Este trabalho foi financiado por uma subvenção (OPP1015402) da Fundação Bill e Melinda Gates Foundation através da Iniciativa Grande Challenges Explorations, e pelo NIH por meio de doações GM062958-01 e 2R01EB002046. Este trabalho foi realizado em parte sob os auspícios do Departamento de Energia dos EUA por Lawrence Livermore National Laboratory no âmbito do contrato DE-AC52-07NA27344.

1. Montando o Palco <ol><li> Compra relevante, DNA sonda quimicamente modificados de uma empresa de costume oligonucleotídeo síntese, tais como Biosearch Technologies (Novato, CA) ou Certified Midland (Midland, TX). A sonda é modificado durante a síntese pela adição de um tiol C6 em sua extremidade 3&#39;-e um azul de metileno redox-ativo em sua extremidade 5&#39;-. </li><li> Dissolver o DNA da sonda em tampão fosfato salina pH 7,4 para uma concentração de 200 mM e verificar a sua concentração, medindo sua absorbância a 260 nm usando um espectrofotômetro. Devido à molécula de azul de metileno na sonda de DNA a solução deve ter uma coloração azul visível. </li><li> Recém preparar 1 mL de uma solução de 10 mM de tris (2-carboxietil) fosfina TCEP em água destilada deionizada (DI-água). Em nossa experiência, essas soluções TCEP permanecem frescos por uma semana quando armazenado no escuro a 4 ° C. </li><li> Para reduzir qualquer pontes dissulfeto que podem estar presentes na solução de DNA sonda, combine 1 mL da solução-mãe sonda de DNA com 2 mL da solução TCEP e misture delicadamente com uma pipeta. Incubar a mistura por uma hora em um recipiente escuro e refrigerado. A solução, inicialmente azul deve ficar claro como o TCEP reversivelmente reduz o azul de metileno. Se a solução não se torna claro, repita o procedimento usando uma solução de TCEP frescos ou, possivelmente, à temperatura ambiente. </li><li> Depois de uma hora diluir a solução sonda reduzida DNA com 1 mL de tampão, o que irá diluir a uma concentração de 200nM. Mais tarde, você vai incubar um conjunto de eletrodos de disco de ouro em 200 porções mL desta solução diluída sonda. </li><li> Recém preparar pelo menos 2 mL de 2mm mercaptohexanol em tampão fosfato salino. </li></ol> 2. Preparação de sensor <ol><li> Combine 0,05 micron alumina em pó com água em um pano de polimento fino. Polonês um conjunto de eletrodos de disco de ouro (CH Instruments, Austin, TX), pressionando a superfície de ouro firmemente o pano molhado, e movê-los em uma figura oito padrão por aproximadamente três minutos por eletrodo. </li><li> Enxágüe os eletrodos polido com DI-água e mergulha-as em tubos Eppendorf preenchido com o mesmo. Sonicado por cinco minutos para remover qualquer pó de alumina residual. </li><li> Colocar os eletrodos em uma solução 0,5 M de ácido sulfúrico, anexá-los a um potenciostato, juntamente com um contador de platina e prata / cloreto de prata eletrodo de referência, e executar uma série de voltamogramas para oxidar, reduzir e eletroquimicamente limpa suas superfícies. Seguindo essa executar uma limpeza eletroquímica segundo de uma solução de 0,01 M KCl em 0,1 M de ácido sulfúrico. Os detalhes destes procedimentos de limpeza podem ser encontrados em nosso artigo da Nature Protocols 1, e no suplemento a este vídeo. </li><li> Organizar um conjunto de 2 tubos Eppendorf mL em um rack e preencha cada um com 200 mL da solução de DNA sonda. A concentração do DNA sonda nesta solução irá definir a densidade com que a sonda DNAs pacote na superfície do sensor. Desempenho do sensor é fortemente dependente da densidade de sonda, com a densidade ideal varia de uma arquitetura de sensores para a próxima. A concentração sonda utilizada nesta etapa devem, portanto, ser otimizados para cada novo tipo de sensor 2. Para as arquiteturas sonda temos investigado até o momento, as concentrações de DNA sonda que empregamos nesta faixa de passo de 15 nM de 2 m, com 200 nM de ser um valor típico. </li><li> Enxágüe os eletrodos de disco de ouro com DI-água, e depois mergulha-as na solução de relevantes sonda de DNA em um tubo Eppendorf durante uma hora. Neste ponto, o DNA sonda irá anexar à superfície do eletrodo de ouro através da formação de uma monocamada auto-tiol-on-ouro montado. </li><li> Enxágüe os eletrodos com água DI, mergulha-as na 2mM mercaptohexanol em um tubo Eppendorf e armazená-los em um lugar escuro por 3 horas durante a noite à temperatura ambiente para garantir a formação completa da