Gostaria de agradecer ao Dr. Jennifer Curtiss para as fotos na fig. 1 e Jeremy Fagan e Dr. Florence Marlow pela leitura crítica do manuscrito. Nosso trabalho é apoiado pelo NIH conceder 1R01GM088202.

1. Fly dissecção cabeça <ol><li> Verifique se você tem todos os materiais à mão (incluindo a gelatina slides revestido). Prepare glutaraldeído e fixadores Ósmio (veja abaixo). Por genótipo para incorporar, fixar alíquota de solução de glutaraldeído 200μl em tubos de 1,5 ml em gelo. </li><li> Anestesiar moscas no bloco de CO 2 (que geralmente dissecar sete cabeças voam para incorporar seis por genótipo, no caso uma cabeça é destruída durante o procedimento). </li><li> Segure um pouco e pressione o tórax da mosca lado, dorsal para cima, com uma pinça e usar um bisturi afiado para cortar a cabeça. </li><li> Estabilizar a cabeça voar tocando o pescoço com a pinça e cuidadosamente cortar uma pequena parte de um olho. Isso aumenta a penetração do fixador (se você pretende usar seu olho seções para análise clonal, cortar o olho com clones não ou menor). Evite tocar e danificando o olho intacto de que será mais tarde seccionada. </li><li> Tocar a cabeça com uma pinça ou o bisturi na superfície do corte do olho e transferir a cabeça em glutaraldeído / fosfato fixador no gelo (as cabeças, muitas vezes flutuar em cima do fixador) As cabeças dissecadas não devem ser mantidos em glutaraldeído fixar por mais tempo de 15 minutos antes da adição de Ósmio. Repita os passos 1,2-1,5 com as moscas outras do mesmo genótipo. </li></ol> 2. Fixação e incorporação (use luvas para todas as etapas!) <ol><li> Girar a flyheads em centrífuga Eppendorf por 1 minuto a 10.000 rpm. Continue, mesmo que cabeças não afundar. </li><li> Adicionar 200μl de solução OsO 4 e correção para, pelo menos, 30 minutos e até 1 hora no gelo. </li><li> Com uma pipeta Pasteur, retire a solução de glutaraldeído / Ósmio (certifique-se de usar procedimentos de descarte adequado dos resíduos!) E substituir com a solução de ósmio 200μl. Incubar no gelo durante 1-6 horas. Sempre assegurar as cabeças são completamente cobertas com líquido e nunca remover toda a solução, como os chefes ou os olhos poderia entrar em colapso! </li><li> Com uma pipeta Pasteur, descarte fixador, adicionar etanol 0,5-1ml de 30% e incubar por pelo menos 5 minutos no gelo (certifique-se de usar procedimentos de descarte adequado dos resíduos uma vez que o etanol agora contém ósmio!). </li><li> Repita o passo anterior com 50%, 70%, (80%), 90% e duas vezes 100% etanol. Incluem a etapa de etanol 80% se estiver usando os olhos para a análise de microscopia eletrônica. Após a etapa de lavagem de 70%, as amostras podem ser retirados do gelo. </li><li> Substituir o etanol com um volume igual de óxido de propileno (volátil, continuar a trabalhar na capa). Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Repita lavar óxido de propileno. Trabalho em lotes se o processamento de muitos genótipos em paralelo para evitar o colapso dos olhos devido à evaporação do óxido de propileno. </li><li> Remover a maioria do óxido de propileno e usando uma pipeta de plástico, adicionar cerca de 500μl de uma resina 01:01: solução de óxido de propileno. Equilibrar durante a noite a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Incorporação e disposição em moldes <ol><li> Certifique-se que todos os moldes são rotulados para acompanhar o seu genótipos diferentes, em seguida, preencher os moldes com resina 100%. Não encha demais (não &quot;altos montes&quot; sobre a superfície dos moldes quando olhando