Gostaria de agradecer ao Dr. Jennifer Curtiss para as fotos na fig. 1 e Jeremy Fagan e Dr. Florence Marlow pela leitura crítica do manuscrito. Nosso trabalho é apoiado pelo NIH conceder 1R01GM088202.

1. Fly dissecção cabeça <ol><li> Verifique se você tem todos os materiais à mão (incluindo a gelatina slides revestido). Prepare glutaraldeído e fixadores Ósmio (veja abaixo). Por genótipo para incorporar, fixar alíquota de solução de glutaraldeído 200μl em tubos de 1,5 ml em gelo. </li><li> Anestesiar moscas no bloco de CO 2 (que geralmente dissecar sete cabeças voam para incorporar seis por genótipo, no caso uma cabeça é destruída durante o procedimento). </li><li> Segure um pouco e pressione o tórax da mosca lado, dorsal para cima, com uma pinça e usar um bisturi afiado para cortar a cabeça. </li><li> Estabilizar a cabeça voar tocando o pescoço com a pinça e cuidadosamente cortar uma pequena parte de um olho. Isso aumenta a penetração do fixador (se você pretende usar seu olho seções para análise clonal, cortar o olho com clones não ou menor). Evite tocar e danificando o olho intacto de que será mais tarde seccionada. </li><li> Tocar a cabeça com uma pinça ou o bisturi na superfície do corte do olho e transferir a cabeça em glutaraldeído / fosfato fixador no gelo (as cabeças, muitas vezes flutuar em cima do fixador) As cabeças dissecadas não devem ser mantidos em glutaraldeído fixar por mais tempo de 15 minutos antes da adição de Ósmio. Repita os passos 1,2-1,5 com as moscas outras do mesmo genótipo. </li></ol> 2. Fixação e incorporação (use luvas para todas as etapas!) <ol><li> Girar a flyheads em centrífuga Eppendorf por 1 minuto a 10.000 rpm. Continue, mesmo que cabeças não afundar. </li><li> Adicionar 200μl de solução OsO 4 e correção para, pelo menos, 30 minutos e até 1 hora no gelo. </li><li> Com uma pipeta Pasteur, retire a solução de glutaraldeído / Ósmio (certifique-se de usar procedimentos de descarte adequado dos resíduos!) E substituir com a solução de ósmio 200μl. Incubar no gelo durante 1-6 horas. Sempre assegurar as cabeças são completamente cobertas com líquido e nunca remover toda a solução, como os chefes ou os olhos poderia entrar em colapso! </li><li> Com uma pipeta Pasteur, descarte fixador, adicionar etanol 0,5-1ml de 30% e incubar por pelo menos 5 minutos no gelo (certifique-se de usar procedimentos de descarte adequado dos resíduos uma vez que o etanol agora contém ósmio!). </li><li> Repita o passo anterior com 50%, 70%, (80%), 90% e duas vezes 100% etanol. Incluem a etapa de etanol 80% se estiver usando os olhos para a análise de microscopia eletrônica. Após a etapa de lavagem de 70%, as amostras podem ser retirados do gelo. </li><li> Substituir o etanol com um volume igual de óxido de propileno (volátil, continuar a trabalhar na capa). Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Repita lavar óxido de propileno. Trabalho em lotes se o processamento de muitos genótipos em paralelo para evitar o colapso dos olhos devido à evaporação do óxido de propileno. </li><li> Remover a maioria do óxido de propileno e usando uma pipeta de plástico, adicionar cerca de 500μl de uma resina 01:01: solução de óxido de propileno. Equilibrar durante a noite a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Incorporação e disposição em moldes <ol><li> Certifique-se que todos os moldes são rotulados para acompanhar o seu genótipos diferentes, em seguida, preencher os moldes com resina 100%. Não encha demais (não &quot;altos montes&quot; sobre a superfície dos moldes quando olhando diretamente em toda a superfície do molde). Use resina dura para análise EM. </li><li> Usando uma pipeta, retirar a resina de 50% das cabeças, troque com resina 100%, e incubar por 3-4 horas em temperatura ambiente. Como cabeças são infiltradas com a resina, eles vão afundar até o fundo do tubo. </li><li> Usando um palito de dente que foi atingido em uma superfície dura uma vez para criar um pequeno gancho, a transferência de uma cabeça no momento em um molde. </li><li> Folha de alumínio lugar na área de trabalho do seu âmbito de dissecação para protegê-lo contra vazamentos de resina. </li><li> Usando uma agulha de dissecação e procurando que o seu âmbito de turbulência, a cabeça ligeiramente na resina e