Nosso laboratório está interessado em entender como a dinâmica do pH intracelular modula os comportamentos celulares. Estamos interessados em comportamentos que contribuem para a progressão do câncer porque sabemos que o pH intracelular está aumentado na maioria dos cânceres. Fazemos muita microscopia e desenvolvemos protocolos para quantificar os dados dessas imagens.
Estamos aprendendo mais sobre as vias e processos celulares que são regulados pelo pH. A maioria das linhagens de células cancerígenas tem um pH intracelular mais alto e muitas mostram níveis aumentados de autofagia, mas não sabíamos que isso estava conectado. Recentemente, mostramos que um pH intracelular mais alto em células geneticamente normais é suficiente para aumentar a autofagia.
Nosso laboratório é um dos poucos laboratórios que estudam como o pH intracelular ou PHI regula o comportamento celular em um modelo animal inteiro. Descobrimos que o aumento da PHI promove o aumento da proliferação celular, migração celular invasiva e desorganização tecidual. Mais recentemente, descobrimos que um PHI mais alto promove a autofagia, que é uma forma de canibalismo celular.
Estamos abordando a lacuna criada pelo alto custo e complexidade da preparação de amostras para SEM, o que limita sua acessibilidade para muitos laboratórios. No estado de San Jose, não temos recursos para SEM. Por isso, desenvolvemos um protocolo mais acessível e acessível, permitindo-nos capturar as imagens de alta resolução sem a necessidade de equipamentos caros.
Este protocolo combina técnicas tradicionais usadas em entomologia e oferece uma alternativa econômica e fácil de usar à microscopia eletrônica de varredura. Ele pode ser facilmente adaptado para capturar imagens de alta resolução de diferentes partes da mosca ou diferentes espécimes. Para começar, selecione a cepa de drosófila desejada e coloque-a em um frasco contendo comida para moscas.
Incube o frasco a 25 graus Celsius até que as moscas cresçam e os adultos estejam próximos. Em seguida, anestesie as moscas adultas com dióxido de carbono e coloque-as em uma almofada de dióxido de carbono. Prepare um classificador de moscas de penas aparando uma pena de ganso para caber na extremidade cônica de uma pipeta sorológica de um mililitro.
Separe as moscas com uma pena e selecione os indivíduos com asas retas. Em seguida, adicione um mililitro de etanol a 70% em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro. Transfira as moscas selecionadas para o tubo e coloque o tubo no gelo.
Usando um punção de ponta especializado. Corte pequenos pontos triangulares de cartão de arquivo de 65 libras. Em seguida, use a pinça de ponta fina Dumont número cinco para dobrar a ponta de cada ponta em um ângulo de 90 graus.
Remova as moscas do tubo de microcentrífuga usando uma pinça de ponta fina Dumont número cinco. Seque suavemente as moscas com tecido sem fiapos para remover o excesso de etanol. Coloque cada mosca do lado esquerdo em um cartão de índice sob um microscópio de dissecação.
Usando uma pipeta de transferência, misture uma a duas gotas de cola de couro com uma a duas gotas de água deionizada em um cartão de índice. Pegue uma ponta de cartão preparada na extremidade larga com uma pinça e passe a ponta dobrada na mistura de cola e água para aplicar uma pequena quantidade de cola. Aplique a ponta dobrada da ponta do cartão no lado anterior do abdômen direito da mosca ao redor dos segmentos abdominais dois e três.
Antes que a cola seque, ajuste a mosca de modo que seu eixo posterior anterior fique perpendicular à ponta dobrada da ponta do cartão. Insira um pino de montagem número três na extremidade larga da ponta do cartão e prenda-o a um bloco de fixação de insetos. Rotule cada alfinete ou linha de alfinetes com o genótipo correspondente.
Para adquirir fotografias de alta resolução de olhos de drosófila montados em pontos, ligue o sistema de imagem de empilhamento. Em seguida, configure um corpo de câmera DSLR com uma lente telefoto de 70 a 200 milímetros conectada a uma objetiva de microscópio Apo 20x por meio de um adaptador de lente de 77 milímetros. Certifique-se de que a amostra esteja iluminada com um flash através de um difusor.
Controle o posicionamento Z da câmera usando um controlador StackShot e um trilho macro. Posicione a mosca montada no ponto no gimbal de platina universal com o olho voltado para a lente. Ajuste a posição da cabeça, usando cuidadosamente uma pinça para um alinhamento ideal.
Conecte a câmera a um laptop e ajuste as configurações de aquisição. Defina a ampliação para 20x, velocidade do obturador, 1/200 de segundo, abertura f/2.8 e ISO 400. Em seguida, defina o local para salvar a pilha de imagens resultante na pasta de arquivos desejada.
Agora, ajuste as configurações da pilha de foco na unidade de controle StackShot no modo de distância automática. Defina o tamanho do passo para cinco micrômetros e calcule o número de passos definindo as posições de início e parada da pilha de foco. Visualize a amostra no modo de visualização ao vivo com a câmera no modo de disparo automático.
Mova o trilho para que a parte mais próxima da amostra fique em foco. Em seguida, vá para o recurso mais distante de interesse e ajuste o foco. Retorne a câmera de volta ao modo de disparo manual e inicie a aquisição de imagem a partir da unidade de controle StackShot.
Após a geração de imagens, abra os arquivos de imagem adquiridos no software de empilhamento de foco referenciado. Selecione Empilhar e, em seguida, alinhe e empilhe tudo ou Pmax para gerar uma imagem empilhada. Em seguida, clique em Arquivo e salve a imagem de saída para salvar a imagem empilhada final como um arquivo tif.
Depois de obter imagens de olhos de drosófila montados em pinos, selecione a imagem empilhada para análise onde o olho está centralizado e alinhado com iluminação adequada e desfoque periférico mínimo. Abra a imagem da barra de escala de 500 micrômetros no software Fiji. Meça o comprimento da barra de escala usando a ferramenta de linha reta.
Clique em Analisar e Medir para registrar a distância de pixels, que corresponde a 500 micrômetros. Em seguida, calcule pixels por mícron e use-o para converter medições de pixel em medições de micrômetro. Abra o arquivo de imagem empilhado em Fiji.
Selecione lupa na barra de ferramentas para ampliar a área de foco. Preencha a tela com o olho e a cutícula da cabeça ao redor. Em seguida, na barra de ferramentas, selecione a ferramenta de seleção à mão livre e contorne a área da retina após a linha mais externa de omatídeos.
Para remover parte da seleção, mantenha pressionado o botão de opção e selecione os pixels a serem removidos. Para adicionar à seleção, mantenha pressionados os botões option e shift e selecione os pixels a serem adicionados. Para calcular a área, selecione Analisar e medir.
Uma nova janela exibirá os parâmetros de área, média, mínimo e máximo. Copie e cole os dados em uma planilha para documentação e conversão de pixels para medições micrométricas. A superexpressão de DNhe2 em moscas GMR-DNhe2 resultou em olhos adultos significativamente menores em comparação com moscas adultas do tipo selvagem.
As moscas GMR-DNhe2 mostraram uma redução de 41% na área dos olhos em comparação com as moscas do tipo selvagem e uma redução de 48% em comparação com as moscas heterozigóticas GMRGAL4. O tamanho do olho foi restaurado em moscas GMR-DNhe2 heterozigóticas para o alelo 3 de Atg1, elevando-o para 129,9 micrômetros quadrados de 74,28 micrômetros quadrados.