diretamente em toda a superfície do molde). Use resina dura para análise EM. </li><li> Usando uma pipeta, retirar a resina de 50% das cabeças, troque com resina 100%, e incubar por 3-4 horas em temperatura ambiente. Como cabeças são infiltradas com a resina, eles vão afundar até o fundo do tubo. </li><li> Usando um palito de dente que foi atingido em uma superfície dura uma vez para criar um pequeno gancho, a transferência de uma cabeça no momento em um molde. </li><li> Folha de alumínio lugar na área de trabalho do seu âmbito de dissecação para protegê-lo contra vazamentos de resina. </li><li> Usando uma agulha de dissecação e procurando que o seu âmbito de turbulência, a cabeça ligeiramente na resina e cuidadosamente movê-la para o fundo do molde perto da extremidade pontiaguda. </li><li> Alinhe cuidadosamente a superfície do olho (!) Intacto (ou seu plano futuro seccionamento se você quer ter seções transversais) pescoço para baixo com a parede frontal do molde, certificando-se de manter a superfície tangencial do olho cerca de metade de uma cabeça diâmetro de distância da parede do molde. Em casos raros, um colapso do olho que pode ser visto como um espaço vazio entre a superfície do olho e da cutícula cabeça. Se você tem um olho em colapso, substituí-lo com o olho 7 ª reposição. </li><li> Repita com todas as cabeças. Uma vez feito com todos os alinhamentos, re-check todos os olhos para se certificar de que eles não se movem quando você removeu a agulha da resina. </li><li> Se você tiver problemas com os olhos em movimento quando você remover a agulha de dissecação, a posição do olho, como desejado, rapidamente retrair a agulha um pouco longe da cabeça e depois lentamente retire a agulha completamente. </li><li> Asse os moldes durante a noite a 70 ° C. </li></ol> 4. Desbastar e cortar <ol><li> Remover os blocos endureceu a partir dos moldes, dobrando os moldes, kantendo faixa dos quais bloco corresponde a que o genótipo (por exemplo, armazenar em pequenos frascos de cintilação). </li><li> Para aparar, use um mandril apropriado para o seu micrótomo que é montado a face para cima em um bloco de acrílico ou alumínio. Montar o bloco para cortar, olho para cima, no mandril. </li><li> No âmbito dissecção usando uma lâmina revestida de Teflon bade, cuidadosamente cortadas apenas a camada superior do bloco. Isso vai deixar uma superfície clara, através do qual você deve ver o olho e pode, assim, prever o futuro plano de corte. Evite cortar os dedos! </li><li> Cortar o excesso de plástico em ambos os lados da cabeça e na frente (ou seja, o que costumava ser o topo do molde quando o alinhamento dos olhos) até que a maioria do plástico ao redor da cabeça é cortada. O melhor é se aproximar lentamente a cabeça, cortando várias camadas finas de plástico. </li><li> Usando uma lâmina limpa, remova cuidadosamente finas camadas de cima do olho no plano exato que você deseja para a seção mais tarde (geralmente tangencialmente aos olhos, em um leve ângulo para a superfície do molde original). </li><li> Continue até que você acabou de começar a cortar a superfície externa do olho. Certifique-se de usar áreas limpas da lâmina para obter uma superfície brilhante e transparente, o que torna mais fácil o alinhamento no micrótomo. </li><li> Para economizar em lâminas de barbear, use lâminas mais velhos para o corte bruto em torno dos lados do bloco e use uma lâmina nova para o recorte fino (primeiro corte e 4.6). No final, você terá uma pirâmide de três lados com um pouco inclinado, top de corte que corresponde ao seu plano