We are indebted to Pierre Mattar and Freda Miller for their assistance with the in utero electroporation and to Noel Ghanem and Bensun Fong for creating diagrams. We thank Linda Jui and Jason G. MacLaurin for excellent technical assistance. Equipment was supported by the Centre for Stroke Recovery.
This work was supported by a scholarship from HSFO and OGS to D.S.S. and a CIHR grant to R.S.S.

NOTA: Todos os experimentos foram aprovados pela University of Animal Care comissão de ética de Ottawa, aderindo às Diretrizes da Canadian Council on Animal Care. Preparação 1. Pré-cirúrgico e de Materiais <ol><li> O plasmídeo Preparação: <ol><li> Prepare plasmídeos utilizando o Qiagen Megaprep de acordo com o protocolo do fabricante. Innoculate, pelo menos, 400 ml de caldo LB com bactérias transformadas de assegurar um rendimento elevado de DNA e incubar durante a noite. </li><li> Ressuspender o plasmídeo em 100-200 ul de TE a uma concentração final de, pelo menos, 5 mg / mL. DNA Alíquotas e armazenar a -20 ° C. Se a concentração for demasiado baixa, não se precipitam e ressuspender como este pode adicionar impurezas. Começar de novo com uma nova preparação. </li><li> Antes da cirurgia, diluir um único plasmídeo (Cre-GFP por exemplo) a 2 mg / mL em água estéril com 1 ml de 0,1% (w / v) de corante Verde Rápido por 10 ou 20 ul de solução diluída de plasmídeo. Se GFPe o gene de interesse está a ser co-electroporados em plasmídeos separados, injectar o plasmídeo GFP e o plasmídeo que transporta o gene de interesse a uma razão de 1: 4 para maximizar a probabilidade de que todas as células marcadas com GFP, são co-electroporado com ambos plasmídeos. </li></ol></li><li> Puxe tubos microcapilares de vidro (diâmetro exterior 1 mm - doravante referidas como agulhas) em um extrator de agulha padrão, usando um único passo de puxar a 62 ° C. </li><li> Autoclave um bloco cirúrgico contendo o seguinte: porta-agulhas, afastador de feridas, fórceps, tesouras para a cirurgia, tesouras para agulhas, grampeador, grampos, gaze, tampas de feridas, campos cirúrgicos (Figura 1a, b; Materials Table). </li><li> Colete outras ferramentas necessárias: electroporador, FemtoJet Microinjecter, Tweezertrodes (5 ou 7 mm), soro fisiológico, sutura, seringa de 5 ml (Materials Table). </li></ol> 2. Prepare-Rato para Cirurgia <ol><li> Para o manejo da dor, injetar a-p cronometradorato reinante com buprenorfina (0,05 mg / kg de peso corporal) uma hora antes da cirurgia. Aplicar este protocolo para ratos cronometrados em qualquer lugar a partir de dia embrionário 12,5 (E12.5) para E17.5. </li><li> Use Microloader pontas de pipeta de back-carga tracionada agulhas com a solução de plasmídeo. Não encher todo o caminho para a ponta de agulha ainda como isso vai fazer com que a agulha fique obstruída. </li><li> Anestesie rato usando 2-5% de isoflurano gás com 1 L / min de O2. Uma vez imóvel, colocar na máscara de rosto e aplicar pomada para os olhos para evitar a secagem. Injectar com 1 ml de solução salina (NaCl a 0,9%) por via subcutânea nas costas. NOTA: Quando se trabalha com gás isoflurano, utilize um limpador de gás para recapturar o excesso de gás e evitar que ele escape para o quarto. </li><li> Shave abdômen. Lave abdômen com Chlorohexadine matagal, lave com água e aplicar uma solução final prep de chlorohexadine e etanol 70%. Rato Cubra com cortina estéril ou gaze para cobrir a pele, mas deixe abdômen exposto (Figura 1C, D). </li></ol>No útero Electroporation <ol><li> Realizar uma incisão na pele ao longo do abdómen entre os bicos inferiores. Puxe a pele para longe da camada muscular subjacente ao rasgar o tecido conjuntivo, em seguida, cortado através do peritoneu para dentro da cavidade abdominal ao longo da linha alba. Inserir o afastador de ferida para puxar os bordos da ferida separados. </li><li> Retirar o útero da cavidade abdominal e colocá-lo para fora, como mostrado (Figura 1E). <ol><li> Se os filhotes são diferentes para ser injectados com diferentes plasmídeos (tal como GFP contra GFP com o gene de interesse), contar as crias de cada lado e decidir quais e quantos injectar cada plasmídeo. Substituir um lado do útero de volta para o abdómen para manter os embriões quente e lubrificado. Imediatamente humedecer o útero exposto com solução salina (de preferência aquecida até à temperatura do