monocamada auto montado. Esta etapa incorpora o mercaptohexanol como parte de uma monocamada mista para garantir a formação de uma monocamada estável. Para evitar a evaporação que você pode querer fechar o eletrodo dentro do tubo Eppendorf com parafilme. Sensores podem ser armazenados nessa solução por vários dias, se necessário. </li><li> Quando você está pronto para usar o sensor, lave-o com DI-água e, em seguida, mergulhe-o em buffer de pelo menos 10 minutos. Sensores destinados a detecção de anticorpos também deve ser imerso em uma solução de 100 nM da vertente reconhecimento relevantes antes do uso, seguida por uma rápida extremamente enxaguar com buffer. </li></ol> 3. Teste do sensor, detecção de DNA <ol><li> Neste protocolo, a 17 nucleotídeos vertente sonda está afixada a um eletrodo de ouro. Tem um azul de metileno repórter redox em sua extremidade 3&#39;-(Figura 1). Quando a molécula sonda hibridiza com uma fita de captura, a corrente através do circuito do sensor diminui. </li><li> Enxágüe um sensor fresco com DI-água e mergulhe em um espaço em brancoamostra sem o alvo, a fim de gravar o sinal de fundo que produz. Ligue o sensor ao cabo-eletrodo de trabalho de um potenciostato. Coloque um contra-eletrodo de platina e um de prata / prata eletrodo de referência de cloreto na solução. </li><li> Executar uma medição de onda quadrada de 0 a -0,6 V com uma amplitude de 25 mV e um tamanho de passo de 1mV. A freqüência da onda quadrada ideal vai depender dos detalhes da arquitetura sonda 2,3; para as arquiteturas sonda temos empregado os valores ideais são tipicamente na faixa de 60 a 600 Hz. Você deverá ver um pico arredondado em aproximadamente -0,35 V, o potencial redox do azul de metileno (o potencial de pico pode mudar ligeiramente, dependendo do pH precisa da sua solução de teste). A altura da linha de base atual para este pico é proporcional à eficiência de transferência de elétrons entre o azul de metileno eo eletrodo de ouro (Figura 2). Salve esta medida de fundo. </li><li> Mover os eletrodos a uma solução que contém a molécula de DNA alvo de interesse, equilibrar (5 a 120 min, dependendo do tamanho, estrutura e concentração do target4, 5) e recolher uma voltammagram segunda onda quadrada. A altura do pico em -0,35 V vai mudar a partir da medição de fundo inicial,. A magnitude desta mudança está relacionada com a concentração do analito. É a saída de dados principal deste sensor (Figura 3). </li><li> Medir a mudança de sinal, a diminuição ou aumento do sinal em relação ao pico de fundo, muitas vezes é mais reprodutível de medir a variação absoluta na corrente, pois isso corrige as variações de área de superfície do eletrodo. Para fazer isso, a diferença entre a corrente de pico ea corrente de pico de fundo são divididos pelo pico de fundo actual. </li></ol> 4. Regeneração Sensor <ol><li> Uma vez que suas medições estão completas, mova o sensor em um recipiente cheio de água DI por 30 s, ou esguicho-lo com um fluxo constante de DI-água por 30 s. Repita isso duas vezes mais com água deionizada fresco. Nota: alguns analitos são resistentes a esta abordagem, para eles tentar agressivo de lavagem em 6 de cloridrato de guanidina M ou etanol a 70%. </li><li> Coloque o sensor de volta em uma solução onde as medições serão feitas. Dentro de um minuto, a altura do pico deveria ter retornado ao seu valor original. É interessante notar que esses sensores apresentam frequentemente uma mudança de sinal ligeiramente maior durante seu primeiro teste e ciclo de regeneração, e os resultados altamente consistentes durante os ciclos subseqüentes 6. </li></ol> 5. Teste do sensor, a detecção de anticorpos <ol><li> Neste protocolo, a sonda de DNA-azul de metileno e tiol-modificadas utilizados nestes sensores serve como uma &quot;âncora&quot; vertente 7. Ele está ligado diretamente ao eletrodo de ouro. Este é então hibridizado com uma segunda vertente &quot;reconhecimento&quot;, o DNA que foi covalentemente conjugado com o antígeno relevante (Figura 4). Tivemos sorte com casas síntese comerciais, tais como Biosearch Technologies e Panagene, para a síntese de DNA necessária antígeno-quimeras. A hibridação é realizada através da transferência de um sensor de pré-fabricados em um tubo Eppendorf contendo 100 nM da vertente relevante o reconhecimento de DNA em PBS por 1 hora. </li><li> Coloque o sensor na solução relevantes em branco. Anexá-lo