Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Welch (I-1657) e os NIH (RO1EY18884). PRH é um Eugene McDermott Scholar em Investigação Biomédica.

1. Introdução Neste vídeo, vamos demonstrar como preparar o cérebro e retina de Drosophila imagens ao vivo e imuno-histoquímica com foco em células fotorreceptoras. Primeiro, vamos mostrar como se preparar para dissecções cérebro. Em seguida, vamos demonstrar duas dissecções básicos comumente usado para imuno-histoquímica que formam a base para a preparação ao vivo. Estas duas preparações são o cérebro adulto e dissecções olho. Em seguida, vamos demonstrar a dissecções utilizado para geração de imagens ao vivo do cérebro adulto e em desenvolvimento, com ênfase na sua utilização para geração de imagens ao vivo de fotorreceptores. Finalmente, vamos descrever como nos tecidos imagem ao vivo e mostrar alguns exemplos de imagens ao vivo através de microscopia confocal de ressonância. 2. Preparação dissecção <ol><li> Para dissecções bom, você precisa de uma pinça afiada. Usando um bloco de nitidez ou de papel de areia muito fina (&gt; 1500), gentilmente passar o fórceps frente e para trás em cada lado até o fim do mês em um ponto bom. Usamos um padrão de pedra de afiar. Não iremos cobrir a técnica de sharpening aqui, mas note que uma pinça afiada são essenciais para dissecções ao vivo. Afiamos fórceps antes de cada dissecção. </li><li> Para dissecções cérebro adulto, coloque as moscas sobre uma almofada de CO 2 para anestesiá-lo e resolver o genótipo desejado. Para dissecções pupal, simplesmente chegar no frasco e remova cuidadosamente uma pupa com sua pinça, tomando cuidado para evitar quebrar o caso de pupa. </li><li> Umedeça um Kimwipe com água. Você vai usar isso durante a dissecção para remover detritos do seu fórceps. Posição de um prato de dissecação no palco de um estereoscópio e preenchê-lo com HL3 solução 1. Todos dissecações será realizado em HL3 para garantir que o tecido permanece vivo e saudável durante o processo de dissecção. Além disso, usamos um prato dissecção que tem uma cobertura inferior da Sylgard para proteger forceps durante a dissecção. </li><li> Agora, prepare fixação solução, se você pretende executar imuno-histoquímica. 180μL lugar de HL3 em um tubo de microcentrífuga 500μL. Adicionar 20μL de formaldeído 37% para obter uma solução de formol a 3,7%. </li><li> Finalmente, a posição da mão adequada é importante para dissecções bom. Com a posição boa mão, o fórceps será estável e capaz de controlada, movimentos sutis. Primeiro, coloque a pinça do lado do seu polegar. Em seguida, coloque o dedo indicador para baixo de tal modo que a ponta do dedo repousa no topo. Agora descansar ao lado da pinça do lado do seu dedo médio e passar para o prato dissecção. Fazer contato físico com o prato pelo seu polegar eo dedo médio. Enquanto descansava o polegar eo dedo médio no prato, planta o seu pulso no palco microscópio. Desta forma, você tem três pontos firmemente plantados nas superfícies durante a dissecção e agora é possível fazer manipulações muito sutil do fórceps. Esta técnica pode sentir um pouco estranho no início, mas com a prática, em breve você vai ser um mestre de dissecções cérebro. </li></ol> 3. Cérebro adulto <ol><li> No bloco de CO 2, orientar adultos uma mosca lado ventral com a cabeça longe de sua mão. Agarre o tórax logo abaixo da cabeça. Se feito corretamente, as pernas e se estenderá tromba. Durante a visualização sob um estereoscópio, pegue a tromba estendida com o fórceps para remover a cabeça. Descartar o corpo e submergir a cabeça. Reorientar sobre a cabeça submersa. A dissecção inteira será realizada sob solução. É muito importante para prender a cabeça com uma pinça em todos os momentos. Caso contrário, a cabeça irá flutuar e é difícil de recuperar. Se a cabeça se move fora de foco durante a dissecção, simplesmente movê-lo de volta para o plano focal sem ajustar o microscópio. Esta tarefa aparentemente simples pode ser difícil no início, mas mantendo sua cabeça em foco se tornará mais fácil ao longo do tempo. </li><li> Comece a dissecção pela primeira rasgar o tecido conjuntivo entre a tromba e os olhos. Lágrima no olho, mantendo firmemente com pelo menos um fórceps em todos os momentos. Esteja certo de que o dedo do fórceps está apenas abaixo da retina ou cutícula, para evitar danos no cérebro por baixo. Alternando direita e esquerda, use a sua pinça para arrancar a retina, trabalhando em direção a parte de trás da cabeça. Rasgar a retina vai aumentar as chances de que a lâmina permanece ligado ao lobo óptica ao longo deste dissecção. Continue em torno da parte traseira da cabeça, rasgando cutícula ao longo do caminho. Rasgam o outro olho e começar a se afastar cutícula. Enquanto você está pegando cutícula, você sabe que não está esmagando o cérebro! Com isto em mente, continue a puxar cutícula e retina afastado até que o cérebro é revelado. </li><li> Uma vez que o cérebro é visível, você pode começar a remover traquéia anexado para o cérebro (Fig. 1A). Continuar a puxar a traqueia e cutícula até