Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Boris Reizis do Departamento de Microbiologia e Imunologia da Universidade de Columbia para discussões úteis. Gostaríamos também de agradecer ao Dr. Margaret Bynoe, Dr. Rodman Getchell e Deequa Mahamed do Departamento de Microbiologia e Imunologia da Faculdade de Medicina Veterinária, da Universidade Cornell de assistência técnica com citometria de fluxo e Lu Huang para obter ajuda com edição de vídeo. Os autores também desejam agradecer aos membros do Duhamel e laboratórios Weiss para a sua revisão crítica do manuscrito e produção de vídeo, e Stephanie Yazinski do laboratório Weiss para reprodução e genotipagem p53 - / - ratos. Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Cornell University Animal Care Institucional e Comitê de uso. Esta pesquisa foi suportada em parte por fundos fornecidos pelo Departamento de Agricultura dos EUA, Pesquisa do Estado de Cooperativa, Educação e Serviço de Extensão da Saúde Animal, e Programa de Pesquisa de Doenças (para GED e RSW) e subvenções NIH R03 HD058220 e R01CA108773 (para RSW). O vídeo foi produzido usando in-house instalações pelo pessoal dos laboratórios Duhamel &amp; Weiss.

1. Dissecação de Tumor <ol><li> Para dissecção do tumor, uma toalha de papel ou panos cirúrgicos descartáveis ​​é colocado na plataforma de dissecção e pulverizadas com etanol 70%. </li><li> Camundongos para este protocolo são rotineiramente submetidos à eutanásia com CO 2. Posicione o mouse sacrificados no teclado dissecção e spray de ambos os lados do animal com o etanol. O mouse é mantida no lugar sobre o bloco dissecção por meio de quatro ou mais alfinetes inseridos através das pernas e pulverizado completamente com álcool 70%. </li><li> A pele sobre a linha média é cortado a partir do púbis até a base da cabeça usando uma tesoura esterilizada, evitando-se os músculos subjacentes e penetrando nas cavidades do corpo. </li><li> Abrir a cavidade abdominal com um novo par de tesouras e pinças esterilizadas, tomando cuidado para não danificar os órgãos internos. </li><li> Abrir a cavidade torácica dissecando e desviando a caixa torácica para revelar o tumor, sem danificar os vasos sanguíneos. </li><li> Separar o tumor de outros órgãos, e de transferência de um pedaço de aproximadamente 40-50% do total do tumor (cerca de até 1,5 X 0,8 X 0,8 cm) em PBS frio mantidos em gelo. </li><li> A parte restante do tumor podem ser guardadas para outros ensaios e uma necropsia completa pode ser realizada neste momento. </li></ol> 2. Linfoma de células de cultura <ol><li> Pulverizar o tubo que contém o tumor dissecados com etanol 70% e transferir para um armário de biossegurança. </li><li> Adicionar 10 mL de meio de cultura para um 150 milímetros 2 placa de Petri estéril. </li><li> Transferir a peça de tumor na placa de Petri por sucção suave, com uma pipeta. </li><li> Dobre duas agulha estéril 18 voltada para o lado chanfrado para fora. </li><li> Dissociar o tumor usando a agulhas tortas. </li><li> Redemoinho do prato, bata suavemente e coloque em um ângulo para coletar a suspensão de célula para um lado, evitando grandes pedaços de tumor. </li><li> Aspirar a suspensão celular e transferir para um tubo cônico de 50 mL, evitando grandes pedaços de tumor. </li><li> Lave a placa com 10 mL de médio e transferência para o mesmo tubo, evitando grandes pedaços de tumor. </li><li> Misture a suspensão de células composto por linfócitos e células do estroma delicadamente e transferir 5 mL para um balão de cultura de tecidos T-25 e 10 mL em um T-75 frasco de cultura de tecidos. Agite suavemente os frascos. </li><li> Use a suspensão de células restantes para fazer 2, 4, 10100 e 1000 diluições em 2,5 mL de volume final (a cultura de células em densidades diferentes, utilizando vários tipos de embarcações cultura maximiza a probabilidade de estabelecer uma linha de células T). </li><li> Placa de 2,0 mL de cada diluição em poços individuais de uma placa de 6 poços. Agite ligeiramente a placa. </li><li> Incubar as células por 48 h em atmosfera umidificada CO 2 no ar. </li></ol> 3. Alimentando células de linfoma <ol><li> Após 48 h de incubação, adicionar 5 mL de meio para o balão de T-25 e 10 mL de meio para o balão de T-75 ao longo da parede com o mínimo de perturbação das células. </li><li> Adicionar 2 ml de meio em cada poço da placa de 6 poços ao longo da parede com o mínimo de perturbação das células. </li><li> Incubar as células para um adicional de 72 h. </li></ol> 4. Passaging Células Linfoma <ol><li> Passagem inicial <ol><li> No final do quinto dia de incubação, as células são várias passagens na proporção de 1:1, mantendo os frascos originais e placas (manutenção da densidade das células a uma concentração de cerca de 3x106 mL / durante as passagens de primeira promove a criação bem sucedida de um linhagem celular contínua). <ol class="lalpha"><li> Para