ao cabo-eletrodo de trabalho de um potenciostato e colocar um contra-eletrodo de platina e prata / cloreto de prata eletrodo de referência na solução. </li><li> Executar voltametria de onda quadrada, como descrito acima. Para a arquitetura sonda especial que temos aqui empregada a freqüência de onda ideal quadrado é de 60 Hz. Você deverá ver um pico arredondado em torno de -0,35 V. Salve esta medida de fundo. </li><li> Transferir os eletrodos a uma solução contendo o analito alvo, incubar por 5 a 60 min, e cobrar uma voltammagram segunda onda quadrada. Se o anticorpo alvo é apresentar o pico em -0,35 V irá diminuir. A magnitude desta mudança está relacionada com a concentração de anticorpos. </li></ol> 6. Teste do sensor, detecção de pequenas moléculas <ol><li> Neste caso, a molécula sonda na superfície do sensor é um aptamer, uma molécula de RNA ou DNA que foi selecionado in vitro para vincular um analito específico molecular, que muda sua estrutura (dobras) sobre a ligação ao seu analito alvo 8,9 ( Figura 5). Aqui nós empregamos uma cocaína de ligação aptamer DNA, desenvolvida pelo laboratório 10,11 Stojanovic. </li><li> Enxágüe um sensor fresco com DI-água e mergulhe em uma amostra em branco sem o alvo, a fim de gravar o sinal de fundo que produz. Ligue o sensor ao cabo-eletrodo de trabalho de um potenciostato. Coloque um contador de platina e um de referência de cloreto de prata / prata na solução. </li><li> Executar voltametria de onda quadrada, como descrito acima. Para a arquitetura sonda especial que temos aqui empregada a freqüência da onda quadrada é ótima 200Hz (Mas 60 Hz também funciona). Você deverá ver um pico arredondado em torno de -0,35 V. Salve esta medida de fundo. </li><li> Transferir os eletrodos a uma solução contendo o analito alvo, incubar por 5 min ~, e cobrar uma voltammagram segunda onda quadrada. A altura do pico em -0,35 V vai mudar. A magnitude desta mudança está relacionada com a concentração do analito alvo. Se você não puder obter uma amostra de cocaína, procaína, cuja utilização é regulamentada, pode ser usado como um substituto. </li></ol> 7. Resultados representativos: Quando usado para a detecção do DNA usando a arquitetura de primeira, o sinal deve diminuir em pelo menos 60%, quando equilibrada em 200 nM alvo. Depois de três lavagens em água deionizada breve, o sinal deve retornar muito perto (dentro de 0,1-5%) ao seu valor original. Sensores de detecção de anticorpos devem ser submetidos a uma diminuição do sinal de 40 a 80%. Aptamer baseado em sensores para a detecção de cocaína apresentam um aumento de sinal de até 200%, dependendo da freqüência e cobertura da superfície na qual eles operam. Para o sensor de cocaína, uma cobertura de superfície de baixa é o melhor 3. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Detecção de DNA com um biosensor eletroquímico DNA. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura Captura de tela 2. Mostrando o sinal produzido por um biosensor E-DNA durante a voltametria de onda quadrada. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura Captura de tela 3. Mostrando os sinais produzidos por um biosensor E-DNA durante a voltametria de onda quadrada, antes e depois de hibridação com um analito. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Detecção de anticorpos com um biosensor andaime. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Detecção de cocaína ou procaína com um biosensor aptamer eletroquímica. <table border="1"><tbody><tr><td> Personalizado Oligo </td><td> Seqüência </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Probe linear de DNA (LP17) </td><td> 5&#39;-HS-(CH2) 6-TGGATCGGCGTTTTATT-(CH2) 7-NH-MB-3 &#39; </td><td> HPLC purificada, pode ser encomendado com SS </td></tr><tr><td> DNA do analito alvo </td><td> AATAAAACGCCGATCCA </td><td> Sem modificações </td></tr><tr><td> Reconhecimento Strand </td><td> 5&#39;-antígeno-TEG-CAGTGGCGTTTTATTCTTGTTACTG-3 &#39; </td><td></td></tr><tr><td> Andaime Anchor </td><td> 5&#39;-HS-(CH 2) 6-GCAGTAACAAGAATAAAACGC CACTGC-(CH 2) 7-MB </td><td> HPLC purificada, pode ser encomendado com SS </td></tr><tr><td> A4 cocaína Aptamer </td><td> 5&#39;-HS-AGACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCG-MethyleneBlue-3 &#39; </td><td> HPLC purificada, pode ser encomendado com SS </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Sonda e seqüências de DNA alvo.