o cérebro está isolado. Neste ponto, você deve redirecionar para o fundo do seu prato para tele restantes passos. Remover a traquéia restante porque seu cérebro pode flutuar de outra forma durante a lavagem de anticorpos durante a noite. Para geração de imagens de terminais fotorreceptoras, é desejável manter a lâmina, mas você precisa remover a retina, que contém os corpos celulares e pigmentos fortemente autofluorescent. Para fazer isso, puxe cuidadosamente os restos espessa e pigmentada celular sem danificar a lâmina. Esta é uma habilidade fina e requer prática. </li><li> O cérebro adulto pode ser mantido vivo por horas ou mesmo dias, utilizando as condições que vamos discutir na seção 6. Por imunohistoquímica, o cérebro adulto está pronto para ser fixado em formol. 2 Use um pipetteman P20 definido para 5μL para mover o cérebro adulto para a solução de fixação que você já preparado. Continue dissecar cérebros adultos por 20 minutos, o que deve render 10/04 cérebros. Deixe o cérebro em correção para um adicional de 40 minutos, no entanto, este tempo pode variar para a coloração ideal de anticorpos primários. Remover a solução de formaldeído e lavar os cérebros 3 vezes por 5 minutos cada, em 400μL de uma solução contendo PBS e 0,4% tritonX-100, a seguir denominada PBS-Triton. Depois de completamente de lavar a solução correção, você pode adicionar solução anticorpo primário. </li></ol> 4. Olho adulto <ol><li> Comece esta dissecção, como descrito para o cérebro adulto. Depois de submergir a cabeça e reorientar o microscópio, comece por rasgar o tecido conjuntivo entre a tromba e os olhos. Acima da tromba, separe a cutícula do olho. Agora, separado da cutícula da face inferior do olho, trabalhando em direção a parte de trás da cabeça. Com uma pinça, pegue o centro da parte traseira da cabeça. Com o outro, agarrar o olho e puxe. Permitir que o olho a se depositar no fundo do prato (Figura 1B). A lâmina provavelmente ainda ser anexados ao olho e pode ser usado para geração de imagens ao vivo dos terminais das células fotorreceptoras completamente intacto neste momento. Para continuar com imagens ao vivo de corpos celulares de fotorreceptores, vá para a seção 4.5. As próximas três seções explicam imunohistoquímica olho fixo. </li><li> Por imunohistoquímica, mover o olho para fixação usando uma solução pipetteman P20 definido para 5μL. Continue dissecar os olhos de adulto para um total de 10 minutos. Deixar os olhos em correção para um adicional de 30 minutos. Remover a solução e corrigir conduta lavagens, como descrito na dissecção cérebro adulto. </li><li> Se você deseja, em última análise a imagem da estrutura do olho ommatidial a lâmina deve ser removido agora. Devolver o olhar fixo para o seu prato dissecar e remover todas as células de gordura traquéia ou que ainda possam estar anexados. Em seguida, mantendo a parte externa do olho com uma pinça, retire a lâmina com o outro. Deve sair em uma única peça, expondo a cellbodies por baixo (Figura 1B). Tenha o cuidado de pegar a lâmina só! Caso contrário, corre o risco de separar os fotorreceptores da retina. </li><li> Usando um pipetteman P20, mover os olhos para 400uL PBS-Triton em um tubo de 500uL. Suavemente de rock-los a 4 graus durante a noite para remover o pigmento vermelho do autofluorescent fotorreceptores. No dia seguinte, você pode descartar a solução de lavagem e adicione a solução de anticorpo primário. </li><li> Para geração de imagens ao vivo de olhos adultos só usamos moscas adultas pharate, ou seja, pupas fase tardia pouco antes de eclosão. Nesta fase, os corpos fotorreceptoras cela separada dos terminais na lâmina durante a dissecção. </li><li> Adulto Pharate pupas têm bem definidas as asas, olhos, e cutícula visível através do caso de pupa. Selecione uma pupa e remover a porção anterior do caso pupal para expor a região da cabeça. Remova cuidadosamente a fina membrana interna que, adicionalmente, encerra a voar em desenvolvimento. Agarre a base da cabeça com o fórceps e puxar. Descartar o resto da pupa, mantendo a cabeça submersa. </li><li> Proceda como demonstrado na dissecção olho para imuno-histoquímica. Na fase adulta pharate, no entanto, os corpos de células fotorreceptoras irá separar mais facilmente a partir da lâmina, permitindo-lhe a imagem do corpo celular situado na retina. Além disso, a lâmina permanece ligado ao lobo óptico, permitindo-lhe a imagem da lâmina distal. Se você deseja a imagem da lâmina proximal, onde o terminal cartuchos de fotorreceptores pode ser visto, em seguida, executar a dissecção olho em uma mosca adulta, onde a lâmina é mais fortemente ligados aos olhos. </li></ol> 5. Desenvolvimento olho disco cérebro complexos <ol><li> O disco olho em desenvolvimento em 20% o desenvolvimento pupal (P +20%) tornou-se um favorito para imagens ao vivo em nosso laboratório, porque esta única camada de células relativamente grandes em desenvolvimento é facilmente observáveis ​​através de microscopia confocal. 