5 or 10 ml portions and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:163px;">BSA (bovine serum albumin) stock</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00448</td>
			<td style="width:383px;">Make a 10% stock diluted in MAB by dissolving the BSA flakes at room temperature with rapid stirring, then store 10 ml aliquots at -20 &#176;C. Store undissolved BSA flakes at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">anti-digoxigenin antibody</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11-093-274-910</td>
			<td style="width:383px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">anti-fluorescein antibody</td>
			<td style="width:96px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11-426-338-910</td>
			<td style="width:383px;">Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">12-well staining dish</td>
			<td style="width:96px;">BD-Falcon</td>
			<td style="width:119px;">35-3225</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">pre-staining&#160; buffer</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween-20. Always make fresh: it will precipitate in the course of a few days.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">staining solution-purple</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">For every 10mLs needed: add 45 uL of NBT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples).</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">staining solution-red</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">For every 10mLs needed: add 31.5 uL of INT and 35 uL of BCIP to fresh pre-staining buffer (not used on embryo samples)..</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">NBT stock</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N6876</td>
			<td style="width:383px;">Stored at -20 &#176;C; powder diluted 50mg/mL in 70% DMF, 30% water.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">INT stock</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I8377</td>
			<td style="width:383px;">Stored at -20 &#176;C; powder diluted 55mg/mL in 70% DMF, 35% water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">BCIP stock</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B8503</td>
			<td style="width:383px;">Stored at -20 &#176;C; powder diluted 50mg/mL in 100% DMF.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">DMF (dimethylformaldehyde)</td>
			<td style="width:96px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00450</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">glycine</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G8898</td>
			<td style="width:383px;">&#160;0.1 M glycine, pH 2.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">small plastic Petri dish</td>
			<td style="width:96px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430589, 430588</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">glycerol</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7893</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">fine forceps</td>
			<td style="width:96px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-1050</td>
			<td style="width:383px;">Dumont Tweezers Pattern #55&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:163px;">lash tool</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:383px;">Constructed by affixing a suitable lash to a pipet tip (sizes ranging from P10-P1000 can be used) using superglue. We use a naturally shed human eyelash, a naturally shed animal whisker or wiry fur coat hair, or a natural or synthetic lash purchased from the beauty department at a pharmaceutical or retail store (extra long lashes are most amenable to stable mounting on the pipet tip). The pipet tip is affixed onto a straight rod (8-10 cm in length) such as a needle holder (e.g. Fisher 08-965-A) for easy handling. See Figure 3 for images of these homemade tools.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">glass slide</td>
			<td style="width:96px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4445</td>
			<td style="width:383px;">White Frost&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">glass coverslip</td>
			<td style="width:96px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-540A</td>
			<td style="width:383px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">modeling clay</td>
			<td style="width:96px;">Hasbro</td>
			<td style="width:119px;">Playdoh</td>
			<td style="width:383px;">Other craft modeling clay products can be substituted</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">slide holder</td>
			<td style="width:96px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-587-10</td>
			<td style="width:383px;">Cardboard tray to store slides flat</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:96px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645, SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">compound microscope</td>
			<td style="width:96px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">80i, 90i</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization

O embrião de peixe-zebra agora é comumente usado para a pesquisa básica e biomédica para investigar o controle genético dos processos de desenvolvimento e modelar anomalias congênitas. Durante o primeiro dia de vida, o embrião do peixe-zebra progride através de vários estágios de desenvolvimento, incluindo a fertilização, clivagem, a gastrulação, segmentação, e a organogénese de estruturas, tais como o rim, coração e sistema nervoso central. A anatomia de um jovem embrião de peixe-zebra apresenta vários desafios para a visualização e análise dos tecidos envolvidos em muitos desses eventos porque o embrião se desenvolve em associação com uma massa de gema rodada. Assim, para uma análise precisa e imagem de fenótipos experimentais em amostras embrionárias fixadas entre o tailbud e 20 somite fase (10 e 19 horas após a fertilização (hpf), respectivamente), como as coradas utilizando toda montagem de hibridização in situ (desejo), ele é muitas vezes desejável remover o embrião da gema btodos e para posicioná-la plana sobre uma lâmina de vidro. No entanto, a realização de um procedimento de montagem plana pode ser tedioso. Portanto, bem-sucedido e eficiente plano de montagem de preparação é muito facilitada através da demonstração visual da técnica de dissecação, e também ajudou usando reagentes que auxiliam no tratamento de tecido ideal. Aqui, nós fornecemos o nosso protocolo DESEJO para a detecção de uma ou duas cores da expressão do gene no embrião de peixe-zebra, e demonstrar como o processo de montagem plana pode ser realizada neste exemplo de um espécime fixos manchadas. Este protocolo de montagem plana é amplamente aplicável ao estudo de muitas estruturas embrionárias que surgem durante o desenvolvimento precoce de peixe-zebra, e pode ser implementada em conjunto com outros métodos de coloração realizados em amostras de embrião fixos.