corpo). </li><li> Se a injecção todos os filhotes com o mesmo plasmídeo (tal como quando se injecta Cre-GFP em embriões transgénicos) only remover um chifre do útero de uma vez. </li></ol></li><li> Coloque uma agulha colocado na cabeça aderência da varinha de injeção e corte cuidadosamente a ponta com um par de pequenas tesouras cirúrgicas ou uma pinça fina. Cortar o bico de modo que a agulha permanece tanto tempo quanto possível, enquanto ainda permite que o fluido passe através de (Figura 1Ji-iv). <ol><li> Ajustar o comprimento de injecção (em segundos) e a pressão de injecção na microinjector de modo que uma pequena gotícula ainda facilmente visível de 0,1-0,2 uL aparece na ponta da agulha quando o pé de pá é pressionado. Mantenha o volume deste gota tão consistente quanto possível entre diferentes agulhas. Nota: Esta etapa é crucial para a sobrevivência dos embriões (ver discussão). </li><li> Utilize os seguintes parâmetros de injeção para o FemtoJet: injetar pressão (pi) = 250-300 hPa; tempo de injecção (ti) = 0,8-1,2 segundos; pressão de compensação = 10-50 hPa. Se necessário, ajustar estes parâmetros para acomodar variações entre as agulhas. </li></ol></li><li> Seleger um embrião e posicione-o com cuidado em suas costas, a cabeça inclinada para cima (Figura 1F). NOTA: Isso pode exigir virar ou mudar o embrião; ter cuidado para não aplicar muita pressão e evitar a ruptura do saco amniótico ao manipular o embrião. </li><li> Uma vez que o embrião está no lugar, localizar o ventrículo, que se apresenta como uma forma de crescente sombra paralelo para o seio sagital. Toque a ponta da agulha para o útero acima do ventrículo em um pequeno ângulo e guiar a agulha através da parede uterina. A quantidade de pressão necessária depende da agudeza da agulha. Empurre a agulha através do córtex para o ventrículo. NOTA: Embora raramente há qualquer resistência detectável adicional, a cabeça do embrião é, muitas vezes se afastou um pouco e depois recua quando a agulha passa pelo córtex para o ventrículo. </li><li> Bombear o pé remo para injectar a solução plasmídeo. Continue a bombear até a área verde é visível e está em conformidade com oforma de arco do ventrículo (Figura 1G). Em embriões jovens (E12.5 a E14.5) o corante muitas vezes difundem-se para o ventrículo contralateral. NOTA: O número de bombas depende do diâmetro da ponta da agulha, a idade do embrião (e resultante tamanho do ventrículo) e o volume de injecção desejado. Mantenha o volume injetado o mais consistente possível entre embriões. </li><li> Injectar três ou quatro embriões. Mantenha todos os embriões expostos úmidos com solução salina durante todo o procedimento. </li><li> Volte para os primeiros embriões injetados e colocar as pás de tal forma que o eletrodo positivo vai chamar o plasmídeo para a região desejada do cérebro (Figura 1H). Ângulo do eléctrodo negativo, de modo que o caminho mais curto entre os eléctrodos passa directamente através da estrutura de alvo para electroporação (Figura 2). </li><li> Uma vez que as pás estão em vigor, aplicar o choque. Dependendo da idade e do tamanho dos embriões, utilizar 5 pulsos de 35-50 V (ver T1 capaz). Utilize os seguintes parâmetros eletroporação: comprimento de pulso de 5 ms com um intervalo de pulso de 950 ms. Repita o procedimento com todos os embriões injetados. </li><li> Corte a ponta da agulha nova pré-carregado como no passo 3.3 como a última agulha provável seca e obstruído durante a etapa 3.9. Injectar o próximo conjunto de três ou quatro embriões quer com o mesmo plasmídeo ou num plasmídeo diferente e, em seguida, aplicar o choque como no passo 3.9. Quando todos os filhotes em um dos lados do útero são injetados, remova o segundo lado do útero do abdome da fêmea e, em seguida, substituir o lado preenchido para mantê-lo aquecido. </li><li> E volta de ambos os lados do útero para a fêmea tendo o cuidado de manter a superfície húmida com solução salina e não aplicar demasiada pressão para impedir o trauma para os sacos amnióticas. Suturar a camada muscular fechado meio de sutura contínua simples. Staple a pele fechada. Se os grampos não estão disponíveis, a sutura da pele com uma costura simples interrompido. (Figura 1I) </li><li> Enquanto suturing, transformar progressivamente para baixo o isoflurano para anestesia da fêmea grávida a clarear. NOTA: Isto irá