3 </li><li> Para selecionar uma pupa de 20%, olhar para os túbulos de Malpighi, um ponto verde aparece abaixo do caso de pupa, pupa e evitar que um &quot;corpo negro&quot; 4. Depois de selecionar um submergir P +20% pupa, em HL3 em seu prato de dissecação e remova cuidadosamente uma porção anterior do saco pupal, tendo o cuidadopara não penetrar na fina membrana interna. Segure a membrana interna com o fórceps e separar. </li><li> Cuidadosamente visualizar o conteúdo liberado para encontrar o cérebro em desenvolvimento e os discos dos olhos que são bastante proeminentes (Fig. 1C). O olho complexo disco-cérebro é facilmente separados nesta fase de metamorfose. Isolar o cérebro no fundo do prato de dissecação. Separe cuidadosamente o cérebro central do lóbulo óptico. O disco lobo / olho óptica será utilizada na geração de imagens ao vivo. </li></ol> 6. Ao vivo Imaging: No microscópio <ol><li> Se desejar imagem por um curto período de tempo em apenas uma ou duas soluções, pode ser a imagem do seu tecido sobre uma lâmina de vidro. Neste caso, prepare o slide pela primeira camada na superfície com Sylgard usando as instruções do fabricante. Colocar 20μL HL3 no meio do slide. Transporte seu tecido dissecado em 20 mL adicional de HL3 ao slide. O tecido NUNCA deve ser exposto ao ar. Além disso, qualquer estresse ou tensão do manuseamento da pipeta ou tensão superficial solução deve ser evitado. </li><li> Para geração de imagens ao vivo, o tecido deve ser fixado firmemente com manipulação mínima e entre em contato. Nós firmemente a posição do cérebro usando a água-polimerização GluShield cola cirúrgica aplicada através de um microeletrodo, uma técnica de rotina usado em preparações embrionárias para eletrofisiologia 5. Obter um eletrodo de vidro como os puxou para gravações eletrofisiológicas. Quebrar a ponta e preencha com o fim GluShield usando pressão negativa gerada pela boca. Quebrar apenas o suficiente do eletrodo, que cola pode entrar. Agora uso de pressão positiva para aplicar uma pequena quantidade de cola para a Sylgard sob uma gota de HL3. Agora, definir rapidamente o tecido sobre a cola, mantendo a orientação desejada para a imagem ao vivo. Uma lente de imersão em água agora pode ser usado para geração de imagens. Se você quiser adicionar um corante membrana permeável, você pode adicioná-lo ao banho enquanto imagem. </li><li> Nós usamos um microscópio de varredura confocal Resonant que permite que imagens rápido com 6 fotobranqueamento reduzida. Para imagens durante longos períodos de tempo ou para soluções de câmbio totalmente ou várias vezes, usamos uma câmara de perfusão (Harvard IC30 confocal de imagem da câmara) que se conecta a uma bomba peristáltica que lentamente perfunde solução de cultura sobre o tecido vivo (Fig. 2A). Movimento de câmbio líquida constante e contato GluShield mínima reduzir o achatamento do tecido que tem sido observada ao longo de longos períodos de tempo 7. Note-se que para a imagem de períodos de tempo de desenvolvimento, o olho complexo disco-cérebro precisa permanecer intactos e deve ter o mínimo de contato com a cola. </li><li> Use uma lamínula revestido com uma gota de Sylgard que é raspada para torná-lo fino e liso. Dispensar 20μL HL3 para o centro da lamela e cola o tecido vivo para o Sylgard. Gerar uma junta que permitirá que as bolhas para passar através da câmara, sem expor o tecido ao vivo para o ar (Fig. 2B). A junta deve ser grossa o suficiente para evitar o esmagamento do tecido, mas fina o suficiente para trazer o tecido perto da lente do microscópio confocal; usamos 250μm em nossa instalação. Montar a câmara de perfusão, tomando cuidado para manter o tecido completamente submerso o tempo todo. Comece a perfusão inicialmente a uma taxa próxima 100μL por minuto usando uma bomba peristáltica. Esta velocidade é bastante rápido, dependendo da espessura da junta que define a altura da câmara. Para imagens na escala de horas, você pode precisar adicionar 20-hidroxiecdisona e antibióticos, mas não antifúngicos, e realizar a perfusão em velocidades muito mais baixas em torno de 10μl por minuto. Finalmente, o oxigênio da bolha que no meio de cultura que abastece a câmara de perfusão. </li></ol> 7. Resultados representativos: No final do nosso protocolo de vídeo mostramos um exemplo para geração de imagens ao vivo em células fotorreceptoras desenvolvimento, utilizando a preparação apresentados na Seção 5. Esta preparação leva vantagem de Drosophila transgênese para a célula, especificamente expressar repórteres fluorescentes. No exemplo mostrado, dois repórteres fluorescentes são expressos sob o controle do fotorreceptor driver específico GMR-Gal4 8: a membrana marcadas myrRFP eo marcador endossomal 2xFYVE-GFP 9. Conjuntos de dados de dois canais em 3D com uma caixa delimitadora de 70x70x17.5μm e um tamanho de voxel de 137x137x700nm (512x512x26) foram obtidos a cada 1 min. O filme mostra um plano selecionado ao longo do tempo neste conjunto de dados 4D que revela a dinâmica do tráfico intracelular endossomal e eventos fusão das vesículas. Imagens representativas para a preparação do tecido fixo do olho e lâmina são mostrados na fig. 3.

