O financiamento para este trabalho foi fornecida pelas Ciências Naturais e Engenharia Council of Canada (NSERC) eo Sentinela Rede papel bioativo.

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A., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pH3DZ1+-+An+RNA-cleaving+deoxyribozyme+with+optimal+activity+at+pH+3.">Characterization of pH3DZ1 - An RNA-cleaving deoxyribozyme with optimal activity at pH 3.</a> Can. J. Chem. 85, 261-273 (2007).</li><li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+signaling+platforms+built+from+a+small+catalytic+DNA+and+doubly+labeled+fluorogenic+substrates.">Efficient signaling platforms built from a small catalytic DNA and doubly labeled fluorogenic substrates.</a> Nucleic Acids Res. 35, 401-405 (2007).</li><li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+fluorescent+sensors+engineered+with+catalytic+DNA+MgZ+based+on+a+non-classic+allosteric+design.">Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA MgZ based on a non-classic allosteric design.</a> PLoS ONE. 2, e1224 (2007).</li><li>Shen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrapment+of+fluorescence+signaling+DNA+enzymes+in+sol+gel-derived+materials+for+metal+ion+sensing.">Entrapment of fluorescence signaling DNA enzymes in sol gel-derived materials for metal ion sensing.</a> Anal. 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K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+selection+of+protein-binding+DNA+aptamers+as+ligands+for+biosensing+applications.">In vitro selection of protein-binding DNA aptamers as ligands for biosensing applications.</a> Methods Mol. Biol. 504, 399-415 (2009).</li><li>Ali, M. M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+sensing+by+using+allosteric-DNAzyme-coupled+rolling+circle+amplification+and+a+peptide+nucleic+acid-organic+dye+probe.">Colorimetric sensing by using allosteric-DNAzyme-coupled rolling circle amplification and a peptide nucleic acid-organic dye probe.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 3512-3515 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A maioria dos métodos de detecção de bactérias comuns hoje são ou lenta (microbiana clássico) ou tecnicamente exigentes (anticorpo, PCR). Assim, acreditamos que a próxima geração de ferramentas de detecção deve atender para velocidade e simplicidade. Para este fim, criámos um RNA-clivagem e fluorescência de sinalização DNAzyme que pode ser usado para desenvolver ensaios simples para relatar a presença de bactérias através da geração de um sinal de fluorescência. O destaque DNAzyme sonda, RFD-EC1, é ativado pela CEM produzido durante o crescimento de E. coli em meios de cultura. Uma vez que o nosso método utiliza bruto misturas extracelulares de uma bactéria como o alvo de detecção e ignora a extracção alvo trabalhoso e passos de amplificação, ele pode ser usado para definir-se muito simples, &quot;mistura-e-ler&quot; tipo de ensaios para a detecção de bactérias. A utilização da nossa DNAzyme não se restringe a método de detecção de fluorescência com base. Por exemplo, a detecção colorimétrica utilizando o mesmo sistema de ensaio c DNAzymeum ser concebido usando um método relatado anteriormente que explora a amplificação círculo rolante em conjunção com um pigmento orgânico. 