acelerar a excitação da barragem após a cirurgia está completa; mantendo a fêmea anestesiados por um tempo tão curto quanto possível irá melhorar a sobrevivência dos embriões. Tempo total de operação, a partir de quando a fêmea é anestesiada em primeiro lugar, deve ser de aproximadamente 30 minutos. </li></ol> 4. Cuidados posteriores <ol><li> Coloque a fêmea suturado numa incubadora ou numa almofada de aquecimento para recuperar da anestesia. Cama-la na cama limpa e coloque um gel padrão de recuperação na gaiola manter a hidratação. Para o manejo da dor após a cirurgia, as fêmeas dão três doses de buprenorfina (0,05 mg / kg de peso corporal) em 8 intervalos h após a cirurgia, em seguida, quatro doses adicionais em intervalos de 12 h. </li></ol> 5. Brains Colhendo NOTA: Brains pode ser colhida em qualquer idade até a idade adulta. O seguinte diz respeitopara a recolha de cérebros antes do nascimento. Note-se que uma vez que os filhotes nascem, a ordem dentro do útero está perdido, por isso ou cada filhote da ninhada deve ser injetado com o mesmo plasmídeo, ou outro método de diferenciação entre controle e animais experimentais deve ser concebido. <ol><li> Prepare a frio (4 ° C), filtrou-se 4% de paraformaldeído (PFA) antes da eutanásia fêmea. </li><li> Eutanásia da fêmea utilizando uma injecção intraperitoneal de uma dose letal de pentobarbital de sódio (100 mg / kg de peso corporal) e cortar abdómen aberto. Retire ambos os lados do útero e colocar para fora como quando filhotes foram inicialmente injetada. <ol><li> No caso em que todas as crias receberam o mesmo plasmídeo, tal como quando se injecta Cre em uma ninhada transgénicos, a fim de embriões não é importante, por conseguinte, reduzir o útero para fora do local e fêmea em PBS. </li><li> Se os filhotes foram injetados com diferentes plasmídeos, certifique-se de localizar cada filhote, anotando todos os filhotes mortos, e determinar quais foram injetados com controle e experimenplasmídeos Tal antes de remover o útero da fêmea. Tenha cuidado para manter o controle de quais filhote pertence a qual grupo após o útero está em PBS. </li></ol></li><li> Retire cada filhote individualmente, decapitar com uma tesoura afiada ou uma lâmina de barbear e colocar a cabeça no PBS. No caso de ratinhos transgénicos, recolher amostras de tecido para a genotipagem e manter cada cabeça separado, tal como em uma placa de 12 poços. </li><li> De acordo com um escopo de dissecação, remover o cérebro do crânio, tomando cuidado para não nick o córtex ou rasgar a linha média. Usando um microscópio de fluorescência, verificar para ver se o cérebro tem um GFP + patch, indicando que eles foram electroporados com sucesso. </li><li> Fix cérebros por imersão em PFA a 4 ° C durante a noite. NOTA: Verifique cérebros para a expressão de GFP antes da fixação desde PFA frequentemente sacia o sinal. </li><li> Cryoprotect cérebros através de imersão em 20% sacarose durante pelo menos três dias antes da congelação. Usar um gradiente de sacarose de 10%, 15% e 20% (24 h em cada solução) to evitar danos nos tecidos devido à pressão osmótica. Armazenar cérebros congelados a -80 ° C e cortado num criostato a 10-14 mm de espessura. </li></ol> 6. Co-coloração com anti-GFP NOTA: Se a recuperação do antígeno é necessário de modo a co-mancha com anti-GFP, é importante o uso de um protocolo de recuperação do antigénio suave que não comprometa o sinal GFP. Alguns protocolos de recuperação antigênica são muito duras para usar em conjunto com a coloração GFP (mesmo com um anticorpo contra GFP). Um ácido cítrico de base pré-tratamento antes da aplicação do anticorpo primário é bem sucedido para a maioria dos epitopos 24. <ol><li> Adicione uma solução de ácido cítrico em ddH 2 O. 0,01 M para pH 6 utilizando um medidor de pH calibrado. </li><li> Ácido cítrico calor na câmara de coloração no microondas ou banho-maria até ácidos cítrico atinge 75-80 ° C. Coloque as lâminas em câmara de coloração para 10-15 min. Manter a temperatura tão estável quanto possível. </li><li> Lavar as lâminas em PBS3x durante 3 minutos à temperatura ambiente. Aplicar o anticorpo primário e prosseguir com a imunocoloração de acordo com um protocolo padrão. </li><li> Validate Cre excisão mediada por co-rotulagem para GFP e o gene de interesse para confirmar derrubar (Figura 3A). </li></ol>