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Sondas fluorescentes usadas para criação de imagens Aqui nós descrevemos os pontos fortes e limitações da preparação do sistema Drosophila visual para uma seleção de sondas fluorescentes a partir de três classes: (1) Sondas que são adicionados a uma preparação tecido vivo exogenamente; (2) proteínas fluorescentes que são geneticamente codificados para os dois ao vivo e imagens fixas (3); corantes fluorescentes que são adicionadas ao tecido fixo para imuno-histoquímica. 1. Sondas exógenos: Lyso Tracker Verde DND-26 ou Red DND-99 (Invitrogen, Inc.) Estes são disponíveis comercialmente fluorescentes membrana permeável compostos que se acumulam em compartimentos fortemente acidificada na célula, o mais proeminente lisossomos, endossomos tarde, e autofagossomas. Lyso Tracker em concentrações nanomolar (que normalmente usam 50 nM) penetra na L3 e P disco olho +20% totalmente em menos de um minuto. Desde Lyso Tracker continuamente acumula e exerce um efeito alcalinizante, que imagem em menos de 5 minutos. Em contraste com os discos de olho, Lyso Tracker não penetra o cérebro sem rompimento do tecido. No entanto, cuidado rasgar da membrana externa permite a penetração de uma célula de alguns diâmetros no lóbulo óptico. Lysosensor DND-189 (Invitrogen, Inc.) Em contraste com Lyso Tracker, Lysosensor não se acumula em compartimentos acidificados, mas apresenta aumento de fluorescência em pH ácido. Lysosensor tem características de penetração que são muito semelhantes aos Lyso Tracker. Usamos Lysosensor a uma concentração de 1 Hm. 2. Sondas geneticamente codificado: Para muitos experimentos com imagens ao vivo, nós expressamos genes marcados com várias moléculas fluorescentes como GFP, TagRFP 10 ou o pHluorin pH-sensíveis 11 sob o controle do sistema binário expressão Gal4/UAS 12. Gal4 linhas que expressam em fotorreceptores em desenvolvimento incluem GMR-Gal4 (todos os fotorreceptores) 8 e mDelta0.5-Gal4 (desenvolvimento R4 e R7) 13. Vários subtipo específico Gal4 driver-linhas existem que usam diferentes promotores rodopsina 14. Particularmente útil sondas fluorescentes em imagens ao vivo são proteínas photoconvertible. Temos utilizado com sucesso Dendra2, uma proteína verde-vermelho monomérica photoconvertable 15. Note-se que Dendra2 é projetado para ser photoconvertible usando uma linha de 488nm Argon laser. No entanto, somos incapazes de alcançar a conversão usando a luz azul visível através do nosso set-up no modo de varredura ou confocal convencional ou ressonante. Em contraste, a conversão com laser de 405nm UV é eficiente. 3. Imuno-histoquímica: Para o olho adulto fixo, que muitas vezes escolher rodamina phalloidin (Invitrogen, Inc.) ou anti-Chaoptin (um anticorpo específico fotorreceptoras 16) para visualizar a estrutura rhabdomeric (Fig 1A). Uma boa maneira de analisar a estrutura do cartucho de lâmina é combinar anti-chaoptin 16, o marcador glial anti ébano-17 e anti-sec6 18 (Fig. 1B). Como mostrado na figura. 3, esta combinação de anticorpos distingue os principais pré-sináptico (chaoptin) e pós-sináptico (sec6) processos, bem como glia epiteliais (ebony) na lâmina 19. Montagem da Câmara de Perfusão Para geração de imagens ao vivo, nós empregamos uma câmara de perfusão que permite a troca lenta de soluções sem atrapalhar a preparação do tecido. Uma demonstração de reunião de câmara de perfusão está incluído no vídeo e esquematicamente mostrado na Figura 2. Assembleia da câmara de perfusão é ilustrada na Figura. 