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	<li>Xiao, Y., Lai, R. Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+electrode-immobilized,+redox-modified+oligonucleotides+for+electrochemical+DNA+and+aptamer-based+sensing.">Preparation of electrode-immobilized, redox-modified oligonucleotides for electrochemical DNA and aptamer-based sensing.</a> Nat. Protocols. 2, 2875-2880 (2007).</li><li>Ricci, F., Lai, R. Y., Heeger, A. J., Plaxco, K. W., Sumner, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Molecular+Crowding+on+the+Response+of+an+Electrochemical+DNA+Sensor.">Effect of Molecular Crowding on the Response of an Electrochemical DNA Sensor.</a> Langmuir. 23, 6827-6834 (2007).</li><li>White, R. J., Phares, N., Lubin, A. A., Xiao, Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Electrochemical+Aptamer-Based+Sensors+via+Optimization+of+Probe+Packing+Density+and+Surface+Chemistry.">Optimization of Electrochemical Aptamer-Based Sensors via Optimization of Probe Packing Density and Surface Chemistry.</a> Langmuir. 24, 10513-10518 (2008).</li><li>Lubin, A. A., Vander Stoep Hunt, B., White, R. J., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Probe+Length,+Probe+Geometry,+and+Redox-Tag+Placement+on+the+Performance+of+the+Electrochemical+E-DNA+Sensor.">Effects of Probe Length, Probe Geometry, and Redox-Tag Placement on the Performance of the Electrochemical E-DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 81, 2150-2158 (2009).</li><li>Lubin, A. A., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding-Based+Electrochemical+Biosensors:+The+Case+for+Responsive+Nucleic+Acid+Architectures.">Folding-Based Electrochemical Biosensors: The Case for Responsive Nucleic Acid Architectures.</a> Accounts of Chemical Research. 43, 496-505 (2010).</li><li>Lubin, A. A., Lai, R. Y., Baker, B. R., Heeger, A. J., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-Specific,+Electronic+Detection+of+Oligonucleotides+in+Blood,+Soil,+and+Foodstuffs+with+the+Reagentless,+Reusable+E-DNA+Sensor.">Sequence-Specific, Electronic Detection of Oligonucleotides in Blood, Soil, and Foodstuffs with the Reagentless, Reusable E-DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 78, 5671-5677 (2006).</li><li>Cash, K. J., Ricci, F., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Electrochemical+Sensor+for+the+Detection+of+Protein?Small+Molecule+Interactions+Directly+in+Serum+and+Other+Complex+Matrices.">An Electrochemical Sensor for the Detection of Protein?Small Molecule Interactions Directly in Serum and Other Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 6955-6957 (2009).</li><li>Baker, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Electronic,+Aptamer-Based+Small-Molecule+Sensor+for+the+Rapid,+Label-Free+Detection+of+Cocaine+in+Adulterated+Samples+and+Biological+Fluids.">An Electronic, Aptamer-Based Small-Molecule Sensor for the Rapid, Label-Free Detection of Cocaine in Adulterated Samples and Biological Fluids.</a> Journal of the American Chemical Society. 128, 3138-3139 (2006).</li><li>Ferapontova, E. E., Olsen, E. M., Gothelf, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RNA+Aptamer-Based+Electrochemical+Biosensor+for+Detection+of+Theophylline+in+Serum.">An RNA Aptamer-Based Electrochemical Biosensor for Detection of Theophylline in Serum.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 4256-4258 (2008).</li><li>Stojanovic, M. N., Landry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-Based+Colorimetric+Probe+for+Cocaine.">Aptamer-Based Colorimetric Probe for Cocaine.</a> Journal of the American Chemical Society. 124, 9678-9679 (2002).</li><li>Stojanovic, M. N., Prada, P. d. e., Landry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer-Based+Folding+Fluorescent+Sensor+for+Cocaine.">Aptamer-Based Folding Fluorescent Sensor for Cocaine.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 4928-4931 (2001).</li><li>Cash, K. J., Heeger, A. J., Plaxco, K. W., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+Reusable,+DNA+Pseudoknot-Based+Electrochemical+Sensor+for+Sequence-Specific+DNA+Detection+in+Blood+Serum.">Optimization of a Reusable, DNA Pseudoknot-Based Electrochemical Sensor for Sequence-Specific DNA Detection in Blood Serum.</a> Analytical Chemistry. 81, 656-661 (2009).</li><li>Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Electrochemical+Sensor+for+Single+Nucleotide+Polymorphism+Detection+in+Serum+Based+on+a+Triple-Stem+DNA+Probe.">An Electrochemical Sensor for Single Nucleotide Polymorphism Detection in Serum Based on a Triple-Stem DNA Probe.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 15311-15316 (2009).</li><li>Zuo, X., Xiao, Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Specificity,+Electrochemical+Sandwich+Assays+Based+on+Single+Aptamer+Sequences+and+Suitable+for+the+Direct+Detection+of+Small-Molecule+Targets+in+Blood+and+Other+Complex+Matrices.">High Specificity, Electrochemical Sandwich Assays Based on Single Aptamer Sequences and Suitable for the Direct Detection of Small-Molecule Targets in Blood and Other Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 6944-6945 (2009).</li><li>Xia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Electrochemical+Supersandwich+Assay+for+Sensitive+and+Selective+DNA+Detection+in+Complex+Matrices.">An Electrochemical Supersandwich Assay for Sensitive and Selective DNA Detection in Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 132, 14346-14348 (2010).</li><li>Patterson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Triplex-Forming+Oligonucleotide+Probes+for+the+Reagentless,+Electrochemical+Detection+of+Double-Stranded+DNA.">Using Triplex-Forming Oligonucleotide Probes for the Reagentless, Electrochemical Detection of Double-Stranded DNA.</a> Analytical Chemistry. 82, 9109-9115 (2010).</li><li>Ferguson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+Microfluidic+Electrochemical+DNA+Sensor.">Integrated Microfluidic Electrochemical DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 81, 6503-6508 (2009).</li><li>Swensen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous,+Real-Time+Monitoring+of+Cocaine+in+Undiluted+Blood+Serum+via+a+Microfluidic,+Electrochemical+Aptamer-Based+Sensor.">Continuous, Real-Time Monitoring of Cocaine in Undiluted Blood Serum via a Microfluidic, Electrochemical Aptamer-Based Sensor.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 4262-4266 (2009).</li></ol>