cuidadosamente movê-la para o fundo do molde perto da extremidade pontiaguda. </li><li> Alinhe cuidadosamente a superfície do olho (!) Intacto (ou seu plano futuro seccionamento se você quer ter seções transversais) pescoço para baixo com a parede frontal do molde, certificando-se de manter a superfície tangencial do olho cerca de metade de uma cabeça diâmetro de distância da parede do molde. Em casos raros, um colapso do olho que pode ser visto como um espaço vazio entre a superfície do olho e da cutícula cabeça. Se você tem um olho em colapso, substituí-lo com o olho 7 ª reposição. </li><li> Repita com todas as cabeças. Uma vez feito com todos os alinhamentos, re-check todos os olhos para se certificar de que eles não se movem quando você removeu a agulha da resina. </li><li> Se você tiver problemas com os olhos em movimento quando você remover a agulha de dissecação, a posição do olho, como desejado, rapidamente retrair a agulha um pouco longe da cabeça e depois lentamente retire a agulha completamente. </li><li> Asse os moldes durante a noite a 70 ° C. </li></ol> 4. Desbastar e cortar <ol><li> Remover os blocos endureceu a partir dos moldes, dobrando os moldes, kantendo faixa dos quais bloco corresponde a que o genótipo (por exemplo, armazenar em pequenos frascos de cintilação). </li><li> Para aparar, use um mandril apropriado para o seu micrótomo que é montado a face para cima em um bloco de acrílico ou alumínio. Montar o bloco para cortar, olho para cima, no mandril. </li><li> No âmbito dissecção usando uma lâmina revestida de Teflon bade, cuidadosamente cortadas apenas a camada superior do bloco. Isso vai deixar uma superfície clara, através do qual você deve ver o olho e pode, assim, prever o futuro plano de corte. Evite cortar os dedos! </li><li> Cortar o excesso de plástico em ambos os lados da cabeça e na frente (ou seja, o que costumava ser o topo do molde quando o alinhamento dos olhos) até que a maioria do plástico ao redor da cabeça é cortada. O melhor é se aproximar lentamente a cabeça, cortando várias camadas finas de plástico. </li><li> Usando uma lâmina limpa, remova cuidadosamente finas camadas de cima do olho no plano exato que você deseja para a seção mais tarde (geralmente tangencialmente aos olhos, em um leve ângulo para a superfície do molde original). </li><li> Continue até que você acabou de começar a cortar a superfície externa do olho. Certifique-se de usar áreas limpas da lâmina para obter uma superfície brilhante e transparente, o que torna mais fácil o alinhamento no micrótomo. </li><li> Para economizar em lâminas de barbear, use lâminas mais velhos para o corte bruto em torno dos lados do bloco e use uma lâmina nova para o recorte fino (primeiro corte e 4.6). No final, você terá uma pirâmide de três lados com um pouco inclinado, top de corte que corresponde ao seu plano de corte futuro. </li><li> Montar o bloco no micrótomo. Corte real irá variar dependendo do tipo de micrótomo e não será descrito em detalhes aqui. Nós usamos um Sorvall MT5000 com uma faca de diamante de qualidade histo para cortar 0,5 a 1 Hm seções. Para análise microscópica de luz, pequenas variações na espessura do corte, não importa. Se clones secção marcada por uma seção Branco + transgene, 1 Hm seções para garantir a ter grânulos de pigmento o suficiente adjacente ao rhabdomeres por seção (Fig. 2). </li><li> Seções irá flutuar na água. Levante primeiros 20-30 seções com uma extremidade achatada de uma madeira Q ponta de baixo da superfície da água em um movimento rotativo e transferi-los para uma gota de água numa lâmina de vidro revestido de gelatina (mantida em uma placa de aquecimento em torno de 100 ° C ). </li><li> Repita com outra secções 20-30. Espere até que a água tenha evaporado e seções manter o slide. Normalmente, as secções de 3 olhos dispostos em três colunas (três olhos) por linhas twp (superior / inferior seções) se encaixam bem em um slide. </li></ol> 5. Coloração e análise microscópica <ol><li> A menos que clones de corte, as seções mancha. Slides lugar com seções em um bloco de aquecimento fixada em 90 ° C. Dispense toluidina azul solução de coloração de uma seringa de 30 ml conectada a um filtro de 0.22μm para o slide e mancha por 10 segundos. Lave imediatamente extensivamente