2A. Comece colocando a junta sobre a primeira amostra, e então continuar com a montagem como mostrado. A finalidade da junta é criar um espaço entre a base da câmara ea tampa, um espaço dentro do qual o tecido é selado e através do qual a solução de fluxo. O espaço dentro da junta deve incluir a entrada (solução entra aqui), a preparação do tecido, e na tomada através do qual a solução deixa a câmara. Duas características da junta são fundamentais: primeiro, a junta deve ser grossa o suficiente para o cérebro ainda fina o suficiente para permitir que imagens com uma lente de alta resolução. A espessura da junta ideal depende de set-up parâmetros específicos. Segundo, um entalhe no junta fornece um compartimento que permite que uma bolha para passar sem entrar em contato com a amostra (Fig 2B). Imagens ao microscópio Nós usamos um 63x (abertura 1.3) lente de imersão de glicerina para a câmara de perfusão ou uma lente de imersão 63x de água diretamente no meio de cultura em um slide. As lentes de glicerina fornecer mais trabalho à distância que as lentes de petróleo. Nós usamos um microscópio de varredura confocal ressonante que verifica a taxas muito mais rápido do que um scanner convencional (8000 Hz 1400 Hz em relação, respectivamente). Digitalização de ressonância permite 3-dimensional gravações ao longo do tempo em fastquadro de taxas de er. Além disso, maiores velocidades de varredura a laser reduzem significativamente fototoxicidade 6, que é uma grande preocupação para as verificações repetidas de tecido vivo. Um balanço da intensidade do laser e tensão PMT (ganho) deve ser alcançada para maximizar o sinal, minimizando o ruído e fotodegradação. Uma consideração importante ainda é que a quantidade de impacto laser em uma determinada região é determinada por resolução e zoom. Por exemplo, uma região de escolha é digitalizado com a mesma resolução de 256x256, zoom de 2x como em 512x512, zoom de 1x, mas a velocidade máxima de imagem possível viver é 4 vezes mais rápida, 256x256, zoom de 2x. Para registrar a atividade de rapidamente mover compartimentos intracelulares, conseguimos gravado com as seguintes configurações: 5 quadros por z-stack a uma taxa de um z-stack por 10 segundos com uma velocidade de digitalização de 8000 Hz e uma média de linha de 2x. Para as sessões de imagem muito sobre a escala de horas, muitas vezes reduzir a taxa de quadros para um por vários minutos e escolher áreas maiores como a preparação é mais provável a mudar. Drosophila Anatomy Sistema Visual A Figura 3 mostra a anatomia do olho adulto Drosophila (Fig. 3A), o cérebro adulto (Fig. 3B), e os 20% -25% pupal olho complexo disco / cérebro (Fig. 3C). Figura 3A ilustra o olho adultos com e sem a lâmina e células de gordura em anexo. Durante a dissecção dos olhos de adultos, a lâmina, que está no centro do olho situado em uma bacia formada pelos corpos celulares fotorreceptor (esquerda), deve ser removido sem perturbar os corpos celulares por baixo (à direita). Para a dissecção do cérebro adulto, a pessoa deve ser capaz de distinguir os corpos celulares fotorreceptor, a lâmina, o lobo óptico, o cérebro central, e traquéia (Fig. 3B). Os fotorreceptores e traquéia precisam ser removidos para esta dissecção, deixando a lâmina anexado ao lobo óptico. Para ajudar na identificação do complexo olho pupal 20-25% do disco / cérebro, uma imagem ao vivo é apresentado na Figura 3C. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. (A) cérebro adulto. (B) dos olhos dos adultos. (C) 20% -25% pupal complexo eye-disc/brain. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. (A) de montagem da câmara de perfusão e (B) posicionamento da junta relativa à amostra. <img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. (A) coloração Adulto rhabdomere usando anti-chaoptin. (B) a coloração da lâmina de adultos usando anti-chaoptin (verde, fotorreceptores), anti-ébano (vermelho, glia), e sec6 (azul, interneurônios).