Uma observação importante é que nenhum dos experimentos descritos acima irá funcionar corretamente a menos que os eletrodos tenham sido adequadamente limpos. Aqui está um guia para o nosso procedimento de limpeza eletroquímica. Ao trabalhar com potentiostats CH Instruments, corremos estes passos limpeza utilizando um conjunto de três programas de macro. Fase Zero (E-clean O) Mergulhar os eléctrodos na 0.5MH 2 SO 4 e conectá-los para os eletrodos de trabalho de um potenciostato. Também anexar e mergulhe uma referência de Ag / AgCl e contra eletrodo de platina. Comece com uma etapa de oxidação (2 V por 5 s) e, em seguida, uma etapa de redução (0,35 V durante 10 s). Phase One (E-clean 1) Iniciar a oxidação e redução de varreduras nas mesmas condições ácidas (0.5MH 2 SO 4) 0,35-1,5 V (20 scans em uma taxa de varredura de 4 V / s e um intervalo de amostragem de 0,01 V, seguido por quatro varreduras em uma taxa de varredura de 0,1 V / s e um intervalo de amostragem de 0,01 V). Fase Dois (E-clean 2) Realizar um outro conjunto de eletroquímica de oxidação e redução de scans em condições ácidas (0,01 M KCl/0.1 MH 2 SO 4), abrangendo quatro diferentes faixas de potencial (tudo feito por 10 segmentos em uma taxa de varredura de 0,1 V s 1 e um intervalo de amostragem de 0,01 V ): (i) faixa de potencial 0,2-0,75 V; (ii) alcance potencial 0,2-1,0 V, (iii) faixa de potencial de 0,2-1,25 V; (iv) potencial gama 0,2-1,5 V. Muitos tipos de eletrodos de ouro podem ser usados ​​para realizar esses experimentos. Além de eletrodos de disco de ouro, como aqueles empregados aqui, temos tido sucesso com superfícies de ouro microfabricated, fio de ouro, e ouro em placas de circuito impresso. Juntamente com os sensores descritos neste documento, muitas outras arquiteturas biosensor eletroquímico DNA têm sido relatados. Isto inclui sensores com uma pseudoknot 12, fio triplo 13, 14 sanduíche, sanduíche super-15, ou triplex arquitetura 16. No futuro, esperamos que estes sensores serão utilizados no ponto de diagnósticos de cuidados médicos. Eles foram integrados com sucesso em vários dispositivos microfluídicos 17,18, e oferecem muitas vantagens sobre os sistemas de detecção óptica analito. Em particular, esses sensores podem funcionar em turvas, opticamente denso e altamente auto-fluorescentes amostras.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Eletrodos de ouro Disk </td><td> CH Instruments </td><td> CHI101 </td><td> Podem ser reutilizados </td></tr><tr><td> DNA Probe sintético </td><td> Biosearch Technologies </td><td> Personalizado </td><td></td></tr><tr><td> DNA alvo sintético </td><td> Sigma Genosys </td><td> Personalizado </td><td></td></tr><tr><td> Mercaptohexanol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 725226-1G </td><td> Armazenar em local escuro e fresco </td></tr><tr><td> Eletrodo de platina </td><td> BASI </td><td> MW-1032 </td><td> Podem ser reutilizados </td></tr><tr><td> Ag / AgCl de referência </td><td> BASI </td><td> MF-2052 </td><td> Podem ser reutilizados </td></tr><tr><td> Pano de polimento </td><td> Buehler </td><td> 40-7212 </td><td></td></tr><tr><td> Polonês Alumina </td><td> Buehler </td><td> 40-6325-016 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão salina tampão fosfato, pH 7,4 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P7059-1L </td><td></td></tr><tr><td> CH Instruments 605A </td><td> CH Instruments </td><td> 605A </td><td> Usar qualquer potenciostato </td></tr><tr><td> Serum bezerro recém-nascido </td><td> Sigma Aldrich </td><td> N4637-500ML </td><td> Armazenadas congeladas </td></tr><tr><td> NanoDrop </td><td> Fisher Scientific </td><td> ND-2000 </td><td> Usar qualquer UV-Vis </td></tr><tr><td> PCR Mix </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8862 </td><td> Armazenadas congeladas </td></tr><tr><td> Cocaína </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C5776 </td><td> DEA Licença Obrigatório </td></tr><tr><td> Procaína </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P9879 </td><td> Substituto para a cocaína </td></tr><tr><td> Anticorpos Anti-Flag </td><td> Sigma Aldrich </td><td> F1804-1mg </td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication of electrochemical-dna biosensors for the reagentless detection of nucleic acids, proteins and small molecules

