Este protocolo tem sido usado por mais de 40 anos e continua sendo o único método confiável para ensaios de transplante de células mamárias no rato. Este método é amplamente utilizado para interrogar efeitos autônomos de células mamárias versus hospedeiros na pesquisa de suscetibilidade ao câncer de mama. Ao enxertar na almofada de gordura interscapular, este método contorna ter que limpar o epitélio de membrana endógena que não é eficaz em ratos.
O método é, portanto, menos invasivo e as glândulas mamárias endógenas podem ser usadas como controle interno. Para começar este procedimento, coloque um rato fêmea eutanizado em suas costas e fixe-o com pinos. Pulverize toda a superfície ventral com 70% de etanol.
Faça uma incisão em forma de Y sagital permitindo o acesso a glândulas mamárias torácicas, abdominais e inguinais. Use uma tesoura para dissecar todo o tecido mamário da glândula mamária do rato doador e remover todos os linfonodos visíveis. Em seguida, use fórceps para extrair o tecido mamário.
Coloque-o em um prato de 60 milímetros rotulado contendo 500 microliters de mídia DMEM F12 sem soro e mantenha-o no gelo. Em seguida, use uma tesoura para picar finamente o tecido mamário. Primeiro, vire cuidadosamente o corpo do animal doador para colocá-lo em uma posição propensa e fixá-lo com pinos.
Pulverize a cabeça e a parte superior das costas com 70% de etanol. Localize a base do crânio e faça uma incisão sob os condyles occipitais, insira tesouras afiadas sob a pele e corte a pele longe do crânio, incluindo os lados da cabeça. Em seguida, use cortadores ósseos ou tesouras fortes para cortar o crânio ao longo da linha média do occipital para os ossos frontais, certificando-se de manter a lâmina o mais superficial possível e inclinada para cima para evitar a destruição do tecido cerebral subjacente.
Use Rongeurs ou fórceps fortes para descascar o osso. Insira a ferramenta lateral ao cerebelo para quebrar o osso de ambos os lados. Corte as conexões com as meninges expondo totalmente o canal auditivo.
Use fórceps de ponta fina curvas para levantar o cérebro do crânio e registrar seu peso. Use um novo começo de suprimentos para cérebros de doadores adicionais. Transfira imediatamente para um tubo de 15 mililitros contendo uma quantidade igual de mídia armazenada no gelo.
Homogeneize o cérebro por 10 a 15 segundos em baixa velocidade. Em seguida, filtrar o homogeneado para remover peças grandes. Guarde o líquido no gelo até que seja necessário.
Primeiro, corte um centímetro da extremidade de uma ponta de pipeta de 1.000 microliteres e coloque-a manualmente no pipettor. Use uma ponta de pipeta cortada para transferir o tecido doador picado de cada prato de 60 milímetros para o tubo de digestão da colagemnase. Misture suavemente o tecido picado, pipetando-o para cima e para baixo uma a duas vezes.
Em seguida, fixe as amostras em uma posição horizontal na incubadora de agitação. Deixe as amostras digerirem por 1,5 a 2 horas a 37 graus Celsius enquanto tremem a uma velocidade entre 200 e 220 RPM. Quando o tecido mamário doador estiver totalmente digerido, centrifute a suspensão a 1.200 vezes g e a 4 graus Celsius por 10 minutos.
Depois de garantir que uma pelota tenha se formado, use uma pipeta para remover a camada de gordura ou despeje cuidadosamente o sobrenante. Levemente resuspenque a pelota em 10 mililitros de mídia DMEM F12 fresca. Repita este processo para lavar completamente as células.
Prepare um tubo de 50 mililitros com um coador de 40 micrômetros para cada animal doador. Pré-molhar o coador com pelo menos um mililitro de mídia DMEM F12. Em seguida, use uma pipeta para passar a suspensão celular através do filtro para coletar fragmentos ductais ou organoides.
Para organoides, mantenha apenas as células que permanecem no filtro. Inverta o coador celular sobre um novo tubo de 50 mililitros e enxágue com qualquer volume de mídia estéril necessária para coletar todas as células. Depois disso, pelota as células mais uma vez e resuspend em um pequeno volume de mídia para contar.
Prepare lotes únicos de material doador para todos os receptores transplantados, combinando volumes iguais da suspensão celular com homogeneização cerebral de 50% para cada local de transplante. Primeiro, identifique a base do crânio e o início da coluna vertebral em um animal receptor. Aproximadamente um terço do caminho para baixo da coluna vertebral, raspe um centímetro por dois centímetros de área na parte torácica superior da parte de trás.