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	<li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathways+controlling+the+sequential+steps+of+cortical+projection+neuron+migration.">Molecular pathways controlling the sequential steps of cortical projection neuron migration.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 800, 1-24 (2014).</li><li>Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+mechanisms+of+oriented+neuronal+migration+in+the+developing+brain.">Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 29, 299-353 (2013).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+neuronal+migration.">The dynamics of neuronal migration.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 800, 25-36 (2014).</li><li>McClellan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+requirement+for+Rb/E2F3+in+neuronal+migration:+evidence+for+cell+cycle-independent+functions.">Unique requirement for Rb/E2F3 in neuronal migration: evidence for cell cycle-independent functions.</a> Mol. Cell. Biol. 27 (13), 4825-4843 (2007).</li><li>Nguyen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P27kip1+Independently+Promotes+Neuronal+Differentiation+and+Migration+in+the+Cerebral+Cortex.">P27kip1 Independently Promotes Neuronal Differentiation and Migration in the Cerebral Cortex.</a> Genes Dev. 20 (11), 1511-1524 (2006).</li><li>Svoboda, D. S., Paquin, A., Park, D. S., Slack, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pocket+proteins+pRb+and+p107+are+required+for+cortical+lamination+independent+of+apoptosis.">Pocket proteins pRb and p107 are required for cortical lamination independent of apoptosis.</a> Dev. Biol. 384 (1), 101-113 (2013).</li><li>Hashimoto-Torii, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+Reelin+and+Notch+signaling+regulates+neuronal+migration+in+the+cerebral+cortex.">Interaction between Reelin and Notch signaling regulates neuronal migration in the cerebral cortex.</a> Neuron. 60 (2), 273-284 (2008).</li><li>Ori-McKenney, K. M., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+migration+defects+in+the+Loa+dynein+mutant+mouse.">Neuronal migration defects in the Loa dynein mutant mouse.</a> Neural Dev. 6, (2011).</li><li>Wang, H., Ge, G., Uchida, Y., Luu, B., Ahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gli3+is+required+for+maintenance+and+fate+specification+of+cortical+progenitors.">Gli3 is required for maintenance and fate specification of cortical progenitors.</a> J. Neurosci. 31 (17), 6440-6448 (2011).</li><li>Heng, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin+2+controls+cortical+neuron+migration+through+regulation+of+Rnd2.">Neurogenin 2 controls cortical neuron migration through regulation of Rnd2.</a> Nature. 455 (7209), 114-118 (2008).</li><li>Alfano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COUP-TFI+promotes+radial+migration+and+proper+morphology+of+callosal+projection+neurons+by+repressing+Rnd2+expression.">COUP-TFI promotes radial migration and proper morphology of callosal projection neurons by repressing Rnd2 expression.</a> Development. 138 (21), 4685-4697 (2011).</li><li>De Vry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+of+the+central+nervous+system:+a+non-viral+approach+for+targeted+gene+delivery.">In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery.</a> Prog. Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).</li><li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+into+multiple+CNS+territories+using+in+utero+electroporation.">Efficient gene delivery into multiple CNS territories using in utero electroporation.</a> J. Vis. Exp. (52), (2011).</li><li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system.">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li><li>Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+trafficking+of+AMPA+and+NMDA+receptors+by+SAP102+and+PSD-95+underlies+synapse+development.">Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (52), 20953-20958 (2008).</li><li>Bhuiyan, M. I., Lee, J. H., Kim, S. Y., Cho, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+exogenous+LIN28+contributes+to+proliferation+and+survival+of+mouse+primary+cortical+neurons+in+vitro.">Expression of exogenous LIN28 contributes to proliferation and survival of mouse primary cortical neurons in vitro.</a> Neuroscience. 248C, 448-458 (2013).</li><li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+electroporation+followed+by+primary+neuronal+culture+for+studying+gene+function+in+subset+of+cortical+neurons.">In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons.</a> J. Vis. Exp. (44), (2010).</li><li>Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+expression+of+different+transgenes+in+neurons+and+glia+by+combining+in+utero+electroporation+with+the+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+system.">Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system.</a> Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).</li><li>Miyagi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sox-2+regulatory+regions+display+their+activities+in+two+distinct+types+of+multipotent+stem+cells.">The Sox-2 regulatory regions display their activities in two distinct types of multipotent stem cells.</a> Mol. Cell. Biol. 24 (10), 4207-4220 .</li><li>Wang, X., Qiu, R., Tsark, W., Lu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+promoter+analysis+in+developing+mouse+brain+and+genetic+labeling+of+young+neurons+by+doublecortin-DsRed-express.">Rapid promoter analysis in developing mouse brain and genetic labeling of young neurons by doublecortin-DsRed-express.</a> J. Neurosci. Res. 85 (16), 3567-3573 (2007).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb. Cortex. 19, 120-125 (2009).</li><li>Bouabe, H., Gene Okkenhaug, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=targeting+in+mice:+a+review.">targeting in mice: a review.</a> Methods Mol. Biol. 1064, 315-336 (2013).</li><li>Ferguson, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-autonomous+requirement+for+the+cell+cycle+regulatory+protein,+Rb,+in+neuronal+migration.">A cell-autonomous requirement for the cell cycle regulatory protein, Rb, in neuronal migration.</a> EMBO J. 24 (24), 4381-4391 (2005).</li><li>Lagace, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+contribution+of+nestin-expressing+stem+cells+to+adult+neurogenesis.">Dynamic contribution of nestin-expressing stem cells to adult neurogenesis.</a> J. Neurosci. 27 (46), 12623-12629 (2007).</li><li>Andrusiak, M. G., Vandenbosch, R., Park, D. S., Slack, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinoblastoma+protein+is+essential+for+survival+of+postmitotic+neurons.">The retinoblastoma protein is essential for survival of postmitotic neurons.</a> J. Neurosci. 32 (42), 14809-14814 (2012).</li><li>Shan, B., Chang, C. Y., Jones, D., Lee, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+E2F-1+mediates+the+autoregulation+of+RB+gene+expression.">The transcription factor E2F-1 mediates the autoregulation of RB gene expression.</a> Mol. Cell. Biol. 14 (1), 299-309 .</li><li>Ferland, R. J., Cherry, T. J., Preware, P. O., Morrisey, E. E., Walsh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Characterization of Foxp2 and Foxp1 mRNA and protein in the developing and mature brain. 460 (2), 266-279 (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Dois dos principais desafios na realização em electroporations útero são: 1) prevenção de mortalidade do embrião e 2) diminuir a variabilidade entre electroporations. Um dos fatores mais importantes na prevenção de letalidade é a qualidade da agulha, como agulhas grossas infligir mais danos ao embrião. Quando o corte da agulha, de manter a ponta tanto tempo quanto possível, enquanto que permite ainda uma gota visível de 0,1-0,2 uL de fluido apareça na sequência de uma bomba do pé da pá...