Como a medicina é praticada atualmente, os médicos enviar amostras para um laboratório central para testes e, portanto, deve esperar horas ou dias para receber os resultados. Muitos pacientes seriam melhor servidos pela rápida, testes de cabeceira. Para este fim o nosso laboratório e outros desenvolveram uma plataforma versátil, reagentless biosensor que suporta o quantitativo, reagentless, detecção eletroquímica de ácidos nucléicos (DNA, RNA), proteínas (incluindo anticorpos) e analitos pequenas moléculas não transformados diretamente em amostras clínicas e ambientais. Neste vídeo, demonstramos a preparação e utilização de biossensores várias neste &quot;E-DNA&quot; de classe. Em particular, podemos fabricar e demonstrar sensores para a detecção de uma seqüência de DNA alvo em uma mistura de reação em cadeia da polimerase, um anticorpo HIV-específicos e da cocaína de drogas. O procedimento de preparação requer apenas três horas de hands-on esforço seguido por uma incubação durante a noite, e seu uso exige apenas alguns minutos.

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Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

&quot;E-DNA&quot; sensores, reagentless, biossensores eletroquímicos que um bom desempenho, mesmo quando desafiados diretamente no sangue e outras matrizes complexas, foram adaptados para a detecção de uma ampla gama de ácido nucléico, proteínas e moléculas pequenas analitos. Aqui apresentamos um procedimento geral para a fabricação e uso de tais sensores.

Fabricação de Eletroquímica-DNA Biossensores para Detecção Reagentless de ácidos nucléicos, proteínas e pequenas moléculas

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

fabrication-electrochemical-dna-biosensors-for-reagentless-detection

Research

JoVE Journal

Bioengineering

33.0K visualizações.  University Of California Santa Barbara. "E-DNA" sensores, reagentless, biossensores eletroquímicos que um bom desempenho, mesmo quando desafiados diretamente no sangue e outras matrizes complexas, foram adaptados para a detecção de uma ampla gama de ácido nucléico, proteínas e moléculas pequenas analitos. Aqui apresentamos um procedimento geral para a fabricação e uso de tais sensores.

Vídeo: Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic processes in simple, compact systems with no moving parts. Isotachophoresis (ITP) is a simple and very robust electrokinetic technique that can achieve million-fold preconcentration1,2 and efficient separation and extraction based on ionic mobility.3 For example, we have demonstrated the application of ITP to separation and sensitive detection of unlabeled ionic molecules (e.g. toxins, DNA, rRNA, miRNA) with little or no sample preparation4-8 and to extraction and purification of nucleic acids from complex matrices including cell culture, urine, and blood.9-12
ITP achieves focusing and separation using an applied electric field and two buffers within a fluidic channel system. For anionic analytes, the leading electrolyte (LE) buffer is chosen such that its anions have higher effective electrophoretic mobility than the anions of the trailing electrolyte (TE) buffer (Effective mobility describes the observable drift velocity of an ion and takes into account the ionization state of the ion, as described in detail by Persat et al.13). After establishing an interface between the TE and LE, an electric field is applied such that LE ions move away from the region occupied by TE ions. Sample ions of intermediate effective mobility race ahead of TE ions but cannot overtake LE ions, and so they focus at the LE-TE interface (hereafter called the "ITP interface"). Further, the TE and LE form regions of respectively low and high conductivity, which establish a steep electric field gradient at the ITP interface. This field gradient preconcentrates sample species as they focus. Proper choice of TE and LE results in focusing and purification of target species from other non-focused species and, eventually, separation and segregation of sample species.
We here review the physical principles underlying ITP and discuss two standard modes of operation: "peak" and "plateau" modes. In peak mode, relatively dilute sample ions focus together within overlapping narrow peaks at the ITP interface. In plateau mode, more abundant sample ions reach a steady-state concentration and segregate into adjoining plateau-like zones ordered by their effective mobility. Peak and plateau modes arise out of the same underlying physics, but represent distinct regimes differentiated by the initial analyte concentration and/or the amount of time allotted for sample accumulation.
We first describe in detail a model peak mode experiment and then demonstrate a peak mode assay for the extraction of nucleic acids from E. coli cell culture. We conclude by presenting a plateau mode assay, where we use a non-focusing tracer (NFT) species to visualize the separation and perform quantitation of amino acids.