O procedimento de montagem plana protocolo envolve a transformação do embrião do peixe-zebra a partir de sua anatomia normal, em que o eixo do corpo é enrolado em torno de uma esfera de gema localizado centralmente, numa bidimensional preparação (Figura 1A). Toda a montagem de imagem do jovem embrião do peixe-zebra é limitada pela natureza da forma como o eixo embrionário é enrolado à volta da gema. Como resultado, vistas laterais ou dorsais de montar todo espécimes embriões corados apenas podem captar uma porção do eixo ou tecidos particulares obscuros (Figura 1B). Por comparação, deyolking e achatamento do embrião permite que todo o eixo embrionário deve ser visualizados de uma só vez (Figura 1B). Estas limitações são demonstradas por análise de um embrião DESEJOS corado que foi marcado com ribossondas anti-sentido para detectar irx3b (roxo), o que constitui um subconjunto das células progenitoras renais localizados adjacentes aos somitos 7 a 13, e myod1 (vermelho) que rotula osomitos (Figura 1B). O campo de irx3b + renais progenitores é obscurecida no conjunto de montagem lateral, vista por transcritos irx3b são abundantes no sistema nervoso central, fazendo com que o campo renal praticamente impossível visualizar com o ângulo da câmara lateral; além disso, o campo de irx3b + progenitoras renais é apenas parcialmente visível, quando o embrião está rodado para uma câmara de vista dorsal porque o campo é enrolado à volta da gema (Figura 1B). No entanto, uma vista dorsal do mesmo embrião seguinte montagem plana permite que a totalidade do campo de irx3b + progenitoras renais ser analisadas de uma forma simples, em relação aos somitos ao longo do tronco e outras estruturas embrionárias (Figura 1B). Assim, os domínios espaciais elaboradas podem ser idealmente documentado com este método. Vários grandes passos estão envolvidos na execução bem-sucedida do processo de montagem plana. Para executar esta technique, a gema de bola deve ser destacada do primeiro embrião propriamente dito (figura 2A), o que pode ser feito com instrumentos finos, tais como um par de fórceps finos enquanto o embrião é visualizada usando um estereomicroscópio. Após a remoção do produto em bruto da bola gema, uma ferramenta de chicote fino é utilizado para raspar grânulos de vitelo que permaneceram ligados ao embrião (figura 2B). A remoção dos grânulos de vitelo restantes ajuda a facilitar a visualização dos tecidos embrionários. Finalmente, o embrião deyolked é manipulada para posicionar de forma estável sobre uma lâmina de vidro (Figura 2C), que permite a observação e auxiliares de documentação da amostra, utilizando o software de imagem e uma câmara ligada a um microscópio. As ferramentas do chicote são dispositivos caseiros que podem ser construídos através da aposição de um chicote adequado para uma ponteira usando supercola, que podem ser montados em uma alça, se desejar (Figura 3A, mesa Materiais). Amostras chicote diferentes podem ser adquiridos para produzirchicotear ferramentas com características ligeiramente diferentes em termos de comprimento e conicidade (Figura 3B), o que cada usuário pode ter diferentes predileções para uma vez que eles começam a experimentar com o processo de montagem plana. Exemplos de amostras chicote incluem naturalmente derramou cílios humanos, naturalmente, galpão cabelo duro animal ou bigodes, e, finalmente, de variedades sintéticas de cílios disponíveis comercialmente encontrado em departamentos de cosméticos de varejo. A área local circundante e que contém a amostra (s) posicionada sobre uma lâmina de vidro (Figura 4A) pode ser convertido em imagem para análise de alta resolução. Uma combinação de sondas foram usadas para rotular os progenitores renal em desenvolvimento que dão origem ao rim no embrião do tipo selvagem em estágios precoces de desenvolvimento com duas cores desejadas e, em seguida, fixa montagem preparações foram realizadas para ver as amostras (Figura 4B, 4C ). Durante os estágios iniciais somito, progenitores renais são demarcados em um padrão em forma de U por diaeir expressão de transcritos (roxos) pax2a cercam a mesoderme paraxial que expressa concomitantemente delta C (dlc) (vermelho) (coluna da esquerda, a Figura 4B) 6,7. Em comparação, quando foram detectados transcritos de DLC com um substrato de púrpura, e foram marcadas em combinação com o marcador krox20 rombencéfalo (vermelha), um subdomínio rostral dos progenitores renais foi visualizado que expressa dlc (coluna da direita, a Figura 4B), como observado anteriormente 6,7. Montagem preparações planas pode ser utilizado de forma semelhante para estudar as fases somitogenesis posteriores. Na fase de somito 14, foi analisada a expressão de marcadores renais pax2a, slc4a4, e slc12a3 (roxo), juntamente com smyhc1 (vermelho), que marca as somitos (Figura 4C). Estas combinações de permitir o mapeamento do domínio inteiro progenitoras renais com pax2a, enquanto revelando que um subconjunto de células numa expr subdomínio rostralEssed slc4a4a e foram distinguidos por um subdomínio caudal não sobreposição de progenitores renais que expressavam slc12a3. DESEJOS duas cores e a preparação de montagem plana também são valiosas para o estudo de domínios celulares durante a organogénese em peixes-zebra com mutações genéticas ou de outras perturbações da exposição ambiental a pequenas moléculas de 6,7 (Figura 5). Os NLS e mutantes de peixe-zebra lib abrigar mutações em aldeído desidrogenase 1a2 (ALDH1A2, anteriormente conhecido como RALDH2), que codifica uma enzima necessária para a biossíntese do ácido retinóico (RA). RA é essencial para o desenvolvimento correcto de muitos tipos de células renais, incluindo a formação de células