Em seguida, prepare o campo estéril que será usado para cirurgia e providencie todos os suprimentos necessários. Lave as seringas Hamilton com mídia Estéril DMEM F12 para evitar a perda de células. Carregue todo o volume do material doador em uma seringa separada para cada condição.
Depois que a seringa estiver totalmente carregada, inverta-a e pressione ligeiramente o êmbolo para remover bolhas de ar na ponta da agulha. Mantenha a seringa no gelo durante todo o procedimento. Certifique-se de que o animal permanece sem resposta a estímulos profundos com uma pitada firme do dedo do dedo do dedo.
Em seguida, use uma lâmina cirúrgica afiada para fazer uma pequena incisão interscapular. Localize o vaso sanguíneo medial para orientação e use fórceps para levantar a pele de um lado da incisão. Segure a pele longe da almofada de gordura e evite a gordura marrom subjacente enquanto o transplante é realizado.
Em seguida, insira a agulha no local do enxerto. Injete cuidadosamente 40 microliters da mistura celular no tecido da almofada de gordura branca interscapular. Remova a agulha lentamente.
Mantenha o tecido no lugar e permita que as células transplantadas se acomodem por três a cinco segundos. Repita todo o procedimento de injeção como descrito anteriormente no segundo local do transplante. Depois disso, feche a ferida cirúrgica usando clipes ou suturas de ferida e, em seguida, interrompa a anestesia.
Depois de sacrificar o animal, prepare-o para dissecção. Identifique o vaso sanguíneo medial que separa os locais de enxerto na almofada de gordura interscapular. Extir essa almofada inteira como um único pedaço de tecido.
Coloque o tecido em um slide de microscópio carregado positivamente para toda a montagem. Coloque os slides em 70% de etanol por sete a 10 dias para desarngodar o tecido. Em seguida, prepare a mancha de carmim de alum e processe as lâminas quando o tecido estiver suficientemente opaco.
Quando o processamento estiver concluído e o tecido na lâmina for liberado, use microscopia de luz de baixa potência ou fotografia digital de alta resolução para adquirir imagens dos slides para análise. Neste estudo, as células epiteliais mamárias são transplantadas usando uma técnica otimizada para trabalhar com ratos onde os organoides epiteliais mamários isolados de ratos doadores são enxertados no bloco de gordura branco interscapular de ratos receptores. A presença, ausência ou abundância de epitélio podem ser avaliadas para determinar o sucesso do experimento, bem como a autonomia dos efeitos relacionados às variáveis experimentais.
Um experimento de transplante recíproco onde cada fator tem dois níveis, como tipo selvagem versus nocaute, criará quatro grupos de transplante para testes de hipóteses. Toda a almofada de gordura interscapular montada representativa mostrada aqui contém crescimento epitelial positivo em ambos os locais de transplante. Ao analisar os slides, a falta de epitélio na almofada de gordura interscapular em muitas amostras pode indicar um problema técnico com o procedimento e deve ser tratada como um desfecho negativo.
O crescimento epitelial do doador também pode ser comparado com a glândula mamária endógena e pode facilitar conclusões adicionais. No exemplo aqui mostrado, os resultados do transplante recíproco usando tipo selvagem e ratos nocauteados CDKN1B sugeriram efeitos autônomos de células não mamárias no desenvolvimento da glândula mamária. Lembre-se que as células epiteliais e organoides do doador devem ser preparados cuidadosamente e mantidos vivos até serem injetados no animal receptor.
É imprescindível planejar com antecedência e realizar o procedimento com cuidado e sem interrupções. Ensaios de carcinogênese primária podem ser realizados após transplante para interrogar a autonomia das células mamárias na etiologia ou tratamento do câncer de mama. A edição de genes também pode ser incorporada para projetar geneticamente as células doadoras ou o rato receptor.
Como único método de realização do transplante de células epiteliais mamárias em ratos, este procedimento facilita o desenvolvimento da glândula mamária, bem como estudos de carcinogênese. Esta técnica é particularmente importante para a pesquisa de interações entre células cancerígenas de mama e/ou células epiteliais mamárias com o microambiente hospedeiro. Permite estudos em desenvolvimento de glândulas mamárias, bem como pesquisas sobre câncer de mama.
Aqueles que tentam essa técnica pela primeira vez devem otimizar as preparações celulares doadoras para garantir o rendimento e a viabilidade das células máximas, em seguida, realizar pequenos experimentos piloto para praticar procedimentos cirúrgicos e determinar números de células para injetar e também determinar os tempos de incubação pós-cirúrgico necessários para experimentos.