de corte futuro. </li><li> Montar o bloco no micrótomo. Corte real irá variar dependendo do tipo de micrótomo e não será descrito em detalhes aqui. Nós usamos um Sorvall MT5000 com uma faca de diamante de qualidade histo para cortar 0,5 a 1 Hm seções. Para análise microscópica de luz, pequenas variações na espessura do corte, não importa. Se clones secção marcada por uma seção Branco + transgene, 1 Hm seções para garantir a ter grânulos de pigmento o suficiente adjacente ao rhabdomeres por seção (Fig. 2). </li><li> Seções irá flutuar na água. Levante primeiros 20-30 seções com uma extremidade achatada de uma madeira Q ponta de baixo da superfície da água em um movimento rotativo e transferi-los para uma gota de água numa lâmina de vidro revestido de gelatina (mantida em uma placa de aquecimento em torno de 100 ° C ). </li><li> Repita com outra secções 20-30. Espere até que a água tenha evaporado e seções manter o slide. Normalmente, as secções de 3 olhos dispostos em três colunas (três olhos) por linhas twp (superior / inferior seções) se encaixam bem em um slide. </li></ol> 5. Coloração e análise microscópica <ol><li> A menos que clones de corte, as seções mancha. Slides lugar com seções em um bloco de aquecimento fixada em 90 ° C. Dispense toluidina azul solução de coloração de uma seringa de 30 ml conectada a um filtro de 0.22μm para o slide e mancha por 10 segundos. Lave imediatamente extensivamente com água destilada. Ar seco. </li><li> Usando uma pipeta de plástico, distribuir 3 gotas de meio de montagem DPX para o slide e cobrir com uma lamela. Top com 3 moedas de dez centavos e deixar o meio de montagem endurecer (por exemplo, durante a noite a temperatura ambiente). </li><li> Imagem com um microscópio de luz. Use uma lente de 5x ou 10x para encontrar uma boa seção e depois mudar para uma lente de 63x óleo de imersão para uma análise detalhada e fotografar. Costumamos usar as configurações de contraste de fase, mas darkfield óptica funcionar tão bem. </li></ol> 6. Resultados representativos: Mais freqüentemente, os olhos são incorporados em plástico para uma análise detalhada dos fenótipos externa olho áspera detectados como parte de uma tela de genética ou em processo de testes de interações genéticas com genes conhecidos por afetar tanto a estrutura dos olhos em geral ou polaridade. Os resultados típicos de seções olhos são mostrados na Figura 3. Do tipo selvagem omatídeos (Fig. 3A) mostram o complemento total de fotorreceptores cercado por uma grade de células de pigmento. Em contraste, em um estrabismo (stbm, aka van gogh-7) mutante, a polaridade ommatidial está perdido e, embora o complemento fotorreceptoras completa está presente, rotação e quiralidade são randomizados (Fig. 3B). Além disso, desde o alelo stbm seccionado estava em aw - fundo, os grânulos de pigmento estão faltando na figura. 3B. Figura 3C mostra um exemplo de uma análise clonal. Drosophila Rho quinase (drok) é necessária para a rotação ommatidial bem como para a integridade estrutural do olho 8. Homozigotos drok dois clones podem ser identificados pela ausência de pigmento nas células de pigmento ea rhabdomeres (tipicamente, os clones são induzidos usando eyeless-FLP e um P-elemento com um gene marcador fortemente expressa branco complementando uma w fundo - mutação na natureza do tipo e do tecido heterozigotos). Assim, é possível identificar áreas mutantes pela sua falta de pigmento. Devido à célula-autonomia da pigmentação na R-cells mencionado anteriormente, os genótipos de cada um R-células pode ser determinada (ver setas na figura. 