1. Preparação do Epitélio Transplant Tecido do doador frescos ou congelados epitelial pode ser transplantado para a almofada limpa de gordura, mas a preparação prévia do epitélio do doador congelado é mais conveniente, com uma redução mínima na eficiência de transplante (&gt; 85% de eficiência). O protocolo para a preparação do epitélio do doador congelados é a seguinte: Antes de preparar epitélio transplante de doadores, preparar a mídia congelar por epitélio e alíquota sobre 1ml em criotubos. Isto pode ser armazenado a 4 ° C por até seis meses até ser necessário. Congelamento de mídia contém DMEM/F12 media tamponado com HEPES e NaHCO 3, 10% de soro fetal bovino (FBS) e 10% de dimetil sulfóxido (DMSO). Colheita epitélio mamário de um rato recentemente sacrificados feminino. <ol><li> Lavar o mouse com EtOH 70%. </li><li> Faça um corte médio-sagital através da parede do corpo que se estende do púbis ao esterno sem perfurar a membrana serosa da cavidade do corpo ventral. Faça um corte oblíquo da incisão inicial no púbis em direção à perna (Figura 1). </li><li> Descasque a parede do corpo longe da serosas para expor a 5 ª glândula mamária inguinal presos na fáscia sobre a parte inferior da parede do corpo. A melhor maneira de conseguir isto é agarrar as membranas serosas cuidado com a porção curvada de um par de fórceps curvos, tomando cuidado para não perfurar a cavidade do corpo ventral. Simultaneamente, segure a borda do corte do tegumento com uma pinça reta serrilhada e puxe a parede do corpo de distância da membrana serosa. </li><li> Identificar o linfonodo dentro da glândula mamária. Linfonodo está localizado na intersecção de três vasos sangüíneos proeminentes na glândula mamária e pode ser sentida como um nódulo denso dentro do bloco de gordura (Figura 2). Com a ponta de uma tesoura olho, o tecido adiposo em torno cortar o nó. Com um dedo frente no lado epidérmico da pele, aplicar uma pressão para aumentar a saída do nó da gordura abdominal e comprima-o com um par de pinças curvas. Descartar o nó de linfa. </li><li> , Mantendo as margens da pele, segure a almofada de gordura mamária com a borda curvada de um par de pinças curvas e, gradualmente, a almofada de gordura casca de distância da parede do corpo. Siga a direção da gordura abdominal para a superfície dorsal do rato como você remover toda a glândula mamária em uma única peça. </li><li> Coloque a glândula mamária em um bloco de plástico estéril de corte. Adicionar uma pequena quantidade de media, cerca de 200 mL, para a superfície da glândula para mantê-lo úmido. Picar a glândula em pedaços 1 milímetro com uma lâmina de barbear fresco. Divide a glândula picada em quatro partes e distribua entre quatro criotubos de mídia congelar com uma pinça. Coloque o criotubos em um &quot;Mr. Frosty Nalgene freezer célula que tem 250ml de álcool isopropílico no compartimento exterior. Coloque no congelador Nalgene em um freezer -70 ° C por 24 horas. Loja frascos de fragmentos congelados em nitrogênio líquido mamário até ser necessário para transplante. Cada cryovial irá conter fragmentos das glândulas mamárias para transplante o suficiente para as almofadas limpas de gordura de 4-8 camundongos host. </li></ol> 2. Preparação das células de Transplante Nosso laboratório tem transplantado tipos de células diferentes, incluindo imortalizado mamárias linhagens de células epiteliais, mamárias linhagens de células tumorais ou células primárias de mama em um mouse pad limpo de gordura. O protocolo para a preparação de Comma-D células para transplante é a seguinte: <ol><li> Comma-D células são cultivadas em meios regulares MECL contendo DMEM: F12 suplementado com 2% soro de bovino adulto (ABS), mEGF, insulina, antibiótico / antimicótico (AB / AM). </li><li> Colheita Comma D-células quando as células são 85% -90% confluentes. </li><li> Centrifugar a suspensão de células em 1200rpm por 5 minutos para sedimentar as células. Ressuspender as células em novas mídias MECL e ajustar a concentração de células de 5 x 10 6 / ml. </li></ol> Para o transplante de células primárias de mama, a principal células epiteliais mamárias são isolados de rato 5 º glândulas mamárias através da dissociação mecânica e enzimática. Células são ressuspendidas em DMEM: F12 mídia e ajustado para a concentração desejada, geralmente 5 x 10 6 / ml. 3. Procedimento padrão para Limpar o Mouse Pad mamária Fat <ol><li> Anestesiar a três semanas do mouse host antigo. Selecione os ratos que são &lt;12 g para garantir que o crescimento ductal mamária não foi iniciada. Usamos 200mg/kg de peso corporal de 2,2,2 tribromoetanol. </li><li> Depois que o mouse está anestesiado, firmemente conter o mouse, lado ventral com os braços estendidos, em um estágio cirúrgico para que o abdômen é provocação. Antes da cirurgia, administrar analgésicos; ou bupivacaína (1mg/kg &lt;) ou buprenorfina (0.05mg/kg), por via subcutânea. </li><li> Segure a pele com uma pinça alguns milímetros acima da pélvis e levante-o do abdômen<html> . Nip a pele com uma tesoura e fazer um corte médio-sagital através da parede do corpo que se estende do púbis ao esterno. Não furar as membranas serosas da cavidade do corpo ventral. Não faça sua incisão inicial muito perto da uretra de modo que grampos de sutura não irá interferir com a capacidade dos camundongos para urinar. </li><li> Da incisão inicial, fazer cortes oblíquos através da pele a partir