Equipamentos especiais: <ol><li> Âmbito dissecção: Leica Mz12.5 com câmera digital </li><li> Leica TCS SP5 Microscópio Confocal Tandem Scanner para digitalização convencional e ressonância ao vivo microscopia de imagem, incluindo azul (488nm), verde (561nm), laranja (594nm) e vermelho-distante (633 nm), bem como lasers 63x especiais, 1,4 de glicerina e um 63x, lentes de 1,3 imersão em água. </li><li> Harvard Instruments modelo da bomba Confocal Imagem Câmara RC-30 e peristálticas 720 </li><li> Sutter Pipetar extrator P-97 </li><li> Software: Amira 5.2, Imagem Visage </li></ol>

preparation of developing and adult drosophila brains and retinae for live imaging

O<em&gt; Drosophila</em&gt; Cérebro e do sistema visual são amplamente utilizados sistemas modelo para estudar o desenvolvimento neuronal função, e degeneração. Aqui nós mostramos três preparações do cérebro e do sistema visual que cobrem o vão do desenvolvimento de olho complexo disco-cérebro no desenvolvimento de pupas de olho individual e dissecção do cérebro de moscas adultas. Todos os protocolos são otimizados para a cultura viva dos preparativos. No entanto, apresentamos também as condições para a imunohistoquímica tecido fixado, quando aplicável. Finalmente, vamos mostrar imagens ao vivo as condições para estas preparações usando convencional e ressonância 4D imagem confocal viver em uma câmara de perfusão. Juntos, estes protocolos proporcionam uma base para geração de imagens ao vivo em diferentes escalas de tempo variando de ensaios funcionais intracelulares na escala de minutos para os processos de desenvolvimento ou degenerativa na escala de muitas horas.

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Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

Este protocolo descreve três<em&gt; Drosophila</em&gt; Preparações: 1) dissecção cérebro adulto, 2) dissecção retina adulta e 3) desenvolvimento de olho disco cérebro dissecção complexos. A ênfase é colocada sobre técnicas de preparação e condições especiais para imagens ao vivo, apesar de todas as preparações podem ser usados ​​para imuno-histoquímica do tecido fixo.