3C). <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Drosophila O olho é um sistema excelente modelo para os biólogos, pois, em contraste com a superfície lisa de um olho do tipo selvagem (A), a superfície de um olho mutante é externamente com freqüência em bruto (B), indicativa de fenótipos olho subjacente . Em todas as figuras, é anterior à esquerda e dorsal é para cima. Cortesia de imagens de Dr. Jennifer Curtiss, NMSU, Las Cruces, NM, EUA. <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Luz imagens microscópicas de omatídeos única seccionados usando o método descrito. Apenas sete R-células são visíveis a uma vez por omatídeo, uma vez que R7 está no topo do R8. (A, A &#39;) No nível R7, o corpo da célula de R7 é detectado entre R1 e R6 (seta amarela em A&#39;). Em contraste, a nível R8 (B), o corpo celular do R8 é detectado entre R1 e R2 (seta amarela na B &#39;). Setas azuis marcam a grânulos de pigmento que pode ser usado como um marcador de células de pigmento-autônomas. <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Seções tangencial através do tipo selvagem (A), stbm (B) e drok (C) mutante olhos adulto Drosophila. Esquemas abaixo as seções indicam a polaridade de omatídeos (ver (A) para setas). Círculos representam omatídeos com defeitos no complemento fotorreceptoras. As linhas amarelas representam a linha dorsal / ventral de simetria (Equador). Em contraste com os omatídeos bem orientada de tipo selvagem (A), a organização planar é perdido no mutante stbm (B). Note-se que a seção do mutante stbm mostrado falta de pigmento, devido à sua w - fundo mutantes. (C) Porque drok mutações são letais, eles têm que ser analisados ​​em clones. Assim, as células pigmentadas são do tipo selvagem ou heterozigoto (preenchido setas azuis), enquanto R-células de pigmento falta (aberto setas azuis) são mutantes homozigotos. Além de defeitos de rotação, os mutantes drok também mostram defeitos estruturais, incluindo números em falta ou excesso de células-R. Note-se que para a análise clonal, as seções não estão manchadas para evitar obscurecendo os grânulos de pigmento.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Utilizando Drosophila como modelo de organismo, telas genéticos levou à identificação de muitos dos membros fundadores de famílias de genes essenciais para a maioria das vias de sinalização altamente conservada em eucariotos superiores, incluindo os seres humanos. Uma vez que, sob condições de laboratório, um olho funcional é dispensável para a sobrevivência, o olho é um tecido particularmente adequado para a descoberta de novos genes e funções na avaliação de redes genéticas. A análise ultra-estrutural do olho da mosca utilizando o método descrito, assim, levou a descobertas fundamentais e relevantes para o desenvolvimento da doença. Inicialmente, a análise única célula clonal foi realizada utilizando clones de raios-X induzida combinada com a conhecida intimamente associada células autônomas marcadores recessivo. Mais recentemente, a disponibilidade do sistema FLP / FRT para gerar clones facilitou enormemente a análise fenotípica de mutações letais em seções olho 6,9. Análise de seções olho não é limitado a secções tangenciais descrito aqui. Se desejar, as cabeças podem ser alinhados em qualquer orientação nos moldes e seções transversais podem ser obtidos para estudar as camadas mais profundas na cabeça, como a lâmina e medula. O protocolo aqui descrito é, portanto, um método versátil para análises dos olhos e da cabeça adultos estruturas Drosophila.