Migração radial é um processo fundamental para o desenvolvimento cortical precoce. Ele depende de uma variedade de factores celulares autónomos, tais como saída correcta mitótico e diferenciação neuronal, da polaridade celular, regulação da dinâmica do citoesqueleto e expressão de receptores transmembranares, bem como não-celulares factores autónomos, tais como a formação do andaime glial radial e secreção de orientação migratória moléculas 1-3. Uma vez que a interrupção de qualquer destes mecanismos pode prejudicar a migração neuronal num modelo de ratinho transgénico 4-8, determinando a causa subjacente a um defeito na migração pode ser um processo complexo e difícil. No útero electroporação (IUE) pode ser utilizado para complementar e simplificar interpretação do fenótipo de um modelo genético de knock-out e assim elucidar mecanismos importantes necessários para a migração radial 7,9-11. No útero electroporação (IUE) é o processo pelo qual um plasmídeo carryi<html> ng tanto um gene de interesse e um repórter é injectado no ventrículo do cérebro de um embrião de ratinho ou de rato e, em seguida, arrastada para as células que revestem o ventrículo através da utilização de uma corrente eléctrica 12-14. Isto permite ao investigador para analisar o efeito de cima ou para baixo regulação de um gene de interesse no desenvolvimento ou função de neurónios electroporadas. Seguindo IUE, cérebros podem ser processados ​​por imuno-histoquímica 7,9-11, eletrofisiologia 15 ou cultura celular 16,17. A principal vantagem da IUE é que permite a manipulação é altamente específica da expressão do gene. Além disso, IUE pode ser utilizado como alvo uma região específica do cérebro em desenvolvimento por meio de uma corrente dirigida (Figura 2). IUE também pode ser utilizado para atingir um tipo de célula específico através da injecção de plasmídeos que transportam os genes sob o controle de diferentes promotores ou sistemas de activação plasmídeo (expressão do gene da tetraciclina é induzido um exemplo) 10,18-21. jove_content &quot;&gt; IUE pode ser usado em conjunto com o sistema de excisão de genes mediada por Cre-Lox 7-9,11,22. Um plasmídeo contendo um gene que codifica a mensagem para a proteína Cre pode ser electroporada em um embrião homozigótica para o alelo floxed ( em que as regiões do gene ou ADN específicas estão flanqueados por dois locais loxP para recombinação de ADN mediada Cre). Cre irão então induzir a recombinação do gene de interesse, especificamente em precursores neuronais electroporadas, gerando um knock-out do efeito de floxed allele.The proteína knockdown sobre migração e desenvolvimento dentro dos neurônios individuais neural pode então ser estudado. Eletroporação de Cre induz recombinação em apenas uma pequena população de células afetadas, deixando o ambiente de suporte intacta. Em contraste, a expressão tecido específico de Cre sob o controle de um tipo específico de célula promotor, ocorre ao longo de todo o tecido, de modo que ambos os neuroblastos migram e o ambiente circundante poderia ser afectada. Assim, juxtaposition dessas duas abordagens podem determinar se um determinado defeito migração é devido à célula mecanismos não-autónomos autônomos ou celulares. Migração com defeito em ambos os sistemas experimentais sugerem que o fenótipo resultados observados de um mecanismo autônomo celular; migração normal após a electroporação de Cre com migração defeituoso em um modelo Cre específica para tecidos indica que o gene de interesse está a actuar através de um mecanismo autónomo não-célula. IUE também pode ser usado para realizar experimentos de resgate por electroporating potenciais genes que interagem em knock out animais 7,9,10. Por exemplo, um investigador poderia tentar recuperar um fenótipo migração num modelo transgénico por electroporating um alvo a jusante e determinar se o defeito de migração é corrigida nos neurónios electroporadas. Isto tem a vantagem adicional de que um resgate com êxito indica que a migração normal pode ser restaurada através da manipulação de expressão de proteína numa specas neurónio, embora o ambiente circundante é ainda deficiente para o gene alvo. Mais uma vez, esta abordagem é mais tempo e de custo eficaz do que cruzar ou a geração de linhagens transgênicas, com o benefício adicional de determinar se o mecanismo defeituoso é célula autônoma. IUE pode ser usado para controlar a migração de neurónios através de electroporação de um plasmídeo repórter em knock out embriões (Figura 4C). Como apenas os neurónios que revestem o ventrículo no momento da cirurgia são electroporadas 17, IUE pode ser usado para seguir os neurónios carregados em um momento específico, com a vantagem da visualização da sua morfologia in vivo. Finalmente, é possível utilizar IUE alvo regiões do cérebro tais como o telencéfalo ou medial dorsal, hipocampo ou eminência ganglionar (Figura 2). Isso dá aos pesquisadores o poder de investigar a função do gene em um independente de complicações resultado específico áreaPasso da proteína knockdown em estruturas