com água destilada. Ar seco. </li><li> Usando uma pipeta de plástico, distribuir 3 gotas de meio de montagem DPX para o slide e cobrir com uma lamela. Top com 3 moedas de dez centavos e deixar o meio de montagem endurecer (por exemplo, durante a noite a temperatura ambiente). </li><li> Imagem com um microscópio de luz. Use uma lente de 5x ou 10x para encontrar uma boa seção e depois mudar para uma lente de 63x óleo de imersão para uma análise detalhada e fotografar. Costumamos usar as configurações de contraste de fase, mas darkfield óptica funcionar tão bem. </li></ol> 6. Resultados representativos: Mais freqüentemente, os olhos são incorporados em plástico para uma análise detalhada dos fenótipos externa olho áspera detectados como parte de uma tela de genética ou em processo de testes de interações genéticas com genes conhecidos por afetar tanto a estrutura dos olhos em geral ou polaridade. Os resultados típicos de seções olhos são mostrados na Figura 3. Do tipo selvagem omatídeos (Fig. 3A) mostram o complemento total de fotorreceptores cercado por uma grade de células de pigmento. Em contraste, em um estrabismo (stbm, aka van gogh-7) mutante, a polaridade ommatidial está perdido e, embora o complemento fotorreceptoras completa está presente, rotação e quiralidade são randomizados (Fig. 3B). Além disso, desde o alelo stbm seccionado estava em aw - fundo, os grânulos de pigmento estão faltando na figura. 3B. Figura 3C mostra um exemplo de uma análise clonal. Drosophila Rho quinase (drok) é necessária para a rotação ommatidial bem como para a integridade estrutural do olho 8. Homozigotos drok dois clones podem ser identificados pela ausência de pigmento nas células de pigmento ea rhabdomeres (tipicamente, os clones são induzidos usando eyeless-FLP e um P-elemento com um gene marcador fortemente expressa branco complementando uma w fundo - mutação na natureza do tipo e do tecido heterozigotos). Assim, é possível identificar áreas mutantes pela sua falta de pigmento. Devido à célula-autonomia da pigmentação na R-cells mencionado anteriormente, os genótipos de cada um R-células pode ser determinada (ver setas na figura. 3C). <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Drosophila O olho é um sistema excelente modelo para os biólogos, pois, em contraste com a superfície lisa de um olho do tipo selvagem (A), a superfície de um olho mutante é externamente com freqüência em bruto (B), indicativa de fenótipos olho subjacente . Em todas as figuras, é anterior à esquerda e dorsal é para cima. Cortesia de imagens de Dr. Jennifer Curtiss, NMSU, Las Cruces, NM, EUA. <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Luz imagens microscópicas de omatídeos única seccionados usando o método descrito. Apenas sete R-células são visíveis a uma vez por omatídeo, uma vez que R7 está no topo do R8. (A, A &#39;) No nível R7, o corpo da célula de R7 é detectado entre R1 e R6 (seta amarela em A&#39;). Em contraste, a nível R8 (B), o corpo celular do R8 é detectado entre R1 e R2 (seta amarela na B &#39;). Setas azuis marcam a grânulos de pigmento que pode ser usado como um marcador de células de pigmento-autônomas. <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Seções tangencial através do tipo selvagem (A), stbm (B) e drok (C) mutante olhos adulto Drosophila. Esquemas abaixo as seções indicam a polaridade de omatídeos (ver (A) para setas). Círculos representam omatídeos com defeitos no complemento fotorreceptoras. As linhas amarelas representam a linha dorsal / ventral de simetria (Equador). Em contraste com os omatídeos bem orientada de tipo selvagem (A), a organização planar é perdido no mutante stbm (B). Note-se que a seção do mutante stbm mostrado falta de pigmento, devido à sua w - fundo mutantes. (C) Porque drok mutações são letais, eles têm que ser analisados ​​em clones. Assim, as células pigmentadas são do tipo selvagem ou heterozigoto (preenchido setas azuis), enquanto R-células de pigmento falta (aberto setas azuis) são mutantes homozigotos. Além de defeitos de rotação, os mutantes drok também mostram defeitos estruturais, incluindo números em falta ou excesso de células-R. Note-se que para a análise clonal, as seções não estão manchadas para evitar obscurecendo os grânulos de pigmento.