de meados-line através da pelve para cada perna. </li><li> Use a área de curvas do fórceps curvas para agarrar o delicadamente membranas serosas. Use uma pinça para agarrar a margem de corte da pele e puxe a parede do corpo longe da serosas e expor a 5 ª glândula mamária inguinal localizado na fáscia sobre a parte inferior da parede do corpo. </li><li> Cauterizar o mamilo nó, e duas artérias que conduzem ao nó (Figura 2) </li><li> Separe as glândulas quarto e quinto. Cauterizar a margem da glândula quinta para evitar ingrowth da glândula 6 º. </li><li> Divide a almofada de gordura na glândula mamária por quarto cortando a almofada de gordura com uma tesoura apenas ventral (lado para o mamilo) do nó. Use pinças curvas para agarrar firme a porção ventral da gordura abdominal e puxe-o para longe da parede do corpo em uma só peça. Pressione a porção ventral da almofada de gordura entre dois slides e colocar em um prato de vidro coloração histologia contendo fixador de Carnoy. Este tecido será fixado e corado posteriormente com solução de carmim alum para verificar se as margens limpas (Figura 3). Limpe a fascia em torno da região da porção removida do bloco de gordura para remover todos os vestígios da glândula mamária com o fórceps curvos. </li></ol> 4. Procedimento &quot;alternativa Sparing para Limpar a gordura abdominal Depois tornou-se um competente com o procedimento padrão para limpar o mouse pad mamárias de gordura, eles podem preferir tentar poupar o procedimento menos invasivo desenvolvido por Brill et al. (2008) 2. <ol><li> Prepare o mouse como para o procedimento padrão. </li><li> Segure o mamilo da glândula mamária inguinal quarto e cortar um círculo de circunferência de 3-5 mm em torno do mamilo com a ponta da tesoura. </li><li> Puxar o mamilo para fora do corpo para separar a parte cortada da pele e tirar a glândula mamária inguinal quarto para fora através do furo. </li><li> Identificar o nó. Use o cautério para cauterizar o nó ea glândula mamária 6 º pelo buraco. </li><li> Corte e retire a parte mais superficial da glândula mamária 5 º, antes do nó. O mamilo área circular de pele e parte do epitélio mamário de gordura contendo pad são removidos em uma única peça. </li></ol> 5. Tecido / Cell Transplantation <ol><li> Para fragmentos de epitélio transplante, degelo cryovial um do epitélio e transferir os restos epiteliais de uma placa de Petri contendo meio fresco para diluir o DMSO. Faça um pequeno furo ou no bolso no bloco limpo de gordura com a ponta tesoura para o novo epitélio. Coloque um pedaço um milímetro do epitélio do doador para o bolso com uma pinça agulha. Segure o bolso fechado com uma pinça como você retirar a pinça agulha de modo que o tecido permanece no local. </li><li> Para as células do transplante, injetar 50.000 células em 10 ml de mídia em cada almofada de gordura, utilizando uma seringa Hamilton 50μl com uma agulha de calibre 22s. </li></ol> 6. Fechamento / Revival of Mouse <ol><li> Organizar a pele para o fechamento. Segure margens opostas da pele, mantê-los juntos com uma pinça, levantá-los longe das membranas serosas da cavidade do corpo ventral e fechar com clips ferida. Normalmente, é necessário usar dois clips para fechar a incisão médio-sagital e um clip para cada incisão oblíqua para o procedimento padrão. Evitar a obstrução da uretra. Pode ser necessário para fechar as lacunas na pele, na intersecção das incisões médio-sagital e oblíqua com uma sutura. O procedimento poupador irá necessitar apenas de um clipe de feridas para cada lado. </li><li> . Posicione o mouse em sua gaiola e manter a gaiola sob uma lâmpada de aquecimento até que o mouse tem revivido. </li><li> Os grampos de sutura deve ser removida após 2 semanas. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Demonstração do padrão de incisão. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Localização do nó de linfa, vasos sanguíneos, mamilo e epitélio endógena. Cauterize em locais indicados. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Montar Whole demonstra que o epitélio endógena é restrita à área dentro do círculo e, portanto, as margens são &quot;claros&quot;. 7. Resultados representante _r.jpg &quot;alt =&quot; Figura 4 &quot;/&gt; Figura 4. Whole montagem de almofada de gordura removida do mouse de 3 semanas de idade mostrando margens limpas. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2_r.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Whole montagem de um rato de 10 semanas de idade mostrando almofada de gordura livre de epitélio mamário endógena. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3_r.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Hematoxilina e eosina seção manchada de uma almofada limpa de gordura de um mouse de 10 semanas de idade. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig4_r.jpg" alt="Figura 7" /> Figura 7. Whole montagem de um rato de 10 semanas de idade mostrando árvore ductal mamário normal desenvolvido a partir do epitélio transplantado. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig5_r.jpg" alt="Figura 8" /> Figura 8. Hematoxilina e eosina seção manchada de ductos mamários desenvolvido a partir do epitélio transplantado. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig6_r.jpg" alt="Figura 9" /> Figura 9. Hematoxilina e eosina seção manchada de um tumor mamário desenvolvido a partir do epitélio transplantado.