o balão T-25, a transferência de 5 mL da suspensão celular para um balão novo contendo 5 mL de meio. Adicionar 5 ml de meio para o balão original. </li><li> Para o balão T-75, a transferência de 10 mL de suspensão celular para um balão novo contendo 10 mL de meio. Adicionar 10 mL de meio para o balão original. </li><li> Para a placa de 6 poços, a transferência de 2 mL da suspensão de células de cada poço em poços correspondente de um novo prato contendo 2 mL de meio em cada poço. Adicionar 2 ml de meio em cada poço dos poços original. </li></ol></li><li> Incubar todos os frascos e as placas por mais 72 h. Em nossa experiência mais linhas de células são estabelecidos a partir destes uma passagem culturas (a presença de agregados celulares frouxamente aderido a suspensão sobre as células do estroma anexado é uma indicação precoce de uma linhagem celular). </li><li> Para as culturas com menos ou nenhuma agregados celulares frouxamente aderente suspensão, alimentar os frascos ou placas com cuidado substituindo cerca de 50% do meio de cada 72 h Para evitar a remoção de células da cultura original, vasos cultura ficam em pé e em repouso por pelo menos 5 min para que o sedimento de células na parte inferior por gravidade, antes de ligeira aspiração do meio sobrenadante. </li></ol></li><li> Manutenção de linhas celulares estabelecidas <ol><li> Linhagens de células estabelecidas são várias passagens em frascos novos e placas. Para T-25 e T-75 frascos, adicionar 5 mL do original oususpensão uma passagem em 5 mL de meio. Para 6-bem pratos, adicionar 3 mL da suspensão de células original ou uma passagem em 7 mL de meio em um frasco T-25. Alimentar e manter o original ou uma passagem de cultura, substituindo o volume removido com meio de cultura fresco. </li><li> Passagem linhagens estáveis ​​de células em novos frascos T-25. As linhas de células têm um tempo de duplicação de 18-24 h. As culturas são rotineiramente mantidos a uma densidade de 1-3x106 mL / e várias passagens a cada 3 dias. Adicionar o volume necessário de passagem da cultura anterior para novo meio para fazer até 10 mL. Alimentar e manter a cultura original. </li><li> Depois de algumas passagens, as células não aderentes se auto sustentar sem a células aderentes do estroma e um número menor de células aderentes são transportados a cada passagem. Além deste ponto, as culturas podem ser mantidas em cultura de tecidos não-tratados T-25 frascos. </li></ol></li></ol> 5. Congelamento e Recuperação de linhagens de células linfoma <ol><li> As linhas celulares são congelados em preparados na hora RPMI 1640, contendo 20% FBS e DMSO 10%. </li><li> Células de uma cultura de idade em 48 h T-25 frasco (cerca de 1.5x10 6 células / mL) são centrifugadas a 1500 rpm por 5 min à temperatura ambiente. Após descartar o sobrenadante, as células são ressuspensas em 2 mL de meio de muito frio. Dois volumes 1,0 mL de suspensão celular de cada frasco são colocados em frascos de congelamento, imediatamente congeladas a -80 ° C, e transferidos para o nitrogênio líquido no dia seguinte. </li><li> Células são recuperados a partir de armazenamento de nitrogênio líquido por descongelamento rápido e ressuspender o conteúdo em 10 mL de meio de cultura fresco. Alternativamente, as células recém-descongelado são lavadas uma vez em meio de cultura morna para retirar o DMSO antes de ressuspender em 10 mL de meio de cultura fresco. As células são cultivadas por pelo menos 72 h antes da passagem subsequente. </li></ol> 6. Resultados representante Um Atm - / - células T-line desenvolvido utilizando este protocolo e designado DWJ-Atm-1 foi caracterizada por coloração com anti-CD3-FITC, anti-CD4-APC e anti-CD8-PE e análise de citometria de fluxo (Figura 1). Mais de 90% das células T-CD3 foram, CD4 e CD8 triple-positivo. <img src="/files/ftp_upload/2598/2598fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Caracterização de uma linha de células T desenvolvido utilizando este protocolo. Os marcadores de superfície celular de um Atm estabelecida - / - linha de células designadas DWJ-Atm-1 foram caracterizados por coloração com anti-CD3-FITC, anti-CD4-APC, anti-CD8-PE e análise de citometria de fluxo. Resumidamente, 1X10 6 células frescas foram lavadas uma vez em PBS fria (1500 rpm / 5 min), e incubadas a 4 ° C por 10 min com 200 mL de coquetel de anticorpos (cada anticorpo na diluição de 1:200 em PBS com BSA 1%. As células podem ser examinados imediatamente, enquanto fresca ou fixo para análise posterior. células fixas são preparadas pela adição de formalina tamponada neutra a uma concentração de 4% (vol / vol) final e incubadas a 4 ° C por 30 min, colhidas por centrifugação (1500 rpm / 5 min) e ressuspendidas em 200 mL de PBS com BSA 1%. Um total de 1 X 10 4 células foram analisados ​​usando um BD FACS Calibur analisador e CellQuest software (BD Biosciences, San Jose, CA).