Equipamentos em geral: <ul><li> Para gerais criação fly ver 10 </li><li> Microscópio de dissecção padrão (eg Nikon SMZ-645 Microscópio Zoom Stereo), de preferência com uma fonte de luz para evitar anel lançando uma sombra de suas mãos. </li><li> CO pad Fly 2, coberto com papel Whatman 3MM para fornecer proteção contra sujeira durante a dissecção. </li><li> Gelatina slides revestido: dissolver 10g de gelatina e 1g CrKSO 4 x 12 H 2 O em água 1L em uma placa de aquecimento (trazer quase a ferver, leva aproximadamente 2 horas). Dip slides bem lavados (sabão) e lavadas (dH 2 O) em suportes em solução de gelatina e deixe secar naturalmente coberto com papel alumínio durante a noite. </li><li> Forno de aquecimento (70 ° C; fornos de vácuo de idade que foram usados ​​para a secagem de nitrocelulose filtro são adequados para esta finalidade). </li><li> Micrótomo capaz de corte ultrafinos (0,5-1 mM de espessura), por exemplo, aqueles utilizados por instalações de microscopia eletrônica. Nós usamos um Sorvall MT5000 ultramicrótomo com uma faca de diamante de qualidade Histo. Facas de vidro também trabalho. </li></ul> Soluções de fixação: <ul><li> Prepare uma solução estoque de tampão fosfato de sódio 0,2 M, pH 7.2. </li><li> Prepare o glutaraldeído 2% em tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 7.2 (pode ser armazenado a 4 ° C durante 4 semanas). Faça pelo menos o suficiente para ter 200μl por genótipo você deseja incorporar. Manter no gelo. </li><li> Ósmio solução: 2% OsO 4 em 0,1 M tampão fosfato de sódio, pH 7.2. Fazer apenas o suficiente para ter 200μl por genótipo você deseja incorporar, uma vez que a solução não pode ser armazenada. Manter no gelo. </li></ul> Glutaraldeído e OsO 4 são altamente tóxicos e devem ser manuseados com extremo cuidado em uma capa bem ventilado. Use filtro dicas ao manusear OsO 4 para evitar o escurecimento de sua pipeta. Desidratação: Faça 30%, 50%, 70%, (80%), 90%, e soluções de etanol a 100%. Preferência legal de 30%, 50%, etanol 70% sobre o gelo antes de usar. Coloração solução: 1% de Toluidina-azul em Borax 1%. <table border="1"><tbody><tr><th></th><th> Macio </th><th> Difícil </th></tr><tr><td> A resina </td><td> 54g </td><td> 50g </td></tr><tr><td> B endurecedor </td><td> 44.5g </td><td> 50g </td></tr><tr><td> Acelerador C </td><td> 2.5g </td><td> 1.75g </td></tr><tr><td> Plastificante D </td><td> 10g </td><td> 0,75 g </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Preparação da resina Para preparar a resina, com cuidado, mas misturar todos os ingredientes num copo de plástico com um agitador magnético com uma barra de agitação de grande porte. Evitar bolhas. Depois de alíquota, a mistura em frascos de cintilação padrão ou recipientes semelhantes e congelar a -20 ° C. Use resina macia para todas as aplicações, a menos que suas instalações EM pede mais difícil formulação. Use luvas para manusear resina (cancerígeno em sua forma unpolymerized). Para polimerizar resina em equipamentos e resíduos, leve ao forno a 70 ° C durante a noite. Resíduos podem ser descartados com segurança e equipamentos limpos e reutilizados. Resina unpolymerized derramado podem ser limpos com isopropanol. <table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Fornecedor </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Fly pad </td><td> por exemplo, Genesee </td><td> 59-119 </td></tr><tr><td> Glutaraldeído </td><td> Sigma </td><td> G7526-10 X 10 ML </td></tr><tr><td> OsO 4 </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 0972A-20 </td></tr><tr><td> Propyleneoxide </td><td> Pescador </td><td> 04332-1 </td></tr><tr><td> Bisturi alças, para # 3 </td><td> Pescador </td><td> 22080046 </td></tr><tr><td> Lâminas de bisturi # 11 </td><td> Pescador </td><td> 08-916-5B </td></tr><tr><td> Pipetas de transferência </td><td> Pescador </td><td> 13-711-7M </td></tr><tr><td> Durcupan (R) ACM resina </td><td> Sigma (Fluka) </td><td> 44610-1EA </td></tr><tr><td> Agulha de aço de dissecação </td><td> Pescador </td><td> S17346 </td></tr><tr><td> Beem molde a incorporação de flat </td><td> Microscopia eletrônica Sci. </td><td> 70904-12 </td></tr><tr><td> Teflon revestido lâminas de barbear </td><td> Microscopia eletrônica Sci. </td><td> 71970 </td></tr><tr><td> Q-Tip (zaragatoas estéreis) </td><td> Pescador </td><td> 14-959-81 </td></tr><tr><td> Lâminas de vidro </td><td> Pescador </td><td> 12-550-143 </td></tr><tr><td> Cobrir deslizamentos n. º 1, 22X60 milímetros </td><td> Pescador </td><td> 12-531K </td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Pescador </td><td> ICN96010280 </td></tr><tr><td> Cr (III) K SO 4 dodeca </td><td> Sigma </td><td> 243361 </td></tr><tr><td> Histo faca de diamante, 6mm </td><td> Diatome EUA </td><td> 60 Sua </td></tr><tr><td> O azul de toluidina </td><td> Pescador </td><td> BP107-10 </td></tr><tr><td> Bórax (Na-tetraborato) </td><td> Pescador </td><td> AC20629-1000 </td></tr><tr><td> DPX meio de montagem </td><td> Sigma </td><td> 44581-100ML </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Materiais