<ol>
	<li>Harvey, K. F., Pfleger, C. M., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+Mst+ortholog,+hippo,+restricts+growth+and+cell+proliferation+and+promotes+apoptosis.">The Drosophila Mst ortholog, hippo, restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis.</a> Cell. 114, 457-457 (2003).</li><li>Secombe, J., Li, L., Carlos, L., Eisenman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Trithorax+group+protein+Lid+is+a+trimethyl+histone+H3K4+demethylase+required+for+dMyc-induced+cell+growth.">The Trithorax group protein Lid is a trimethyl histone H3K4 demethylase required for dMyc-induced cell growth.</a> Genes Dev. 21, 537-537 (2007).</li><li>Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Drosophila+eye+differentiation.">Principles of Drosophila eye differentiation.</a> Curr Top Dev Biol. 89, 115-115 (2009).</li><li>Jenny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+signaling+in+the+Drosophila+eye.">Planar cell polarity signaling in the Drosophila eye.</a> Curr Top Dev Biol. 93, 189-189 (2010).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+in+the+Drosophila+Ommatidium.">Cell fate in the Drosophila Ommatidium.</a> Dev. Biol. 123, 264-264 (1987).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+differentiation+in+the+Drosophila+ommatidium.">Neuronal differentiation in the Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 120, 366-366 (1987).</li><li>Jenny, A., Darken, R. S., Wilson, P. A., Mlodzik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prickle+and+Strabismus+form+a+functional+complex+to+generate+a+correct+axis+during+planar+cell+polarity+signaling.">Prickle and Strabismus form a functional complex to generate a correct axis during planar cell polarity signaling.</a> Embo J. 22, 4409-4409 (2003).</li><li>Zheng, L., Zhang, J., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=frizzled+regulates+mirror-symmetric+pattern+formation+in+the+Drosophila+eye.">frizzled regulates mirror-symmetric pattern formation in the Drosophila eye.</a> Development. 121, 3045-3045 (1995).</li><li>Reinke, R., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interaction+in+the+Drosophila+Retina:+The+bride+of+sevenless+Gene+is+required+in+photoreceptor+cell+R8+for+R7+cell+development.">Cell-cell interaction in the Drosophila Retina: The bride of sevenless Gene is required in photoreceptor cell R8 for R7 cell development.</a> Cell. 55, 321-321 (1988).</li><li>Wolff, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=strabismus,+a+novel+gene+that+regulates+tissue+polarity+and+cell+fate+decisions+in+Drosophila.">strabismus, a novel gene that regulates tissue polarity and cell fate decisions in Drosophila.</a> Development. 125, 1149-1149 (1998).</li><li>Winter, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Rho-associated+kinase+(Drok)+links+Frizzled-mediated+planar+cell+polarity+signaling+to+the+actin+cytoskeleton.">Drosophila Rho-associated kinase (Drok) links Frizzled-mediated planar cell polarity signaling to the actin cytoskeleton.</a> Cell. 105, 81-81 (2001).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117, 1223-1223 (1993).</li><li>Stocker, H., Gallant, P., Dahmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods Mol Biol. 420, 27-27 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Utilizando Drosophila como modelo de organismo, telas genéticos levou à identificação de muitos dos membros fundadores de famílias de genes essenciais para a maioria das vias de sinalização altamente conservada em eucariotos superiores, incluindo os seres humanos. Uma vez que, sob condições de laboratório, um olho funcional é dispensável para a sobrevivência, o olho é um tecido particularmente adequado para a descoberta de novos genes e funções na avaliação de redes genéticas. A análise ultra-estrutural do olho da mosca utilizando o método descrito, assim, levou a descobertas fundamentais e relevantes para o desenvolvimento da doença. Inicialmente, a análise única célula clonal foi realizada utilizando clones de raios-X induzida combinada com a conhecida intimamente associada células autônomas marcadores recessivo. Mais recentemente, a disponibilidade do sistema FLP / FRT para gerar clones facilitou enormemente a análise fenotípica de mutações letais em seções olho 6,9. Análise de seções olho não é limitado a secções tangenciais descrito aqui. Se desejar, as cabeças podem ser alinhados em qualquer orientação nos moldes e seções transversais podem ser obtidos para estudar as camadas mais profundas na cabeça, como a lâmina e medula. O protocolo aqui descrito é, portanto, um método versátil para análises dos olhos e da cabeça adultos estruturas Drosophila.