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	<li>Barlow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atm-deficient+mice:+a+paradigm+of+ataxia+telangiectasia.">Atm-deficient mice: a paradigm of ataxia telangiectasia.</a> Cell. 86, 159-171 (1996).</li><li>Elson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pleiotropic+defects+in+ataxia-telangiectasia+protein-deficient+mice.">Pleiotropic defects in ataxia-telangiectasia protein-deficient mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13084-13089 (1996).</li><li>Kuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Atm-/-+thymic+lymphoma+cell+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+by+dexamethasone.">Control of Atm-/- thymic lymphoma cell proliferation in vitro and in vivo by dexamethasone.</a> Cancer Chemother Pharmacol. 55, 203-212 (2005).</li><li>Browne, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+a+catalytic+antioxidant+corrects+the+neurobehavioral+defect+in+ataxia-telangiectasia+mice.">Treatment with a catalytic antioxidant corrects the neurobehavioral defect in ataxia-telangiectasia mice.</a> Free Radic Biol Med. 36, 938-942 (2004).</li><li>Jacks, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+spectrum+analysis+in+p53-mutant+mice.">Tumor spectrum analysis in p53-mutant mice.</a> Curr Biol. 4, 1-7 (1994).</li><li>Chervinsky, D. S., Lam, D. H., Zhao, X. F., Melman, M. P., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+T+cell+leukemia+cell+lines+established+from+SCL/LMO1+double+transgenic+mice.">Development and characterization of T cell leukemia cell lines established from SCL/LMO1 double transgenic mice.</a> Leukemia. 15, 141-147 (2001).</li><li>Sharma, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch1+contributes+to+mouse+T-cell+leukemia+by+directly+inducing+the+expression+of+c-myc.">Notch1 contributes to mouse T-cell leukemia by directly inducing the expression of c-myc.</a> Mol Cell Biol. 26, 8022-8031 (2006).</li><li>Maser, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomally+unstable+mouse+tumours+have+genomic+alterations+similar+to+diverse+human+cancers.">Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers.</a> Nature. 447, 966-971 (2007).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste protocolo, nós fornecemos os procedimentos detalhados para estabelecer murino de células T linhas de dois genótipos diferentes do mouse; Atm - / - [FVB/N- Atm tm1Led / J] p53 e - / - [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] . Usando esse protocolo, um total de 6 (de 7 tentativas) Atm - / - e três (de 5 tentativas) p53 - / - murino de células T linhas foram estabelecidas em nosso laboratório. Dad...