preparation of adult drosophila eyes for thin sectioning and microscopic analysis

Drosophila tem sido muito utilizado como sistema modelo para estudar o desenvolvimento, principalmente devido à facilidade com que é geneticamente tratável. Ao longo dos anos, uma infinidade de cepas mutantes e truques técnicos foram desenvolvidos para permitir perguntas sofisticado para ser feita e respondida em um período razoável de tempo. Intuição fundamental para a interação dos componentes de todos os conhecidos principais vias de sinalização foi obtida em frente e verso, estudos genéticos Drosophila. O olho da mosca tem provado ser excepcionalmente adequado para análise mutacional, uma vez que, sob condições de laboratório, as moscas podem sobreviver sem os olhos funcionais. Além disso, a superfície do olho do inseto é composto por cerca de 800 olhos de cada unidade (facetas ou omatídeos) que formam uma superfície regular, lisa, quando observadas através de microscópio de dissecação. Assim, é fácil de ver se uma mutação poderia afetar o desenvolvimento do olho ou crescimento por externamente procurando a perda da superfície lisa (fenótipo &quot;olho áspero&quot;; Fig. 1.) Ou tamanho do olho em geral, respectivamente (para exemplos de telas com base em morfologia externa dos olhos ver, por exemplo 1). Subseqüentes análises detalhadas de fenótipos olho exigem a incorporação de fixação, de plástico e fino corte dos olhos dos adultos. O olho Drosophila desenvolve a partir do disco olho chamados imaginal, um saco de células epiteliais que proliferam e se diferenciam durante as fases de larva e pupa (para revisão ver 2, por exemplo). Cada omatídeo consiste de 20 células, incluindo oito fotorreceptores (PR-R ou células;. Fig 2), quatro células secretoras de lentes de cone, células de pigmento (&quot;hexágono&quot; em torno de R célula-cluster) e uma cerda. Os fotorreceptores de cada omatídeo, mais facilmente identificados por suas organelas luz sensível, o rhabdomeres, são organizados em um trapézio formado por seis &quot;exterior&quot; (R1-6) e dois &quot;interior&quot; fotorreceptores (R7 / 8; R8 [Fig. . 2] é debaixo R7 e, portanto, só visto nas seções de áreas mais profundas do olho). O trapézio de cada faceta é precisamente alinhados com os dos seus vizinhos e os eixos ântero-posterior e geral dorsoventral do olho (Fig. 3A). Em particular, os omatídeos do dorsal e ventral (setas pretas e vermelhas, respectivamente) metades do olho são imagens de espelho um do outro e correspondem a duas formas quirais estabelecido durante sinalização de célula planar polaridade (para revisão ver, por exemplo 3). O método para gerar seções semi-finas dos olhos (tais como aqueles apresentados na fig. 3) aqui descrito é ligeiramente modificada da que originalmente descrito por Tomlinson e pronto 4. Ele permite a análise morfológica de todas as células, exceto para as células cone transparente. Além disso, o pigmento da R-células (setas azuis na figura. 2 e 3) pode ser usado como um marcador de células autónomas para o genótipo de uma célula-R, necessidades assim genética de genes em um subconjunto de células-R pode ser facilmente determinada 5,6.