Equipamentos em geral: <ul><li> Para gerais criação fly ver 10 </li><li> Microscópio de dissecção padrão (eg Nikon SMZ-645 Microscópio Zoom Stereo), de preferência com uma fonte de luz para evitar anel lançando uma sombra de suas mãos. </li><li> CO pad Fly 2, coberto com papel Whatman 3MM para fornecer proteção contra sujeira durante a dissecção. </li><li> Gelatina slides revestido: dissolver 10g de gelatina e 1g CrKSO 4 x 12 H 2 O em água 1L em uma placa de aquecimento (trazer quase a ferver, leva aproximadamente 2 horas). Dip slides bem lavados (sabão) e lavadas (dH 2 O) em suportes em solução de gelatina e deixe secar naturalmente coberto com papel alumínio durante a noite. </li><li> Forno de aquecimento (70 ° C; fornos de vácuo de idade que foram usados ​​para a secagem de nitrocelulose filtro são adequados para esta finalidade). </li><li> Micrótomo capaz de corte ultrafinos (0,5-1 mM de espessura), por exemplo, aqueles utilizados por instalações de microscopia eletrônica. Nós usamos um Sorvall MT5000 ultramicrótomo com uma faca de diamante de qualidade Histo. Facas de vidro também trabalho. </li></ul> Soluções de fixação: <ul><li> Prepare uma solução estoque de tampão fosfato de sódio 0,2 M, pH 7.2. </li><li> Prepare o glutaraldeído 2% em tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 7.2 (pode ser armazenado a 4 ° C durante 4 semanas). Faça pelo menos o suficiente para ter 200μl por genótipo você deseja incorporar. Manter no gelo. </li><li> Ósmio solução: 2% OsO 4 em 0,1 M tampão fosfato de sódio, pH 7.2. Fazer apenas o suficiente para ter 200μl por genótipo você deseja incorporar, uma vez que a solução não pode ser armazenada. Manter no gelo. </li></ul> Glutaraldeído e OsO 4 são altamente tóxicos e devem ser manuseados com extremo cuidado em uma capa bem ventilado. Use filtro dicas ao manusear OsO 4 para evitar o escurecimento de sua pipeta. Desidratação: Faça 30%, 50%, 70%, (80%), 90%, e soluções de etanol a 100%. Preferência legal de 30%, 50%, etanol 70% sobre o gelo antes de usar. Coloração solução: 1% de Toluidina-azul em Borax 1%. <table border="1"><tbody><tr><th></th><th> Macio </th><th> Difícil </th></tr><tr><td> A resina </td><td> 54g </td><td> 50g </td></tr><tr><td> B endurecedor </td><td> 44.5g </td><td> 50g </td></tr><tr><td> Acelerador C </td><td> 2.5g </td><td> 1.75g </td></tr><tr><td> Plastificante D </td><td> 10g </td><td> 0,75 g </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Preparação da resina Para preparar a resina, com cuidado, mas misturar todos os ingredientes num copo de plástico com um agitador magnético com uma barra de agitação de grande porte. Evitar bolhas. Depois de alíquota, a mistura em frascos de cintilação padrão ou recipientes semelhantes e congelar a -20 ° C. Use resina macia para todas as aplicações, a menos que suas instalações EM pede mais difícil formulação. Use luvas para manusear resina (cancerígeno em sua forma unpolymerized). Para polimerizar resina em equipamentos e resíduos, leve ao forno a 70 ° C durante a noite. Resíduos podem ser descartados com segurança e equipamentos limpos e reutilizados. Resina unpolymerized derramado podem ser limpos com isopropanol. <table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Fornecedor </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Fly pad </td><td> por exemplo, Genesee </td><td> 59-119 </td></tr><tr><td> Glutaraldeído </td><td> Sigma </td><td> G7526-10 X 10 ML </td></tr><tr><td> OsO 4 </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 0972A-20 </td></tr><tr><td> Propyleneoxide </td><td> Pescador </td><td> 04332-1 </td></tr><tr><td> Bisturi alças, para # 3 </td><td> Pescador </td><td> 22080046 </td></tr><tr><td> Lâminas de bisturi # 11 </td><td> Pescador </td><td> 08-916-5B </td></tr><tr><td> Pipetas de transferência </td><td> Pescador </td><td> 13-711-7M </td></tr><tr><td> Durcupan (R) ACM resina </td><td> Sigma (Fluka) </td><td> 44610-1EA </td></tr><tr><td> Agulha de aço de dissecação </td><td> Pescador </td><td> S17346 </td></tr><tr><td> Beem molde a incorporação de flat </td><td> Microscopia eletrônica Sci. </td><td> 70904-12 </td></tr><tr><td> Teflon revestido lâminas de barbear </td><td> Microscopia eletrônica Sci. </td><td> 71970 </td></tr><tr><td> Q-Tip (zaragatoas estéreis) </td><td> Pescador </td><td> 14-959-81 </td></tr><tr><td> Lâminas de vidro </td><td> Pescador </td><td> 12-550-143 </td></tr><tr><td> Cobrir deslizamentos n. º 1, 22X60 milímetros </td><td> Pescador </td><td> 12-531K </td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Pescador </td><td> ICN96010280 </td></tr><tr><td> Cr (III) K SO 4 dodeca </td><td> Sigma </td><td> 243361 </td></tr><tr><td> Histo faca de diamante, 6mm </td><td> Diatome EUA </td><td> 60 Sua </td></tr><tr><td> O azul de toluidina </td><td> Pescador </td><td> BP107-10 </td></tr><tr><td> Bórax (Na-tetraborato) </td><td> Pescador </td><td> AC20629-1000 </td></tr><tr><td> DPX meio de montagem </td><td> Sigma </td><td> 44581-100ML </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Materiais

