Este protocolo nos permite realizar uma manipulação genética in vivo em um modelo animal chave que nos permite estudar a expansão e a dobra de um neocórtex em desenvolvimento. A principal vantagem deste método está em usar alta especificidade espacial e temporal no direcionamento dessas células-tronco neurais que são o tipo de célula chave para o desenvolvimento cerebral. Antes de iniciar o procedimento, puxe capilares de vidro em um puxador de micro pipeta e use fórceps para cortar a parte distal do capilar para ajustar o diâmetro da ponta capilar.
No dia 33, adicione a concentração adequada de DNA na PBS, suplementada com 0,1% Fast Green com mistura suave, e coloque um furão feminino grávida de 3 horas em uma mesa de operação com uma almofada de calor. Confirme o nível adequado de sedação tocando a pele periocular e beliscando a pele entre o segundo e o terceiro ou terceiro e quarto dedo dos dois membros traseiros. Isoflurano pode causar efeitos adversos, incluindo náuseas e tonturas.
Ao manusear isoflurane em forma líquida, use o equipamento de proteção. Durante a cirurgia, use recipientes apropriados para capturar o gás. Injete o animal subcutâneamente com analgésico, antibiótico e glicose, e coloque pomada nos olhos do animal.
Use cortadores para raspar o abdômen e limpe a pele exposta com uma solução de água, sabão e iodo. Em seguida, seque a pele com cotonetes de gaze e desinfete com álcool e esfoliantes de iodo. Pois na eletroporação uterica, coloque uma cortina estéril sobre o animal e use um bisturi para fazer uma incisão de pele de aproximadamente 5 centímetros na linea alba.
Use uma tesoura para cortar a camada muscular e coloque cotonetes de gaze ao redor do local da incisão. Molhe a gaze com PBS e coloque o útero nos cotonetes. Usando uma pipeta com uma ponta longa, carregue um dos capilares de vidro puxados com 5 microliters de solução de DNA por embrião a ser injetado.
Conecte o capilar carregado a um suporte e conecte o outro lado do suporte a um tubo e a um porta-voz. Localize a cabeça do primeiro embrião e coloque uma fonte de luz de fibra óptica ao lado da cabeça. Usando a íris pigmentada como ponto de referência, penetre a pele, crânio e tecido cerebral com a ponta do capilar de vidro e use tubos bucais para facilitar o fornecimento de 3-5 microliters da solução de injeção no ventrículo de um dos hemisférios cerebrais.
Como a solução injetada contém 0,1% Verde Rápido, uma injeção bem sucedida resultará em uma coloração verde escura do ventrículo injetado, que agora será visível como uma estrutura em forma de rim. Após a injeção, coloque os eletrodos da pinça no útero acima da cabeça do embrião com o polo positivo acima da área a ser alvo e o polo negativo abaixo da área injetada. Defina o comprimento do pulso do eletroporato para 50 milissegundos, a tensão de pulso para 100 volts, o intervalo de pulso para um segundo, e o número de pulsos para cinco.
Quando todos os parâmetros tiverem sido definidos, pressione o Pulse"e solte rapidamente várias gotas de PBS quente no embrião eletroporado. Quando todos os embriões tiverem sido eletroporados, devolva o útero à cavidade peritírea e use uma sutura 4-0 para fechar a camada muscular com o peritônio. Feche a pele de forma semelhante e cubra a ferida com spray de alumínio.
Em seguida, devolva o animal para sua gaiola com uma fonte de calor e monitorando até a completa recumbência. Quatro dias após a eletroporação no dia 37, a maioria das células-alvo e sua descendência ainda estão nas zonas germinais e as células raramente são observadas ainda mais basicamente dentro da placa cortical. A identidade progenitora pode ser examinada por imunofluoresência para marcadores de células ciclísticas, como PCNA, enquanto um subconjunto de progenitores submetidos à mitose pode ser mostrado por marcadores como fosfo-histona 3.
No dia zero pós-natal, oito dias após a eletroporação, a prole das células-alvo se espalhou para todas as camadas histológicas. Usando uma combinação de marcadores de fator de transcrição, diferentes populações progenitoras basais podem ser reveladas. Por exemplo, Sox2 é um marcador de células progenitoras proliferativas, incluindo glia radial basal.
E a proteína cerebral T-box 2 é um marcador de progenitores basais neurogênicos, que são principalmente progenitores intermediários. No pós-natal do dia 16, a maioria das células-alvo param de se dividir e se diferenciar em neurônios e glia, com furão pós-natal dia 16 neocórtex exibindo o padrão de dobramento característico. A eletroporação no útero de embriões furões é um método extremamente poderoso para estudar a função dos genes.
Permitiu-nos estudar genes que foram implicados na expansão do neocórtex na evolução, incluindo genes específicos do homem. E usando este método poderoso, nós realmente fomos capazes de descobrir características-chave de como a expansão evolutiva do neocórtex humano provavelmente funcionou.