podocyte que contribuem para tornar o filtro de sangue do rim embrionário, conhecido como o glomérulo 6,7. DESEJO foi realizada para identificar os progenitores podocyte com wt1a concomitantemente com demarcação de tele desenvolvimento somitos com smyhc1 e rombencéfalo com krox20 em embriões de tipo selvagem, mutantes nls embriões, os embriões mutantes lib e os embriões tratados com um inibidor químico de enzima ALDH, DEAB (Figura 5). Os embriões com expressão deficiente ALDH1A2 mostrou reduzida expressão wt1a comparado com embriões de tipo selvagem, enquanto que os embriões tratados com DEAB mostrou uma revogação dos transcritos wt1a (Figura 5, coluna da direita). Tomados em conjunto, estes resultados representativos demonstrar como a técnica de montagem plana pode ser usada para analisar e documentar as diferenças anatômicas com precisão no embrião precoce, e, assim, ser implementadas para estudos de desenvolvimento valiosos. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1.jpg" /> Figura 1. Visão geral da montagem preparação planaração para os embriões de peixe-zebra. A) O procedimento de montagem plana permite a visualização simultânea de tecidos ao longo do eixo embrionário, pois a massa de gema central é removido eo embrião estavelmente posicionado sobre uma superfície plana. B) As imagens de toda uma montagem DESEJA embrião manchado em vista lateral e dorsal, e depois de uma preparação plana montagem foi realizada. O embrião foi corado com sondas antisense para detectar transcritos do gene que codifica irx3b (roxo) e myod1 (vermelho). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2.jpg" /> Figura 2. Esquemática do procedimento plana de montagem para embriões de peixe-zebra. A) O embrião é primeiro grosseiramente deyolked para remover a maior parte da massa de gema, em seguida, (B), a superfície ventral é finamente deyolked para remover restantes grânulos de vitelo, edepois de lavar o embrião é (C) montados lado dorsal em uma lâmina de vidro para análise visual e / ou imagem fotográfica. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3.jpg" /> Figura 3. Fotografias de exemplo, ferramentas de chicote em comparação com uma pinça fina. A) ferramentas chicote caseiros foram fotografadas ao lado de um par normal de uma pinça fina, posicionado ao lado de uma régua métrica para fornecer uma referência. B) vista ampliada de ferramentas chicote ao lado dos pinça fina, com a referência milímetro fornecido ao longo da parte superior da visualização . Duas ferramentas chicote diferentes são mostrados, com o asterisco (*) usado para marcar o chicote obtido a partir de um galpão de cílios naturalmente humana, e dois asteriscos (**) usado para marcar um chicote que foi obtido a partir de um bigode naturalmente derramou felina e aparado para fazer um final um tanto brusco. Em cada casi só, o chicote foi enfiada através da ponta da pipeta e afixada com várias camadas de supercola para criar progressivamente um forte selo para estabilizar / ancorar o chicote para a pipeta ligado a um dispositivo de manipulação. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4.jpg" /> Figura 4. Caracterização das mudanças de desenvolvimento no campo progenitora renal no embrião do peixe-zebra de tipo selvagem. A) Deslize esquemático indicando a zona trabalhada para análise em (B, C). B) embriões de tipo selvagem nas posições 1, 3, 5 e fase somito foram coradas com duas cores por pretendam avaliar a composição do campo progenitora renal que dá subir para o rim embrionário, ou pronefros. (Coluna da esquerda) Transcrições que codificam o fator de transcrição pax2a (coradas em roxo) marcam várias populações no embrião, incluindo o p renalcampo rogenitor que emerge a partir da mesoderme intermediária. Transcrições que codificam o ligante dlc Notch marcar somitos que se formam a partir da mesoderme paraxial (coradas em vermelho). (Coluna da direita) Quando a expressão de transcritos de DLC (coradas de púrpura) e a parte posterior do cérebro rhombomere marcador krox20 (manchado de vermelho) são examinados nos mesmos embriões, dlc expressão pode ser observada em um subdomínio rostral dos progenitores renais localizados adjacentes aos somitos 1-5, que foi obscurecido durante a co-coloração de DLC com pax2a. C) de embriões de tipo selvagem, na fase 14 somito foram duplo ou triplo-corados com uma combinação de um marcador renal (roxo), o marcador smyhc1 somito (vermelho) , e a parte posterior do cérebro rhombomere marcador krox20 (também vermelho). (Painel superior) Nesta fase, as transcrições pax2a continuar a demarcar os progenitores renais. (Média, painéis inferiores) No território progenitor renal, um subdomínio rostral é marcadopor slc4a4 e transcritos que codificam slc12a3 marcar um subdomínio caudal. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5.jpg" /> Figura 5. A utilização de preparações montadas planas para caracterizar os fenótipos causadas por mutações genéticas ou perturbações genéticas químicos que modulam a biossíntese do ácido retinóico. DESEJOS O padrão de expressão, na fase de 15 somito wt1a (roxo) e smyhc1/krox20 (vermelho) foi comparada entre os tipos selvagens e embriões com deficiências na produção de ácido retinóico (AR) devido a defeitos de aldeído desidrogenase 1a2 (NLS e mutações lib) ou inibição química da retinaldehyde atividade desidrogenase com dietilaminobenzaldeído (DEAB). A redução da produção de AR em lib é ligeiramente mais intensa do que o NLS, taisque os embriões lib expressar coloração ligeiramente reduzida de transcrições wt1a que semelhante encenado nls embriões mutantes, enquanto o tratamento DEAB de tipos selvagens está associada a revogação completa da expressão wt1a.