preparation of adult drosophila eyes for thin sectioning and microscopic analysis

Drosophila tem sido muito utilizado como sistema modelo para estudar o desenvolvimento, principalmente devido à facilidade com que é geneticamente tratável. Ao longo dos anos, uma infinidade de cepas mutantes e truques técnicos foram desenvolvidos para permitir perguntas sofisticado para ser feita e respondida em um período razoável de tempo. Intuição fundamental para a interação dos componentes de todos os conhecidos principais vias de sinalização foi obtida em frente e verso, estudos genéticos Drosophila. O olho da mosca tem provado ser excepcionalmente adequado para análise mutacional, uma vez que, sob condições de laboratório, as moscas podem sobreviver sem os olhos funcionais. Além disso, a superfície do olho do inseto é composto por cerca de 800 olhos de cada unidade (facetas ou omatídeos) que formam uma superfície regular, lisa, quando observadas através de microscópio de dissecação. Assim, é fácil de ver se uma mutação poderia afetar o desenvolvimento do olho ou crescimento por externamente procurando a perda da superfície lisa (fenótipo &quot;olho áspero&quot;; Fig. 1.) Ou tamanho do olho em geral, respectivamente (para exemplos de telas com base em morfologia externa dos olhos ver, por exemplo 1). Subseqüentes análises detalhadas de fenótipos olho exigem a incorporação de fixação, de plástico e fino corte dos olhos dos adultos. O olho Drosophila desenvolve a partir do disco olho chamados imaginal, um saco de células epiteliais que proliferam e se diferenciam durante as fases de larva e pupa (para revisão ver 2, por exemplo). Cada omatídeo consiste de 20 células, incluindo oito fotorreceptores (PR-R ou células;. Fig 2), quatro células secretoras de lentes de cone, células de pigmento (&quot;hexágono&quot; em torno de R célula-cluster) e uma cerda. Os fotorreceptores de cada omatídeo, mais facilmente identificados por suas organelas luz sensível, o rhabdomeres, são organizados em um trapézio formado por seis &quot;exterior&quot; (R1-6) e dois &quot;interior&quot; fotorreceptores (R7 / 8; R8 [Fig. . 2] é debaixo R7 e, portanto, só visto nas seções de áreas mais profundas do olho). O trapézio de cada faceta é precisamente alinhados com os dos seus vizinhos e os eixos ântero-posterior e geral dorsoventral do olho (Fig. 3A). Em particular, os omatídeos do dorsal e ventral (setas pretas e vermelhas, respectivamente) metades do olho são imagens de espelho um do outro e correspondem a duas formas quirais estabelecido durante sinalização de célula planar polaridade (para revisão ver, por exemplo 3). O método para gerar seções semi-finas dos olhos (tais como aqueles apresentados na fig. 3) aqui descrito é ligeiramente modificada da que originalmente descrito por Tomlinson e pronto 4. Ele permite a análise morfológica de todas as células, exceto para as células cone transparente. Além disso, o pigmento da R-células (setas azuis na figura. 2 e 3) pode ser usado como um marcador de células autónomas para o genótipo de uma célula-R, necessidades assim genética de genes em um subconjunto de células-R pode ser facilmente determinada 5,6.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis at JoVE.com