32 Nós prever a utilização de DNAzymes para a detecção de bactérias como uma avenida atraente para gerar novos biossensores bacterianas com maior simplicidade operacional.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo ou modelo </td></tr><tr><td> Agar </td><td> BioShop Canadá </td><td> AGR003 </td></tr><tr><td> Persulfato de amônio (APS) </td><td> BioShop Canadá </td><td> AMP001 </td></tr><tr><td> Acrilamida / bis-acrilamida (40%, 29:1) </td><td> BioShop Canadá </td><td> ACR004 </td></tr><tr><td> Ácido bórico </td><td> BioShop Canadá </td><td> BOR001 </td></tr><tr><td> Azul de bromofenol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B8026 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> EM Science </td><td> EXO539-1 </td></tr><tr><td> HCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 38281 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Bioshop Canadá </td><td> HEP001 </td></tr><tr><td> Caldo LB </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L3022 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> EMDChemicals </td><td> B10149-34 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> BioShop Canadá </td><td> SOD002 </td></tr><tr><td> NaOAc </td><td> Merck Química </td><td> SXO255-1 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Merck Química </td><td> SXO590-1 </td></tr><tr><td> SDS </td><td> BioShop Canadá </td><td> SDS001 </td></tr><tr><td> Temed </td><td> BioShop Canadá </td><td> TEM001 </td></tr><tr><td> Tris-base </td><td> BioShop Canadá </td><td> BST666 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9416 </td></tr><tr><td> Uréia </td><td> BioShop Canadá </td><td> URE001 </td></tr><tr><td> Xylenecyanol FF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X4126 </td></tr><tr><td> Concentrador de DNA </td><td> Thermo Scientific </td><td> Savant DNA Speedvac 120 </td></tr><tr><td> Millex unidade de filtro </td><td> Millipore </td><td> SLGP033RS </td></tr><tr><td> Dicas para a colocação de gel </td&gt; <td> DiaMed </td><td> TEC200EX-K </td></tr><tr><td> Software ImageQuant </td><td> Dinâmica Molecular </td><td> Versão 5.0 </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Kimberly-Clark Professional </td><td> 34705 </td></tr><tr><td> Mini Vortexer </td><td> VWR </td><td> 58816-121 </td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Pechiney Embalagens Plásticas </td><td> PM996 </td></tr><tr><td> As placas de Petri </td><td> Fisher Scientific </td><td> Fisherbrand 08-757-12 </td></tr><tr><td> Stripettor Plus (Pipetar arma) </td><td> Corning </td><td> 07764714 </td></tr><tr><td> Cubetas de quartzo </td><td> Varian Inc </td><td> 66-100216-00 </td></tr><tr><td> Shaker / Incubadora </td><td> New Brunswick Scientific </td><td> Série Classic C24 </td></tr><tr><td> Typhoon Scanner </td><td> GE Healthcare </td><td> 9200 modo variável </td></tr><tr><td> Centrifugar </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra X22-R </td></tr><tr><td> Espectrofotômetro UV </td><td> Thermo Scientific </td><td> GenesysUV 10 </td></tr><tr><td> Espectrofotômetro de Fluorescência </td><td> Varian Inc </td><td> Cary Eclipse </td></tr></tbody></table>