<ol>
	<li>DeOme, K. B., Faulkin, L. J., Bern, H. A., Blair, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+mammary+tumors+from+hyperplastic+alveolar+nodules+transplanted+into+gland-free+mammary+fat+pads+of+female+C3H+mice.">Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice.</a> Cancer Res. 19, 515-520 (1959).</li><li>Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sparing+procedure+to+clear+the+mouse+mammary+fat+pad+of+epithelial+components+for+transplantation+analysis.">A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis.</a> Laboratory Animals. 42, 104-110 (2008).</li><li>Jerry, D. J., Kittrell, F. S., Kuperwasser, C., Laucirica, R., Dickinson, E. S., Bonilla, P. J., Butel, J. S., Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammary-specific+model+demonstrates+the+role+of+the+p53+tumor+suppressor+gene+in+tumor+development.">A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development.</a> Oncogene. 19, 1052-1058 (2000).</li><li>Shackleton, M., Vaillant, F., Simpson, K. J., Stingl, J., Smyth, G. K., Asselin-Labat, M. -. L., Wu, L., Lindman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell.">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439, 84-88 (2006).</li><li>Stingl, J., Eirew, P., Ricketson, I., Shackleton, M., Vaillant, F., Choi, D., Li, H. I., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells.">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439, 993-997 (2006).</li><li>Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preneoplastic+Lesions+in+Murine+Mammary+Cancer.">Preneoplastic Lesions in Murine Mammary Cancer.</a> Cancer Res. 36, 2589-2595 (1976).</li><li>Wagner, K. -. U., Boulanger, C. A., Henry, S. g. a. g. i. a. s., Hennighausen, M., Smith, G. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adjunct+mammary+epithelial+cell+population+in+parous+females:+its+role+in+functional+adaptation+and+tissue+renewal.">An adjunct mammary epithelial cell population in parous females: its role in functional adaptation and tissue renewal.</a> Development. 129, 1377-1386 (2002).</li><li>Dunphy, K. A., Blackburn, A. C., Haoheng, Y., O Connell, L. R., Jerry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+and+progesterone+induce+persistent+increases+in+p53-dependent+apoptosis+and+suppress+mammary+tumors+in+BALB/c-Trp53+/-+mice.">Estrogen and progesterone induce persistent increases in p53-dependent apoptosis and suppress mammary tumors in BALB/c-Trp53+/- mice.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R43-R43 (2008).</li></ol>