Preparação de Desenvolvimento e Adultos Drosophila Brains e retina de imagens ao vivo

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

preparation-developing-adult-drosophila-brains-retinae-for-live

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

35.2K visualizações.  University of Texas Southwestern Medical Center. Este protocolo descreve três Drosophila Preparações: 1) dissecção cérebro adulto, 2) dissecção retina adulta e 3) desenvolvimento de olho disco cérebro dissecção complexos. A ênfase é colocada sobre técnicas de preparação e condições especiais para imagens ao vivo, apesar de todas as preparações podem ser usados ​​para imuno-histoquímica do tecido fixo.

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Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

Culturas primárias neuronais do cérebro de Tarde Stage Drosophila pupas

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Biologia

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Elaboração de Drosophila Os embriões para Live-Imaging Usando o protocolo gota suspensa

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscópica de fluorescência para Tomografia In-vivo Imaging de desenvolvimento Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Imagens ao vivo de Drosophila melanogaster Embrionárias Migrações hemócitos

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Seções incluído em parafina e congelados de Drosophila Músculos Adulto

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

Imagens ao vivo de extrusão celular da epiderme de Zebrafish desenvolvimento

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a plethora of mutant strains and technical tricks have been developed to allow sophisticated questions to be asked and answered in a reasonable amount of time. Fundamental insight into the interplay of components of all known major signaling pathways has been obtained in forward and reverse genetic Drosophila studies. The fly eye has proven to be exceptionally well suited for mutational analysis, since, under laboratory conditions, flies can survive without functional eyes. Furthermore, the surface of the insect eye is composed of some 800 individual unit eyes (facets or ommatidia) that form a regular, smooth surface when looked at under a dissecting microscope. Thus, it is easy to see whether a mutation might affect eye development or growth by externally looking for the loss of the smooth surface ('rough eye' phenotype; Fig. 1) or overall eye size, respectively (for examples of screens based on external eye morphology see e.g.1). Subsequent detailed analyses of eye phenotypes require fixation, plastic embedding and thin-sectioning of adult eyes.
The Drosophila eye develops from the so-called eye imaginal disc, a bag of epithelial cells that proliferate and differentiate during larval and pupal stages (for review see e.g. 2). Each ommatidium consists of 20 cells, including eight photoreceptors (PR or R-cells; Fig. 2), four lens-secreting cone cells, pigment cells ('hexagon' around R-cell cluster) and a bristle. The photoreceptors of each ommatidium, most easily identified by their light sensitive organelles, the rhabdomeres, are organized in a trapezoid made up of the six "outer" (R1-6) and two "inner" photoreceptors (R7/8; R8 [Fig. 2] is underneath R7 and thus only seen in sections from deeper areas of the eye). The trapezoid of each facet is precisely aligned with those of its neighbors and the overall anteroposterior and dorsoventral axes of the eye (Fig. 3A). In particular, the ommatidia of the dorsal and ventral (black and red arrows, respectively) halves of the eye are mirror images of each other and correspond to two chiral forms established during planar cell polarity signaling (for review see e.g. 3).
The method to generate semi-thin eye sections (such as those presented in Fig. 3) described here is slightly modified from the one originally described by Tomlinson and Ready4. It allows the morphological analysis of all cells except for the transparent cone cells. In addition, the pigment of R-cells (blue arrowheads in Fig. 2 and 3) can be used as a cell-autonomous marker for the genotype of a R-cell, thus genetic requirements of genes in a subset of R-cells can readily be determined5,6.

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

A standard approach to prepare adult Drosophila eyes for semi-thin sectioning and light microscopic analysis is presented here. The protocol can be used for gross morphological analysis of eye defects, or with the indicated adjustments can be used to determine genetic requirements of genes in specific cell types of the eye (e.g. clonal analysis of photoreceptors) or for electron microscopic analysis.

Preparação de adultos Drosophila Olhos de Seccionamento Fino e análise microscópica

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

Preparação Individual Drosophila Ovos Câmaras de imagens ao vivo

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imagens ao vivo de Apuramento celular por apoptose durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogênese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

O tomate / GFP-FLP / FRT Method for Imaging ao vivo de Mosaico Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; As células fotorreceptoras

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...