Isotachophoresis (ITP) is a robust electrokinetic separation and preconcentration technique with applications ranging from toxin detection to sample preparation. We review the physical principles of ITP and the methodology of applying this technique to two specific example applications: separation and detection of small molecules and purification of nucleic acids from cell culture lysate.

On-chip Isotachophoresis para separação dos íons e purificação de ácidos nucléicos

Electrokinetic techniques are a staple of microscale applications because of their unique ability to perform a variety of fluidic and electrophoretic ...

Bioengenharia

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

A detecção óptica de<em&gt; E. coli</em&gt; Bactérias por mesoporosos Silicon Biossensores

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the efficiency with which macromolecules penetrate the cytosolic space of cells. Recently, we have circumvented this problem by identifying the reagent dfTAT, a disulfide bond dimer of the peptide TAT labeled with the fluorophore tetramethylrhodamine. We have generated a fluorescently labeled dimer of the prototypical cell-penetrating peptide (CPP) TAT, dfTAT, which penetrates live cells and reaches the cytosolic space of cells with a particularly high efficiency. Cytosolic delivery of dfTAT is achieved in multiple cell lines, including primary cells. Moreover, delivery does not noticeably impact cell viability, proliferation or gene expression. dfTAT can deliver small molecules, peptides, antibodies, biologically active enzymes and a transcription factor. In this report, we describe the protocols involved in dfTAT synthesis and cellular delivery. The manuscript describes how to control the amount of protein delivered to the cytosolic space of cells by varying the amount of protein administered extracellularly. Finally, the current limitations of this new technology and steps involved in validating delivery are discussed. The described protocols should be extremely useful for cell-based assays as well as for the ex vivo manipulation and reprogramming of cells.

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

Entrega de proteínas, peptídeos ou célula-impermeável Pequenas moléculas em células vivas por incubação com o Endosomolytic Reagente dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, significantly affecting the rate of human mortality and morbidity. Conventional methods for the detection of V. parahaemolyticus such as culture-based methods, immunological assays, and molecular-based methods require complicated sample handling and are time-consuming, tedious, and costly. Recently, biosensors have proven to be a promising and comprehensive detection method with the advantages of fast detection, cost-effectiveness, and practicality. This research focuses on developing a rapid method of detecting V. parahaemolyticus with high selectivity and sensitivity using the principles of DNA hybridization. In the work, characterization of synthesized polylactic acid-stabilized gold nanoparticles (PLA-AuNPs) was achieved using X-ray Diffraction (XRD), Ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), Field-emission Scanning Electron Microscopy (FESEM), and Cyclic Voltammetry (CV). We also carried out further testing of stability, sensitivity, and reproducibility of the PLA-AuNPs. We found that the PLA-AuNPs formed a sound structure of stabilized nanoparticles in aqueous solution. We also observed that the sensitivity improved as a result of the smaller charge transfer resistance (Rct) value and an increase of active surface area (0.41 cm2). The development of our DNA biosensor was based on modification of a screen-printed carbon electrode (SPCE) with PLA-AuNPs and using methylene blue (MB) as the redox indicator. We assessed the immobilization and hybridization events by differential pulse voltammetry (DPV). We found that complementary, non-complementary, and mismatched oligonucleotides were specifically distinguished by the fabricated biosensor. It also showed reliably sensitive detection in cross-reactivity studies against various food-borne pathogens and in the identification of V. parahaemolyticus in fresh cockles.

A protocol for the development of an electrochemical DNA biosensor comprising a polylactic acid-stabilized, gold nanoparticles-modified, screen-printed carbon electrode to detect Vibrio parahaemolyticus is presented.

Desenvolvimento de um Biosensor eletroquímico do DNA para detectar um patógeno de origem alimentar

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

Detecção visual de vários ácidos nucleicos em uma matriz capilar

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

Desenvolvimento de dispositivos microfluídicos para estudar a capacidade de alongamento de ponta-cultivo de células vegetais em espaços extremamente pequenos

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

Uma plataforma Microfluídico multicamada para a condução de expressão gênica sem células prolongada

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated media. In this article, we describe detailed protocols that enable the construction of nanofiber architectures in organic solvent mixtures through the self-assembly of uniquely addressable, single-stranded, gamma-modified peptide nucleic acid (&#947;PNA) tiles. Each single-stranded tile (SST) is a 12-base &#947;PNA oligomer composed of two concatenated modular domains of 6 bases each. Each domain can bind to a mutually complimentary domain present on neighboring strands using programmed complementarity to form nanofibers that can grow to microns in length. The SST motif is made of 9 total oligomers to enable the formation of 3-helix nanofibers. In contrast with analogous DNA nanostructures, which form diameter-monodisperse structures, these &#947;PNA systems form nanofibers that bundle along their widths during self-assembly in organic solvent mixtures. Self-assembly protocols described here therefore also include a conventional surfactant, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), to reduce bundling effects.