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Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

A abordagem padrão para preparar adultos<em&gt; Drosophila</em&gt; Olhos para semi-fino de corte e análise microscópica de luz é apresentado aqui. O protocolo pode ser utilizado para análise morfológica bruta de defeitos olho, ou com os ajustes indicados podem ser usados ​​para determinar os requisitos de genética de genes em tipos específicos de células do olho (por exemplo, a análise clonal de fotorreceptores) ou para a análise de microscopia eletrônica.

Preparação de adultos Drosophila Olhos de Seccionamento Fino e análise microscópica

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

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Biology

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

16.0K visualizações.  Albert Einstein College of Medicine. A abordagem padrão para preparar adultos Drosophila Olhos para semi-fino de corte e análise microscópica de luz é apresentado aqui. O protocolo pode ser utilizado para análise morfológica bruta de defeitos olho, ou com os ajustes indicados podem ser usados ​​para determinar os requisitos de genética de genes em tipos específicos de células do olho (por exemplo, a análise clonal de fotorreceptores) ou para a análise de microscopia eletrônica....

Vídeo: Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Thin Sectioning of Slice Preparations for Immunohistochemistry

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been preserved, freshly removed, or excised but kept viable, as in slice preparations of brain tissue.  Subsequent microscopic studies of this material can be challenging, as the tissue samples may be difficult to handle.  Demonstrated here is a method for obtaining thin cryostat sections of tissue with a thickness that may range from 0.2-5.0 mm.  We routinely cut 400 micron thick Vibratome brain slices serially into 5-10 micron coronal cryostat sections.  The slices are typically first used for electrophysiology experiments and then require microscopic analysis of the cytoarchitecture of the region from which the recordings were observed.  We have constructed a simple device that allows controlled and reproducible preparation and positioning of the tissue slice.  This device consists of a cylinder 5 cm in length with a diameter of 1.2 cm, which serves as a freezing stage for the slice.  A ring snugly slides over the cylinder providing walls around the slice allowing the tissue to be immersed in freezing compound (e.g., OCT).  This is then quickly frozen with crushed dry ice and the resulting  wafer  can be position easily for cryostat sectioning.  Thin sections can be thaw-mounted onto coated slides to allow further studies to be performed, such as various staining methods, in situ hybridization, or immunohistochemistry, as demonstrated here.

The present method allows reproducible cryostat sectioning of small, difficult-to-manage, tissue pieces, such as biopsies and brain slices. We utilize a simple aluminum freezing stage to facilitate handling of tissue and a standard cryostat to routinely produce 5-10 micron serial sections from 400 micron thick brain slices.

Seccionamento fina de Preparações Slice para Imunohistoquímica

Many investigations in neuroscience, as well as other disciplines, involve studying small, yet macroscopic pieces or sections of tissue that have been ...

Biologia

Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by describing the dissecting solution and capture of the adult females used in our studies. The procedure for removing the whole brain intact, including both optic lobes, is illustrated. Dissection of the overlying trachea is also shown.  The isolated brain is not only small but needs special care in handling at this stage to prevent damage to the neurons, many of which are close to the outer surface of the tissue. We show how a special holder we developed is used to stabilize the brain in the recording chamber. A standard electrophysiology set up is used for recording from single neurons or pairs of neurons. A fluorescent image, viewed through the recording microscope, from a GAL4 line driving GFP expression (GH146) illustrates how projection neurons (PNs) are identified in the live brain. A high power Nomarski image shows a view of a single neuron that is being targeted for whole cell recording. When the brain is successfully removed without damage, the majority of the neurons are spontaneously active, firing action potentials and/or exhibiting spontaneous synaptic input. This in situ preparation, in which whole cell recording of identified neurons in the whole brain can be combined with genetic and pharmacological manipulations, is a useful model for exploring cellular physiology and plasticity in the adult CNS.

This video demonstrates the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons using standard whole cell technology. It includes images of GFP labeled cells and neurons viewed during recording.

Todo Recordings celular do cérebro de adultos Drosophila

In this video, we demonstrate the procedure for isolating whole brains from adult Drosophila in preparation for recording from single neurons. We begin by ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

De alta resolução de vídeo de Rastreamento Locomotion em Adult Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Dissecção do giro denteado do hipocampo de rato adulto

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Preparação de Desenvolvimento e Adultos Drosophila Brains e retina de imagens ao vivo

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Preparação de Drosophila Células S2 para microscopia de luz

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Seções incluído em parafina e congelados de Drosophila Músculos Adulto