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

A abordagem padrão para preparar adultos<em&gt; Drosophila</em&gt; Olhos para semi-fino de corte e análise microscópica de luz é apresentado aqui. O protocolo pode ser utilizado para análise morfológica bruta de defeitos olho, ou com os ajustes indicados podem ser usados ​​para determinar os requisitos de genética de genes em tipos específicos de células do olho (por exemplo, a análise clonal de fotorreceptores) ou para a análise de microscopia eletrônica.

Preparação de adultos Drosophila Olhos de Seccionamento Fino e análise microscópica

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

preparation-adult-drosophila-eyes-for-thin-sectioning-microscopic

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

16.1K visualizações.  Albert Einstein College of Medicine. A abordagem padrão para preparar adultos Drosophila Olhos para semi-fino de corte e análise microscópica de luz é apresentado aqui. O protocolo pode ser utilizado para análise morfológica bruta de defeitos olho, ou com os ajustes indicados podem ser usados ​​para determinar os requisitos de genética de genes em tipos específicos de células do olho (por exemplo, a análise clonal de fotorreceptores) ou para a análise de microscopia eletrônica....

Vídeo: Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

Dissecção e imunohistoquímica de larvas, pupa e adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Neurociência

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

Dissecação da Retina Pupal drosófila para imuno-histoquímica, análise ocidental e isolamento de RNA

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Biologia do Desenvolvimento

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Preparação de Desenvolvimento e Adultos Drosophila Brains e retina de imagens ao vivo

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Biologia

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the developmental mechanisms that generate neural diversity and drive circuit assembly. Given its complex three-dimensional organization, analysis of the optic lobe requires that one understand how its adult neuropils and larval progenitors are positioned relative to each other and the central brain. Here, we describe a protocol for the dissection, immunostaining and mounting of larval and adult brains for optic lobe imaging. Special emphasis is placed on the relationship between mounting orientation and the spatial organization of the optic lobe. We describe three mounting strategies in the larva (anterior, posterior and lateral) and three in the adult (anterior, posterior and horizontal), each of which provide an ideal imaging angle for a distinct optic lobe structure.