<ul><li> Balde de gelo </li><li> Etanol 70% </li><li> Pad dissecção consistindo de bloco de espuma coberto com papel alumínio e pinos </li><li> Dois conjuntos de pequenas tesouras e pinças esterilizadas, </li><li> Estéril 150 milímetros 2 Placa de Petri (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA;. Cat # 08-757-13) </li><li> 18 agulhas estéreis </li><li> 50 mL tubos cônicos (Corning Inc., Corning NY; cat # 430829) </li><li> 10% de formalina tamponada </li><li> Cultura de tecidos frascos <ul><li> T-25 (TPP, Trasadingen, Suíça; cat # 90025) </li><li> T-75 (TPP, Trasadingen, Suíça; cat # 90075) </li></ul></li><li> 6-lamelas (Corning Inc., Corning NY; cat # 3506) </li><li> Fosfato estéril tamponada pH 7,2 solução salina (PBS) </li><li> Meio de cultura <ul><li> RPMI 1640 com 25 HEPES mM, 200 mM L-glutamina (Lonza, Walkersville, MD; gato # 12-115F), suplementado com o seguinte: <ul><li> Calor de 10% inativado (56 ° C, 30 min) de soro fetal bovino (FBS; Hyclone, Logan, UT; # cat SH30088.03) </li><li> 1% de penicilina e estreptomicina (Mediatech, Manassas, VA; gato # 30-002-CI) </li><li> 1% aminoácidos não essenciais (Mediatech; gato # 25-025-CI) </li><li> 55 mM 2β-mercaptoetanol (Sigma, St Louis, MO; cat # M752) </li></ul></li></ul></li><li> Dimetil sulfóxido (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA; cat # 317275) </li><li> Anticorpos (eBioscience, San Diego, CA) <ul><li> anti-CD3-FITC (cat. # 11-0031-85) </li><li> anti-CD4-APC (cat. # 17-0041-83) </li><li> anti-CD8-PE (cat. # 12-081-85) </li></ul></li><li> Albumina sérica bovina (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY;. Cat # 11018-017) </li><li> Concanavalina A (Sigma cat # C5275) </li><li> 1,8 mL frascos de congelamento (Nunc, Roskilde, na Dinamarca; cat # 368632) </li></ul>

derivation of thymic lymphoma t-cell lines from atm-/- and p53-/- mice

As linhas celulares são uma ferramenta de pesquisa fundamental que pode reduzir o uso de animais de laboratório em pesquisa. Certas cepas de camundongos geneticamente modificados, tais como ATM - / - e p53 - / - consistentemente desenvolver linfoma tímico no início da vida 1,2, e, portanto, pode servir como uma fonte confiável para a derivação de células T murino linhas. Aqui apresentamos um protocolo detalhado para o desenvolvimento do timo murino estabelecida linfoma de células T linhas sem a necessidade de adicionar interleucinas, conforme descrito nos protocolos anteriores 1,3. Tumores foram colhidas de camundongos com idade entre três a seis meses, na primeira indicação de tumores visíveis a partir da observação da postura arqueada, trabalhou preparação respiração, pobres e desperdício em um 1,4 linhagem suscetível. Nós temos estabelecido com sucesso várias linhas de células T usando este protocolo e de estirpes puras e Atm - / - [FVB/N- Atm tm1Led / J] 2 e p53 - / - [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] 5 camundongos. Nós ainda demonstram que mais de 90% do estabelecido população de células T CD3 expressa, CD4 e CD8. Consistente com linhas de células de maneira estável estabelecida, as células-T gerados usando o protocolo presentes foram várias passagens por mais de um ano.

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Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Neste vídeo mostramos um protocolo para estabelecer linhagens de células do timo de rato linfoma. Ao seguir este protocolo, conseguimos estabelecer várias células T linhas de Atm-/ - e p53-/ - ratos com linfoma tímico.

Derivação de Tímico linfoma de células T Linhas de Atm - / -</sup E<emP53> - / -</sup Ratos

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

derivation-of-thymic-lymphoma-t-cell-lines-from-atm-and-p53-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

12.1K visualizações.  Cornell University. Neste vídeo mostramos um protocolo para estabelecer linhagens de células do timo de rato linfoma. Ao seguir este protocolo, conseguimos estabelecer várias células T linhas de Atm-/ - e p53-/ - ratos com linfoma tímico.

Derivação de Tímico linfoma de células T Linhas de Atm - / - E - / - Ratos

Derivação de Tímico linfoma de células T Linhas de Atm^{- / - E^{- / - Ratos}}