Neste relatório, apresentamos dois métodos alternativos para limpar o mouse pad mamárias de gordura na preparação para transplantes mamárias epiteliais. O procedimento padrão tem sido em uso desde o seu desenvolvimento em 1959 por DeOme et al. 1 Enquanto mais invasivo, o método padrão é o método preferido para treinar o novato porque a estrutura e orientação da glândula mamária são facilmente visualizadas. No entanto, o procedimento poupador pode ser preferido pelo cirurgião mais exp...

mammary epithelial transplant procedure

Este artigo descreve e compara o processo de apuramento de gordura pad desenvolvido pela DeOme KB et al. 1 e poupando o procedimento desenvolvido por Brill B et al. 2, seguido pelo procedimento de transplante mamárias epiteliais. O procedimento de transplante de mama é amplamente utilizado por biólogos mamárias porque ele tira vantagem do fato de que um maior desenvolvimento do epitélio mamário não ocorre até depois da puberdade. Menos 3 semanas de idade, o crescimento da árvore mamárias epiteliais se limita à vizinhança do mamilo ea almofada de gordura é em grande parte desprovida de epitélio mamário, mas por sete semanas de idade da árvore do epitélio ductal se estende por todo o bloco inteiro de gordura. Portanto, se esta pequena porção do bloco de gordura contendo epitélio, na região entre o mamilo eo nó de linfa, é removida a 3 semanas de idade, o epitélio endógena nunca vai preencher o pad mamárias gordura ea gordura abdominal é descrita como &quot;apagada &quot;. Neste momento, epitélio mamário de outra fonte pode ser transplantado no bloco limpo de gordura onde ela tem o potencial para estender mamário ductal árvores por todo o bloco de gordura. Este procedimento tem sido utilizado em muitos modelos experimentais, incluindo a análise do fenótipo de tumor no tecido mamário transgênicos epiteliais sem os efeitos de confusão do genótipo sobre todo o animal 3, na identificação de células-tronco mamário através do transplante de células em diluição limite de 4,5, determinando se nodules hyperplastic proceder para tumores mamários 6, e para avaliar o efeito da exposição a hormônios prévio sobre o comportamento do epitélio mamário 7,8. Três semanas os ratos são anestesiados anfitrião velho, limpo e contido em um estágio cirúrgico. Uma incisão médio-sagital é feita através da pele, mas não o peritônio, que se estende do púbis ao esterno. Cortes oblíquos são feitas através da pele da incisão médio-sagital do outro lado da pelve para cada perna. A pele é puxada para longe do peritônio para expor a glândula mamária inguinal 4. A gordura abdominal é limpo com a remoção do tecido adiposo anterior pad para o nó de linfa. Fragmentos de epitélio ou células epiteliais são transplantadas para o teclado limpo restantes gordura eo mouse está fechado.

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Mammary Epithelial Transplant Procedure

Este artigo demonstra o procedimento desenvolvido por DeOme KB<em&gt; Et al.</em&gt; (1959) eo procedimento poupando desenvolvido pela Brill B<em&gt; Et al.</em&gt; (2008) para limpar o quarto bloco de gordura mamária inguinal de um rato púbere em preparação para o transplante de fragmentos mamários, células epiteliais mamárias, ou nas células mamárias tumor.