vizinhas. Proteína do retinoblastoma (pRb), p107 e p130 compreendem a família de proteínas de bolso e são bem reguladores de saída do ciclo celular estabelecida. No entanto, há evidências crescentes de que estas proteínas regulam também aspectos independentes do ciclo celular de desenvolvimento neural. Como mostramos anteriormente, pRb e p107 desempenham um papel crucial em ambos tangencial 4,23 e migração radial 6. Aqui, demonstramos o papel da proteína de bolso pRb e membros da família p107 sobre a migração neuronal 6 para exemplificar o uso de electroporação in utero de Cre num modelo transgénico. Em resumo, IUE fornece uma maneira poderosa de analisar os efeitos de células autônomas de deleção do gene (ou sobre-expressão). Quando combinado com tecido específico nocautear modelos, IUE pode fornecer informações adicionais sobre os mecanismos que controlam a migração neural.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="538">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:233px;">Table 1: Equipment and Materials</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:119px;">Product Name</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:177px;">Description</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:119px;">ECM 830 Square Wave Electroporator</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0052</td>
			<td style="width:177px;">Electroporator only &#8211; buy cables separately (45-0204)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">1250FS Footswitch for ECM 830</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0211</td>
			<td style="width:177px;">Foot paddle is necessary for hands-free electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Tweezertrodes</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0489 (5mm)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 45-0488 (7mm)</td>
			<td style="width:177px;">Platinum forcep style electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Femtojet</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920010504</td>
			<td style="width:177px;">Microinjector</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Griphead 0</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007414</td>
			<td style="width:177px;">Holds the pulled needle</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Universal Capillary Holder</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007392</td>
			<td style="width:177px;">Connects griphead to tube</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Injection Tube</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007431</td>
			<td style="width:177px;">Connects capillary holder to Femtojet</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Foot Control</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920005098</td>
			<td style="width:177px;">Foot paddle for hands-free injection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Microloader Tips</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">930001007</td>
			<td style="width:177px;">Tips for loading the pulled capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Plasmid Mega Kit</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">12181</td>
			<td style="width:177px;">5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Fast Green FCF</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">F7252-5G</td>
			<td style="width:177px;">Non-toxic dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">14084-08</td>
			<td style="width:177px;">For trimming the needles</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Bonn Strabismus Scissors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">14084-09</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Graefe Forceps</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">11050-10</td>
			<td style="width:177px;">Straight</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Colibri Retractors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">17000-03</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Stapler</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">12031-07</td>
			<td style="width:177px;">For 7mm clips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Castroviejo Needle Holder</td>
			<td style="width:115px;">Medical Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">SNH-6737</td>
			<td style="width:177px;">Straight, with lock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Needle Puller</td>
			<td style="width:115px;">Narishige</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">PC-10</td>
			<td style="width:177px;">For pulling microcappillaries</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Microcapillaries</td>
			<td style="width:115px;">Drummond</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">1-000-800</td>
			<td style="width:177px;">0.4 mm inner diameter glass capillary tubes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of protein deletion through in utero electroporation to define deficits in neuronal migration in transgenic models