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great tool for the study of the molecular mechanisms underlying cell differentiation and the development and progression of various diseases, including glaucoma. Glaucoma, which comprises a family of progressive optic neuropathies, is the most common cause of irreversible blindness worldwide. Structural changes and damage within the trabecular meshwork (TM) can result in increased intraocular pressure (IOP), which is a major risk factor for developing glaucoma. However, the precise molecular mechanisms involved are still poorly understood. The ability to perform gene expression analysis will be crucial in obtaining further insights into the function of these cells and its role in the regulation of IOP and glaucoma development. To achieve this, a reproducible method for isolating highly enriched TM from frozen sections of mouse eyes and a method for downstream gene expression analysis, such as RT-qPCR and RNA-Seq is needed. The method described herein is developed to isolate highly pure TM from mouse eyes for downstream digital PCR and microarray analysis. In addition, this technique can be easily adapted for the isolation of other highly enriched ocular cells and cell compartments that have been difficult to isolate from mouse eyes. The combination of LCM and RNA analysis can contribute to a more comprehensive understanding of the cellular events underlying glaucoma.

Here, we describe a protocol for a reproducible laser capture microdissection (LCM) for isolating trabecular meshwork (TM) for downstream RNA analysis. The ability to analyze changes in gene expression in the TM will help in understanding the underlying molecular mechanisms of TM-related ocular diseases.

Captação microdissection da malha Trabecular altamente pura de olhos de rato de laser para análise de expressão do Gene

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

Automated Charting of the Visual Space of Housefly Compound Eyes

This paper describes the automatic measurement of the spatial organization of the visual axes of insect compound eyes, which consist of several thousands of visual units called ommatidia. Each ommatidium samples the optical information from a small solid angle, with an approximate Gaussian-distributed sensitivity (half-width on the order of 1&#730;) centered around a visual axis. Together, the ommatidia gather the visual information from a nearly panoramic field of view. The spatial distribution of the visual axes thus determines the eye's spatial resolution. Knowledge of the optical organization of a compound eye and its visual acuity is crucial for quantitative studies of neural processing of the visual information. Here we present an automated procedure for mapping a compound eye's visual axes, using an intrinsic, in vivo optical phenomenon, the pseudopupil, and the pupil mechanism of the photoreceptor cells. We outline the optomechanical setup for scanning insect eyes and use experimental results obtained from a housefly, Musca domestica, to illustrate the steps in the measurement procedure.

The protocol here describes the measurement of the spatial organization of the visual axes of housefly eyes, mapped by an automatic device, using the pseudopupil phenomenon and the pupil mechanism of the photoreceptor cells.

Gráfico automatizado do espaço visual dos olhos compostos housefly

This paper describes the automatic measurement of the spatial organization of the visual axes of insect compound eyes, which consist of several thousands ...

Assessment of Chemical Toxicity in Adult Drosophila Melanogaster

Human industries generate hundreds of thousands of chemicals, many of which have not been adequately studied for environmental safety or effects on human health. This deficit of chemical safety information is exacerbated by current testing methods in mammals that are expensive, labor-intensive, and time-consuming. Recently, scientists and regulators have been working to develop new approach methodologies (NAMs) for chemical safety testing that are cheaper, more rapid, and reduce animal suffering. One of the key NAMs to emerge is the use of invertebrate organisms as replacements for mammalian models to elucidate conserved chemical modes of action across distantly related species, including humans. To advance these efforts, here, we describe a method that uses the fruit fly, Drosophila melanogaster,&#160;to assess chemical safety. The protocol describes a simple, rapid, and inexpensive procedure to measure the viability and feeding behavior of exposed adult flies. In addition, the protocol can be easily adapted to generate samples for genomic and metabolomic approaches. Overall, the protocol represents an important step forward in establishing Drosophila as a standard model for use in precision toxicology.

Assessment of Chemical Toxicity in Adult Drosophila Melanogaster

This protocol describes an efficient and inexpensive method that uses liquid media to assess the effects of chemical toxicants on the viability of adult Drosophila melanogaster.

Avaliação da toxicidade química em adultos de Drosophila melanogaster

Human industries generate hundreds of thousands of chemicals, many of which have not been adequately studied for environmental safety or effects on human ...