Procedimento de transplante do epitélio mamário

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Research

JoVE Journal

Biology

30.9K visualizações.  University of Massachussetts. Este artigo demonstra o procedimento desenvolvido por DeOme KB Et al. (1959) eo procedimento poupando desenvolvido pela Brill B Et al. (2008) para limpar o quarto bloco de gordura mamária inguinal de um rato púbere em preparação para o transplante de fragmentos mamários, células epiteliais mamárias, ou nas células mamárias tumor.

Vídeo: Mammary Epithelial Transplant Procedure

Investigating the Immunological Mechanisms Underlying Organ Transplant Rejection

Mecanismos imunológicos investigando a rejeição do transplante de órgãos Subjacente

Biologia

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Rato células epiteliais mamárias forma Mammospheres durante a diferenciação lactogênica

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

In the last decade, intravital microscopy of breast tumors in mice and rats at single-cell resolution1-4 has resulted in important insights into mechanisms of metastatic behavior such as migration, invasion and intravasation of tumor cells5, 6, angiogenesis3 and immune cells response7-9. We have recently reported a technique to image orthotopic mammary carcinomas over multiple intravital imaging sessions in living mice10. For this, we have developed a Mammary Imaging Window (MIW) and optimized imaging parameters for Dendra211 photoswitching and imaging in vivo. Here, we describe the protocol for the manufacturing of MIW, insertion of the MIW on top of a tumor and imaging of the Dendra2- labeled tumor cells using a custom built imaging box. This protocol can be used to image the metastatic behavior of tumor cells in distinct microenvironments in tumors and allows for long term imaging of blood vessels, tumor cells and host cells.

Intravital photoswitching and tracking of Dendra2-labeled tumor cells through the Mammary Imaging Window is a technique which allows us to image the metastatic behavior of tumor cells in chosen tumor microenvironments over a timescale of days.

Dendra2 Photoswitching através da janela de imagem mamária

In the last decade, intravital microscopy of breast tumors in mice and rats at single-cell resolution1-4  has resulted in important insights into ...

Right Hemihepatectomy by Suprahilar Intrahepatic Transection of the Right Hemipedicle using a Vascular Stapler

Successful hepatic resection requires profound anatomical knowledge and delicate surgical technique. Hemihepatectomies are mostly performed after preparing the extrahepatic hilar structures within the hepatoduodenal ligament, even in benign tumours or liver metastasis.1-5. Regional extrahepatic lymphadenectomy is an oncological standard in hilar cholangiocarcinoma, intrahepatic cholangio-cellular carcinoma and hepatocellular carcinoma, whereas lymph node metastases in the hepatic hilus in patients with liver metastasis are rarely occult. Major disadvantages of these procedures are the complex preparation of the hilus with the risk of injuring contralateral structures and the possibility of bleeding from portal vein side-branches or impaired perfusion of bile ducts. We developed a technique of right hemihepatectomy or resection of the left lateral segments with intrahepatic transection of the pedicle that leaves the hepatoduodenal ligament completely untouched. 6 However, if intraoperative visualization or palpation of the ligament is suspicious for tumor infiltration or lymph node metastasis, the hilus should be explored and a lymphadenectomy performed.

This video describes a right hemihepatectomy with intrahepatic transection of the right hemipedicle leaving the hepatoduodenal ligament completely untouched.

Hemihepatectomy direito por Transecção intra-hepática Suprahilar do Hemipedicle direito usando um grampeador Vascular

Successful hepatic resection requires profound anatomical knowledge and delicate surgical technique. Hemihepatectomies are mostly performed after ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Determinação tecido Usando o Transplante Cap Animal (ACT) em Ensaio Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

Avaliação do desenvolvimento da glândula mamária e Função em modelos de ratos

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

Isolamento de células epiteliais mamárias de tridimensional Mixed-célula esferoidal co-cultura

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Isolamento de cromatina por purificação de RNA (CHIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Análise Genética rápida de epitelial-mesenquimal sinalização durante a regeneração do cabelo

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Método cryosectioning para Microdissection de Murino Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...