Deleção genética utilizando o sistema Cre-Lox em linhas de camundongos transgênicos é uma poderosa ferramenta usada para estudar a função da proteína. No entanto, exceto nos modelos Cre muito específicos, a eliminação de uma proteína em toda uma população tecido ou célula muitas vezes leva a fenótipos complexos resultantes de múltiplos mecanismos de interação. A determinação de se um fenótipo resultados de ruptura de um mecanismo autónomo célula, o que é intrínseco à célula em questão, ou a partir de um mecanismo autónomo não-célula, o que resulta do prejuízo do ambiente da célula que, pode ser difícil de discernir. Para se conhecer a função da proteína num contexto in vivo, in utero electroporação (IUE) permite que a deleção do gene em um pequeno subconjunto de células dentro do córtex desenvolvimento ou alguma outra região do cérebro seleccionado. IUE podem ser utilizados para visar áreas específicas do cérebro, incluindo o telencéfalo dorsal, telencéfalo medial, hipocampo, ou eminência ganglionar. Esta observação facilita of as consequências da deleção do gene da célula autônoma no contexto de um ambiente saudável. O objetivo deste protocolo é para mostrar como IUE pode ser usado para analisar um defeito na migração radial em uma linha de camundongo transgênico floxed, com ênfase na distinção entre os celulares efeitos autônomos autónomos e não celulares de eliminação de proteína. Ao comparar o fenótipo resultante da deleção do gene dentro de todo o córtex contra deleção do gene da IUE mediada por uma população de células limitado, um maior conhecimento sobre a função da proteína no desenvolvimento do cérebro do que pode ser obtido utilizando qualquer técnica de isolamento.

