Este protocolo se concentra em dois métodos químicos de secagem, hexamethyldisilazane e t-butyl álcool e sua aplicação de imagem tanto procarióticos quanto eucarióticos usando SEM. A principal vantagem dessa técnica é que ela não requer o uso de equipamentos especializados de secagem, como um secador de ponto crítico para preparar amostras para análise. Este protocolo descreve os métodos de uso de desidratação química e análise SEM de três tipos de organismos, mas seria amplamente aplicável ao exame de muitos tipos de organismos e tecidos.
Demonstrando o procedimento será Madison Koon, uma estudante de graduação do meu laboratório. Para começar, prepare cianobactérias por fixação durante a noite. Em seguida, transfira-os para uma plataforma de filtragem de 10 mL contendo um filtro de policarbonato de 25 mL.
Sele a arma lateral e o funil da plataforma de filtragem com rolhas de borracha para conter a cultura no funil. Depois de remover ambas as rolhas, remova o fixador por aspiração suave no frasco de filtragem. Para preparar euglenóides de algas unicelulares, fixe-as adicionando 3 gotas de 4% de tetroxida de ósmio diretamente à cultura que foi previamente transferida para uma plataforma de filtragem de 10 mL.
Após uma incubação de 30 minutos, remova as duas rolhas e remova o fixador por aspiração suave no frasco de filtragem. Lave os euglenóides fixos três vezes com 5 mL de 0,1 M de tampão fosfato pH 7.0 em temperatura ambiente por dez minutos cada, mantendo o frasco e o funil fechados com as rolhas para segurar a lavagem. Depois de remover ambas as rolhas, remova cada lavagem por vácuo suave no frasco de filtragem.
Para desidratar a amostra mantendo a imersão contínua, use uma série de etanol classificado por dez minutos em um volume de 5 mL no funil, mantendo o frasco e o funil fechados com as rolhas para conter o etanol no funil. Depois de remover as duas rolhas suavemente aspirar no frasco de filtragem para remover o etanol. Transfira a amostra para um prato de pesagem de alumínio descartável contendo apenas 100% de etanol suficiente para cobrir a amostra.
Para realizar a secagem química dos euglenóides utilizando TBA, primeiro substitua a solução 100% etanol no prato de alumínio por uma solução de 1 a 1 de TBA e 100% etanol por vinte minutos. Em seguida, substitua a solução de 1 a 1 por 100% TBA por vinte minutos e repita o processo duas vezes. Remova o TBA e substitua por apenas 100% TBA fresco suficiente para cobrir a amostra.
Coloque o prato a quatro graus celsius por dez minutos para congelar o TBA. Transfira a amostra para um desiccador de vácuo com embalagens de gel congeladas para manter a TBA congelada. Use uma bomba rotativa para evacuar e manter o vácuo para permitir que a amostra seque por sublimação a vácuo da TBA congelada por pelo menos três horas.
Para montar cianobactérias em euglenoides, rotule a parte inferior de um stub de montagem de alumínio de 25 mm para indicar o que está sendo colocado em cima. Em seguida, coloque cada filtro em uma guia adesiva de carbono presa na parte superior do stub. Para preparar drosophila melanogaster, imerso moscas anestesiadas em 1 mL de fixação por duas horas a quatro graus celsius, certificando-se de que estão completamente submersas.
Use uma pipeta de vidro para remover o fixador. Lave a amostra de Drosophila fixa em um tubo de microcentrifusagem de 1,5 mL três vezes com 1 mL de tampão fosfato de 0,1 M, pH 7,2 em temperatura ambiente por dez minutos. Use uma pipeta de vidro para remover cada lavagem, tomando cuidado para não remover a amostra.
Em seguida, desidrate a amostra em um tubo de microfuge em um volume de 1 mL usando uma série de etanol classificado por dez minutos cada. Use uma pipeta de vidro para remover cada lavagem, tomando cuidado para não remover a amostra. Mantenha a amostra no tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL com apenas 100% de etanol suficiente para cobri-la.