Watch this Scientific Journal Video about Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization at JoVE.com

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

O embrião de peixe-zebra é um excelente modelo para investigação em biologia do desenvolvimento. Durante a embriogênese, peixe-zebra desenvolver com uma massa de gema, que apresenta desafios tridimensionais para observação de amostras e análise. Este protocolo descreve como criar bidimensionais planas montagem preparações de toda montagem in situ (desejo) manchadas espécimes embrião de peixe-zebra.

Monte Preparação Plano de observação e análise de amostras de embriões Zebrafish manchado por inteiro Monte<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

flat-mount-preparation-for-observation-analysis-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Biology

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

24.1K visualizações.  University of Notre Dame.  O embrião de peixe-zebra é um excelente modelo para investigação em biologia do desenvolvimento. Durante a embriogênese, peixe-zebra desenvolver com uma massa de gema, que apresenta desafios tridimensionais para observação de amostras e análise. Este protocolo descreve como criar bidimensionais planas montagem preparações de toda montagem in situ (desejo) manchadas espécimes embrião de peixe-zebra. 

Vídeo: Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biologia

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying antibody expression in developing brain, neural tube and somite. This video demonstrates the different steps in whole-mount antibody staining using HRP conjugated secondary antibodies; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, endogenous peroxidase is inactivated; The embryo is then exposed to primary antibody. After several washes, the embryo is incubated with secondary antibody conjugated to HRP. Peroxidase activity is revealed using reaction with diaminobenzidine substrate. Finally, the embryo is fixed and processed for photography and sectioning. The advantage of this method over the use of fluorescent antibodies is that embryos can be processed for wax sectioning, thus enabling the study of antigen sites in cross section. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell 1.

This video demonstrates whole mount immunohistochemistry, a method by which the spatial and temporal expression pattern of an antigen can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by Jane Dodd and Tom Jessell.

Método para coloração Whole Mount anticorpos em Pintainho

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish Whole Mount Alta Resolução Duplo Fluorescente In Situ Hibridização

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.

Using Whole Mount in situ Hybridization to Link Molecular and Organismal Biology

Whole mount in situ hybridization (WISH) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology course in addition to vertebrate dissections. This gave students the opportunity to study gene expression patterns as well as gross anatomy, linking the study of molecular and organismal biology within one course.

Usando Monte Whole In situ Hibridação a ligação de Biologia Molecular e Organísmicos

Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Todo-mount Análise imuno-histoquímica para Vascularização embrionárias Limb pele: um sistema modelo para estudar Morfogênese Branching Vascular em Embrião

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Monte todo In Situ Hibridação de E8.5 de Embriões E11.5 rato

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Análise de uma única célula de transcrição do gene pela RNA Fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridização (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Todo o Monte RNA Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; A hibridação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridação em embriões de Mount inteiros e histologia de células Adaptado para Elasmobrânquios Marinhos

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression both in terms of tissue distribution and developmental stage. Protocols are described for the use of WISH of zebrafish embryos using antisense RNA probes labeled with digoxigenin. Probes are generated by incorporating digoxigenin-linked nucleotides through in vitro transcription of gene templates that have been cloned and linearized. The chorions of embryos harvested at defined developmental stages are removed before incubation with specific probes. Following a washing procedure to remove excess probe, embryos are incubated with anti-digoxigenin antibody conjugated with alkaline phosphatase. By employing a chromogenic substrate for alkaline phosphatase, specific gene expression can be assessed. Depending on the level of gene expression the entire procedure can be completed within 2-3 days.

High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function

The zebrafish, a small tropical fish, has become a popular model for studying gene function during vertebrate development and disease. The temporal and spatial expression of target genes can be determined by in situ hybridization. Our improved protocol allows for the detection of low abundant transcripts with low non-specific background signal.

Alta resolução Monte Whole<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização dentro embriões Zebrafish para estudar a expressão gênica e função

This article focuses on whole-mount in situ hybridization (WISH) of zebrafish embryos. The WISH technology facilitates the assessment of gene expression ...