Different regions of the brain can be targeted for electroporation by varying the orientation of the paddle electrodes over the embryo&#8217;s head (Figure 2). For all parts of the forebrain, the plasmid is injected into the lateral ventricle (the hind brain can be targeted by injecting into the fourth ventricle). In general, place the electrodes so that the straight line between them passes through the region of interest, with DNA being drawn toward the positive electrode. To target the lateral cortex (...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models at JoVE.com

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.

Indução da Eliminação Proteína Através<em&gt; In Utero</em&gt; Eletroporação para definir défices de Migração Neuronal em modelos transgênicos

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

induction-protein-deletion-through-utero-electroporation-to-define

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

10.1K visualizações.  University of Ottawa. Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment. 

Vídeo: Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

Uma Abordagem Optogenetic para Avaliar Formação das conexões neuronais em um sistema de co-cultura

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Biologia do Desenvolvimento

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Ex Utero Eletroporação e Organotípicas Cultura Slice of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Dirigido a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivo e definitiva de células pluripotentes humanas

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

Geração de ratos geneticamente modificados através da microinjecção de oócitos

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imagem ao vivo do mouse Fusão do palato secundário

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

Aplicação de RNAi e calor-choque-induzida expressão de fator de transcrição para reprogramar as células germinativas de neurônios em c. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

Celular agregação ensaios para avaliar a vinculação do entalhe drosófila com Trans-ligantes e sua inibição pelo Cis-ligantes

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...