detection of bacteria using fluorogenic dnazymes

Surtos ligados à transmitidas por alimentos e hospitalar e para conta de patógenos por milhões de mortes e internações, bem como colossais perdas econômicas a cada ano. Prevenção da ocorrência de tais surtos e minimização do impacto de um lugar epidemia em curso uma demanda cada vez maior de métodos analíticos que podem identificar com precisão patógenos culpado na primeira fase. Embora exista uma grande variedade de métodos eficazes para a detecção de patógenos, nenhum deles pode satisfazer todos os seguintes cinco requisitos principais incorporados por um método de detecção ideal: alta especificidade (detectando apenas a bactéria de interesse), de alta sensibilidade (capaz de detectar como baixa como uma célula viva único bacteriana), curto tempo-para-resultados (de minutos a horas), grande simplicidade operacional (sem necessidade de procedimentos de amostragem longos eo uso de equipamentos especializados), e rentabilidade. Por exemplo, de métodos microbiológicos clássicos são altamente específico, mas requer um tempo longo (days para semanas) para adquirir um resultado definitivo. 1 PCR e anticorpo de técnicas baseadas em oferecer os tempos de espera mais curtos (horas a dias), mas requerem a utilização de reagentes dispendiosos e / ou equipamento sofisticado. 2-4 Consequentemente, existe ainda uma grande demanda para a pesquisa científica para o desenvolvimento de inovadores métodos de detecção de bactérias que oferecem características melhoradas em um ou mais dos requisitos acima referidos. Nosso laboratório está interessado em examinar o potencial de DNAzymes como uma nova classe de sondas moleculares para aplicações biosensoriamento incluindo a detecção de bactérias 5. DNAzymes (também conhecido como deoxyribozymes ou enzimas de ADN) são feitas pelo homem moléculas de cadeia simples de ADN com a capacidade de catalisar reacções químicas. 6-8 Estas moléculas podem ser isoladas a partir de uma piscina de DNA vasta sequência aleatória (que contém até 10 16 seqüências individuais) por um processo conhecido como &quot;seleção in vitro&quot; or &quot;SELEX&quot; (evolução sistemática de ligantes por enriquecimento exponencial). 9-16 Estas moléculas de DNA especiais têm sido amplamente analisados ​​nos últimos anos como ferramentas moleculares para aplicações biosensoriamento 6-8. O nosso laboratório estabeleceu em procedimentos de selecção in vitro para isolar RNA-clivagem DNAzymes fluorescentes (RFDs;. Fig. 1) e investigou a utilização de RFDs como ferramentas analíticas 17-29 RFDs catalisar a clivagem de um substrato de ADN RNA-quimérico em um ribonucleótido único. junção (R) que é flanqueada por um fluoróforo (F) e um supressor (Q). A proximidade estreita do F e Q processa a fluorescência do substrato não clivado mínima. No entanto, o evento de clivagem conduz à separação de F e Q, o qual é acompanhado por um aumento significativo da intensidade de fluorescência. Mais recentemente, foi desenvolvido um método de isolar RFDs para a detecção de bactérias. 5 Estes RFDs especiais foram isolados para &quot;acender &quot;, na presença da mistura em bruto extracelular (CEM) deixado para trás por um tipo específico de bactérias no seu ambiente ou nos meios de comunicação que são cultivadas (Fig. 1). A utilização de mistura bruta contorna o tedioso processo de purificação e a identificação de um alvo adequado a partir do micróbio de interesse para o desenvolvimento de biossensores (que poderia levar meses ou anos para completar). A utilização de alvos extracelulares, o procedimento ensaio é simples porque não há necessidade de passos para obter alvos intracelulares. Usando o método acima, nós derivado uma RFD que cliva o seu substrato (FS1;. Fig. 2A) apenas na presença do CEM produzido por E. coli (CEM-CE). 5 Este E. coli com detecção RFD, chamado RFD-EC1 (Fig. 2A), foi encontrada a ser estritamente responsivo a CEM-CE, mas não responsiva ao CEM a partir de um hospedeiro de outras bactérias (Fig. 3). Aqui nós Present os procedimentos fundamentais experimentais para criação de E. coli ensaios de detecção utilizando resultados de RFD-EC1 e representativa.

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Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Recentemente, relatou uma nova abordagem para a geração de sondas DNAzyme fluorogênicos que podem ser aplicadas para criar um simples, &quot;mistura-e-ler&quot; teste de fluorescência para a detecção bacteriana. Estas sondas de DNA especiais catalisar a clivagem de um cromóforo-modificado substrato DNA-RNA quimérico, na presença de mistura extracelular em bruto (CEM) produzida por uma bactéria específica, assim, traduzindo a detecção de bactérias em geração do sinal de fluorescência. Neste relatório, irá descrever-chave procedimentos experimentais onde uma sonda específica DNAzyme denotado &quot;RFD-EC1&quot; é utilizado para a detecção da bactéria modelo,<em&gt; Escherichia coli (E. coli)</em&gt;.

Detecção de bactérias utilizando DNAzymes fluorogénicas

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

detection-of-bacteria-using-fluorogenic-dnazymes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.7K visualizações.  McMaster University. Recentemente, relatou uma nova abordagem para a geração de sondas DNAzyme fluorogênicos que podem ser aplicadas para criar um simples, "mistura-e-ler" teste de fluorescência para a detecção bacteriana. Estas sondas de DNA especiais catalisar a clivagem de um cromóforo-modificado substrato DNA-RNA quimérico, na presença de mistura extracelular em bruto (CEM) produzida por uma bactéria específica, assim, traduzindo a detecção de bactérias em geraçã...