This article provides protocols for the design and self-assembly of nanostructures from gamma-modified peptide nucleic acid oligomers in organic solvent mixtures.

Auto-montagem de ácidos nucleicos de peptídeos modificados gama em nanoestruturas complexas em misturas de solventes orgânicos

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...

The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is accompanied by high manufacturing costs, which has brought about an interest in using alternative methods for gene delivery. Electroporation is an electro-physical, non-viral approach for the intracellular delivery of genes and other exogenous materials. Upon the application of an electric field, the cell membrane temporarily allows molecular delivery into the cell. Typically, electroporation is performed on the macroscale to process large numbers of cells. However, this approach requires extensive empirical protocol development, which is costly when working with primary and difficult-to-transfect cell types. Lengthy protocol development, coupled with the requirement of large voltages to achieve sufficient electric-field strengths to permeabilize the cells, has led to the development of micro-scale electroporation devices. These micro-electroporation devices are manufactured using common microfabrication techniques and allow for greater experimental control with the potential to maintain high throughput capabilities. This work builds off a microfluidic-electroporation technology capable of detecting the level of cell membrane permeabilization at a single-cell level under continuous flow. However, this technology was limited to 4 cells processed per second, and thus a new approach for increasing the system throughput is proposed and presented here. This new technique, denoted as cell-population-based feedback control, considers the cell permeabilization response to a variety of electroporation pulsing conditions and determines the best-suited electroporation pulse conditions for the cell type under test. A higher-throughput mode is then used, where this 'optimal' pulse is applied to the cell suspension in transit. The steps for fabricating the device, setting up and running the microfluidic experiments, and analyzing the results are presented in detail. Finally, this micro-electroporation technology is demonstrated by delivering a DNA plasmid encoding for green fluorescent protein (GFP) into HEK293 cells.

This protocol describes the microfabrication techniques required to build a lab-on-a-chip, microfluidic electroporation device. The experimental setup performs controlled, single-cell-level transfections in a continuous flow and can be extended to higher throughputs with population-based control. An analysis is provided showcasing the ability to electrically monitor the degree of cell membrane permeabilization in real-time.

A Fabricação e Operação de um Sistema de Micro-Eletroporação de Fluxo Contínuo com Detecção de Permeabilização

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is ...

Experimental and Data Analysis Workflow for Soft Matter Nanoindentation

Nanoindentation refers to a class of experimental techniques where a micrometric force probe is used to quantify the local mechanical properties of soft biomaterials and cells. This approach has gained a central role in the fields of mechanobiology, biomaterials design&#160;and tissue engineering, to obtain a proper mechanical characterization of soft materials with a resolution comparable to the size of single cells (&#956;m). The most popular strategy to acquire such experimental data is to employ an atomic force microscope (AFM); while this instrument offers an unprecedented resolution in force (down to pN) and space (sub-nm), its usability is often limited by its complexity that prevents routine measurements of integral indicators of mechanical properties, such as Young&#39;s Modulus (E). A new generation of nanoindenters, such as those based on optical fiber sensing technology, has recently gained popularity for its ease of integration while allowing to apply sub-nN forces with &#181;m spatial resolution, therefore being suitable to probe local mechanical properties of hydrogels and cells.
In this protocol, a step-by-step guide detailing the experimental procedure to acquire nanoindentation data on hydrogels and cells using a commercially available ferrule-top optical fiber sensing nanoindenter is presented. Whereas some steps are specific to the instrument used herein, the proposed protocol can be taken as a guide for other nanoindentation devices, granted some steps are adapted according to the manufacturer&#39;s guidelines. Further, a new open-source Python software equipped with a user-friendly graphical user interface for the analysis of nanoindentation data is presented, which allows for screening of incorrectly acquired curves, data filtering, computation of the contact point through different numerical procedures, the conventional computation of E, as well as a more advanced analysis particularly suited for single-cell nanoindentation data.

The protocol presents a complete workflow for soft material nanoindentation experiments, including hydrogels and cells. First, the experimental steps to acquire force spectroscopy data are detailed; then, the analysis of such data is detailed through a newly developed open-source Python software, which is free to download from GitHub.

Fluxo de trabalho experimental e de análise de dados para nanoindentação de matéria mole

Nanoindentation refers to a class of experimental techniques where a micrometric force probe is used to quantify the local mechanical properties of soft ...