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

This protocol describes three steps to prepare larval and adult Drosophila optic lobes for imaging: 1) brain dissections, 2) immunohistochemistry and 3) mounting. Emphasis is placed on step 3, as distinct mounting orientations are required to visualize specific optic lobe structures.&#160;

Dissecção, imuno-histoquímica e montagem de cérebros de larvas e adultos de Drosophila para visualização do lobo óptico

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Preparação de Drosophila Células S2 para microscopia de luz

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Um de uma etapa simples protocolo de dissecação para Whole mount-Preparação do Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to cells, tissues, organelles, and even whole organisms. This protocol focuses on two chemical drying methods, hexamethyldisilazane (HMDS) and t-butyl alcohol (TBA), and their application to imaging of both prokaryotic and eukaryotic organisms using SEM. In this article, we describe how to fix, wash, dehydrate, dry, mount, sputter coat, and image three types of organisms: cyanobacteria (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp., and an unknown sp.), two euglenoids from the genus Monomorphina (M. aenigmatica and M. pseudopyrum), and the fruit fly (Drosophila melanogaster). The purpose of this protocol is to describe a fast, inexpensive, and simple method to obtain detailed information about the structure, size, and surface characteristics of specimens that can be broadly applied to a large range of organisms for morphological assessment. Successful completion of this protocol will allow others to use SEM to visualize samples by applying these techniques to their system.

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

SEM analysis is an effective method to aid in species identification or phenotypic discrimination. This protocol describes the methods for examining specific morphological details of three representative types of organisms and would be broadly applicable to examining features of many organismal and tissue types.

Preparação de organismos procariotas e eucariotas, utilizando secagem química para análise morfológica em microscopia eletrônica (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

<meta charset="utf8"></head><body>Imagens de alta resolução e análise de defeitos oculares de Drosophila

A Rapid, Simple Workflow for Quantification of External Adult Drosophila Structures

The Drosophila compound eye is a precisely patterned tissue that has revealed molecular mechanisms and biological processes that drive morphogenesis. It is a simple structure of repeating unit eyes, termed ommatidia, that is used to characterize genetic interactions and gene functions. Mutations that affect eye architecture can be easily detected and analyzed; hence, this system is frequently used in under-resourced institutions. Further phenotypic analysis often includes a Scanning Electron Microscope (SEM) to generate high-magnification images suitable for quantitative analysis. However, SEMs are expensive and require costly reagents; sample preparation spans days; and, often, they need full-time staff for sample preparation and instrument maintenance. This limits their utility at under-resourced institutions or during budgetary austerity. In entomology, the use of high-resolution digital imaging technology is a common practice for the identification and characterization of species. This paper describes a method that combines strategies and allows for high-resolution digital imaging of adult Drosophila structures and quantitative analysis using the open software ImageJ. The workflow is a rapid and student-friendly alternative that remedies the limitations of underfunded and under-resourced research facilities with a cost-effective and rapid approach to quantitative phenotypic analysis.

<meta charset="utf8"></head><body>Um fluxo de trabalho rápido e simples para quantificação de estruturas externas de Drosophila adulta

Here, we present a rapid, low-cost, workflow for high-resolution imaging of adult Drosophila eyes to quantify patterning and growth defects. We describe our protocol for sample preparation by point-mounting, high-resolution image acquisition, and image analysis.

Um fluxo de trabalho rápido e simples para quantificação de estruturas externas de Drosophila adulta

The Drosophila compound eye is a precisely patterned tissue that has revealed molecular mechanisms and biological processes that drive morphogenesis. It ...

Preparação de adultos Drosophila Olhos de Seccionamento Fino e análise microscópica

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Dissecção e imunohistoquímica de larvas, pupa e adulto

Dissecação da Retina Pupal drosófila para imuno-histoquímica, análise ocidental e isolamento de RNA

Preparação de Desenvolvimento e Adultos Drosophila Brains e retina de imagens ao vivo

Dissecção, imuno-histoquímica e montagem de cérebros de larvas e adultos de Drosophila para visualização do lobo óptico

Preparação de Drosophila Células S2 para microscopia de luz

Um de uma etapa simples protocolo de dissecação para Whole mount-Preparação do Adulto

Preparação de organismos procariotas e eucariotas, utilizando secagem química para análise morfológica em microscopia eletrônica (SEM)

Um fluxo de trabalho rápido e simples para quantificação de estruturas externas de Drosophila adulta

Um fluxo de trabalho rápido e simples para quantificação de estruturas externas de Drosophila adulta

Um fluxo de trabalho rápido e simples para quantificação de estruturas externas de Drosophila adulta