Para realizar a secagem química das moscas usando HMDS, substitua primeiro a solução 100% etanol por uma solução de 1 a 2 de HMDS e 100% etanol por vinte minutos. Em seguida, substitua a solução por uma solução 2 a 1 de HMDS e 100% etanol por vinte minutos. Por fim, substitua esta solução por 100% HMDS por vinte minutos e, em seguida, repita o processo uma vez.
Transfira a amostra que está em um tubo de micro centrífuga de 1,5 mL e HMDS em um prato de pesagem de alumínio descartável. Substitua o HMDS 100% por apenas 100% HMDS fresco suficiente para cobrir a amostra. Coloque a amostra dentro da folha de alumínio diretamente em uma capa de fumaça química para secar com uma tampa solta, como uma caixa para evitar que os detritos caiam sobre a amostra e deixe-a secar por 12 a 24 horas.
Para montar Drosophila, rotule a parte inferior de um stub de montagem de alumínio. Use pinças de precisão para colocar as moscas secas na posição desejada em uma guia adesiva de carbono presa ao topo de um stub sob um microscópio dissecando. Aplique adesivo condutor de prata ao redor das bordas externas dos stubs.
Use um palito para conectar a tinta prateada às moscas, garantindo condutividade, certificando-se de que a tinta não toque na área de imagem desejada. Coloque os stubs em uma caixa de suporte de stub e, em seguida, coloque a caixa aberta do suporte de stub em um desiccador e deixe a tinta prateada secar por pelo menos três horas. Para preparar o aparelho de revestimento de sputter, realize de 4 a 5 descargas de gás argônio.
Dependendo das amostras a serem revestidas, defina o temporizador para diferentes configurações como descrito no manuscrito. Sputter cubra os stubs seguindo as instruções do fabricante. Finalmente, amostras de imagem usando um microscópio eletrônico de varredura que inclui um detector de elétrons secundário com configurações que dependem da amostra usada.
A preparação bem sucedida de cianobactérias para SEM usando este protocolo rendeu imagens onde detalhes da célula, incluindo forma e textura da superfície são visíveis, bem como uma babaia de mucilagem e projeções das células. A imagem sem de uma espécie de água doce filamentosa do Colorado mostra uma bainha visível de mucilagem. A imagem sem de uma bactéria de água doce de Ohio revela células individuais que às vezes formam colônias mantidas juntas por uma fina camada de mucilagem.
As saliências semelhantes a filamentos se estendem das células individuais. Imagens de espécies filamentosas desconhecidas de um estuário de alta salinidade nas águas costeiras do Texas mostram células individuais e divisórias. O SEM foi usado para visualizar as tiras de pellicle de duas espécies euglenóides diferentes.
Ao comparar Monomorfima e Aenigmatica com monomórfica pseudo pirum, o arranjo helicoidal visível das tiras de pellicle que emergem na extremidade posterior para formar uma cauda, auxiliam na filogenia ao término. Imagens sem de olhos normais de drosophila mostram uma matriz ordenada de cerdas e lentes, mas a expressão de proteínas associadas à doença de Alzheimer cria o fenótipo ocular áspero. Genes que suprimem ou melhoram o fenótipo ocular áspero podem desempenhar um papel fisiológico na progressão da doença.
Aqui estão exemplos de potenciais quedas de poços para evitar, incluindo um exemplo da estrutura colapsada do olho a partir da técnica de secagem inadequada e carregamento de elétrons a partir de codificação sputter insuficiente que aparece durante a aquisição de imagem. Os protocolos descritos aqui utilizaram organismos que muito com cumplicidade respeitada, mas todos são favoráveis à análise sem para coletar informações morfológicas úteis e críticas para descobertas científicas que abrangem muitas subdisciplinas da biologia. Não se esqueça que trabalhar com álcool T-Butyl, Hexamethyldisilazane e tetroxida de ósmio pode ser perigoso e as medidas de segurança apropriadas devem ser sempre observadas para proteger os usuários, particularmente os estudantes que estarão lidando com esses produtos químicos.
