Agradecemos a S. Robertson Jinks e E. Heidenreich para a prestação de plasmídeos e cepas de leveduras; P. Pham e MF Goodman para ajudar ensaio TLS withthe. Este trabalho foi financiado, em parte, pela Federação Americana de Aging Research concessão e pelo NIH AG20642, AG025135.

Dois modelos de vida têm sido usados ​​para estudar o envelhecimento em S. cerevisiae: RLS e CLS. A expectativa de vida replicativa (brotamento) (RLS) é baseada na observação de que as células de levedura mãe passar por um número finito de divisões 3-6. Vamos concentrar-nos na vida cronológica (CLS), um modelo baseado na sobrevivência cronológica de levedura não-divisão na cultura ou em placas de 7-11. Levedura tipo selvagem cresce exponencialmente por 10-12 horas em meio sintético dextrose (SDC) completo . Quando o nível de glicose reduz, switches levedura da fermentação para a respiração, um processo denominado mudança diauxic. As células continuam a dividir lentamente durante a fase de pós-diauxic por aproximadamente 48 horas antes de entrar no G prisão 0. A taxa metabólica das células mantém-se elevada até o dia 06/05 (dia 0 é o dia da inoculação). Viabilidade celular ao longo do tempo pode ser acessado pela porcentagem de células em ordem cronológica de envelhecimento, amostrados a cada dois dias, o que pode sair do G parada 0 e forma colônias em placas YPED ricos. 1. Levedura cronológica vida (CLS) em cultura líquida <ol><li> Inocular uma única colônia em uma média de glicose ml sintéticos completa (SDC, Tabela 1) e incubar durante a noite com agitação (220 rpm) a 30 ° C. Três colônias independentes de inóculo deve ser preparado para cada cepa para fornecer réplicas biológicas. </li><li> Diluir a cultura durante a noite em meio SDC fresco (normalmente 10 ml) para OD = 0,05-0,1 (~ diluição 1:100) e incubar com agitação (220 rpm) a 30 ° C. Este ponto é considerado o tempo 0 dia do envelhecimento cronológico. Manter uma relação de 1:5 de Cultura / frasco de volume (10 ml de cultura em 50 ml, ou para experiências mais / grande 25 ml de cultura em 125 ml) para garantir a aeração adequada. </li><li> A partir do dia 3, remover duas alíquotas de 10 ml do frasco, diluir 10 mil vezes em água esterilizada, 10 mL da cultura diluída (ie, 10 4 -10) em YEPD (extrato de levedura 1%, 2% Bacto peptona, dextrose 2% , 2% agar) placas e incubar a 30 ° C durante 48-72 horas antes de se unir formadoras de colônia (UFC) é contado. </li><li> Dia 3 UFC é considerado de sobrevivência de 100%. Fatores de diluição da cultura de envelhecimento nos dias subseqüentes devem ser ajustadas de acordo para garantir ~ 2-10 colônias no ensaio UFC (por exemplo, 10 4 -10, 10 4 -30, 10 3 -10, etc.) Para as células do tipo selvagem no fundo DBY746, o CLS chega a sobrevivência de 1% por volta do dia 11. </li></ol> Variações no ensaio de viabilidade situ incluem: <ul><li> Restrição calórica (CR) por limitação de glicose. Diluição da cultura durante a noite em meio de glicose SC limitada (como 0,5 ou 0,05%, em vez da glicose padrão de 2%) conduzem geralmente a menor densidade de população de saturação no dia 3, mas muito estendida média e máxima (10% de sobrevivência) vida útil 12. </li><li> Para CR extremo / fome, lavar o dia 3 de cultura fase estacionária (geralmente 10 ml, como no passo 3 acima) com água autoclavada (células ressuspender em igual volume de água e girar a 2500 rpm por 5 min, repetir 3 vezes). Células Incubationof em água imita a condição de fome que a levedura pode encontrar na natureza. A cada dois dias, posteriormente, cultura de envelhecimento devem ser lavadas com água autoclavada e ressuspenso em igual volume de água para remover todos os nutrientes liberados lisadas células mortas. Realizar ensaios por amostragem viabilidade da cultura do envelhecimento, como descrito acima. Esta condição de fome será levado a quase duplicação do CLS significa na estirpe selvagem DBY746 12. </li></ul> 2. Viabilidade no ensaio in situ Na cultura líquido, uma pequena fração das células sobreviventes podem re-entrou no ciclo celular e crescer utilizando demais nutrientes ou aqueles forma liberado lisadas células mortas no meio, um fenótipo denominado regrowth / ofegante 13. Nós desenvolvemos um sistema de viabilidade-on-a-placa que utiliza a auxotrophy da cepa DBY746 (trp1) para contornar a rebrota / gasping problema e também permitem testar o efeito da exposição constante ou privação de nutrientes diversos estímulos externos ou em levedura CLS 11. Este ensaio de viabilidade em situ também imita a vida replicativa modelo de tal forma que as células estão constantemente expostos aos nutrientes abundantes para a duração da análise de ciclo de vida. <ol><li> Inocular uma única colônia em uma média de glicose ml sintéticos completa (SDC) e incubar durante a noite com agitação (220 rpm) a 30 ° C. Pelo menos três inóculo de colônias independentes devem estar preparados para cada cepa para fornecer réplicas biológicas. </li><li> Deixe a cultura a crescer para ~ 10 8 células / ml (OD 600 = ~ 10), diluir a água culturewith autoclavado a 100-200 mL cell/10 (geralmente 10 a diluição de 4 vezes) e 1.000 cells/10 mL (10 3 vezes de diluição). </li><li> Placa de duas alíquotas de 10-30 mL da cultura diluída em uma placa de triptofano SDC abandono. Parar cada cepa, preparar um conjunto de 8 a 20 placas e rotulado de acordo com a densidade de revestimento (por exemplo, 10 4 vezes diluída, placa de 10 ml ou 10 4 -10, 10 4 -30, 10 3 -10, 10 3 -30 , etc), que garantem 10-100 colônias podem ser contados em antecipação de viabilidade diminuiu durante o envelhecimento. </li><li> Incubar a placa fixada em 30 ° C para a duração da análise de ciclo de vida. </li><li> No dia de revestimento e subsequentemente a cada 2 dias, remover uma placa e adicionar gota a gota, 0,5 ml triptofano (2 mg / ml) para permitir que as células viáveis ​​para crescer. Incubar as placas a 30 ° C por mais 48-72 horas. Conte o UFC para a viabilidade no dia da adição de triptofano. O UFC no dia do chapeamento é considerado de sobrevivência de 100%. </li></ol> Variações no ensaio de viabilidade situ incluem: <ul><li> Idade células em placas de agar (condição extrema de fome). Adicionar 1 ml 2x YPED em vez de triptofano em dias subseqüentes para permitir o crescimento e CFU contar 14. </li><li> Células idade em placas com meio sintético triptofano abandono completo com várias fontes de carbono, por exemplo, diferentes concentrações de glicose (restrição calórica por limitação de glicose), várias fontes de carbono, como etanol, glicerol, ácido acético 14. Adicionar 1 ml de glicose / solução de triptofano (glicose 20% e 1mg/ml triptofano) para permitir o crescimento e contagem de UFC. </li><li> Manipulação de outros nutrientes, como nitrogênio. </li></ul> 3. Danificar o DNA e frequência de mutação durante o envelhecimento cronológico Canavanina resistência (Can r) e CAN1 seqüenciamento Frequência de mutação espontânea pode ser avaliada através da medição da freqüência de resistência canavanina (Can r) em culturas cronologicamente envelhecimento. Mutações no gene CAN1 (YEL063), que codifica a arginina plasma permease, render células resistentes à arginina analógico colônias L-canavanine.Can r coletadas em momentos diferentes também podem ser salvos para a extração do DNA genômico e seqüenciamento subseqüente do CAN1 gene, que pode fornecer dados de mutação do espectro (com Surveyor Mutação, SoftGenetics). Substituições de base (Trp + reversões) Estirpes com trp1-289 contém uma mutação âmbar (C403T) na seqüência TRP1 codificação. Medição da freqüência de trp1-289 para a reversão Trp + 15 permite a estimativa da taxa de substituição de base durante o envelhecimento cronológico levedura. Quadro de mudança de mutações A Lys - estirpe EH150 (MATA, lys2ΔBglII, trp1-Δ, his3-Δ200, ura3-52, ade2-1o) abriga uma mutação II lys2ΔBgl que foi construído através da inserção de quatro nucleotídeos para criar um site de Bgl II enzima de restrição no gene LYS2 . O resultado quatro mudança nos resultados de leitura aberta quadro no auxotrophy para a lisina, que pode ser revertida por pequenos inserção / deleção mutações 16-17. Gross rearranjos cromossômicos (RCG) Para detectar rearranjos cromossômicos bruta (RCG), geramos uma estirpe mutante, em que HXT13 (YEL069), codificação de um transportador de hexose altamente redundante, foi interrompido por uma cassete URA3 18. HXT13 está localizado a 7,5 kb telomérica CAN1 no cromossomo V. Mutações em ambos os CAN1 e URA3 genes de resistência tornam células L-canavanina e 5-fluoroorotic ácido (5FOA), respectivamente. Considerando a baixa freqüência de mutações pontuais que ocorrem em ambos os genes, a análise da possível r 5FOA r freqüência fornece uma estimativa da RCG, que resultam na perda de dois genes. Recombinação homóloga e homeologous Para monitorar o nível de homólogos (100%) e recombinação homeologous (91%) durante o envelhecimento cronológico, geramos mutantes em que plasmídeos linearizados (HIS3:: intron-IR-URA3) carregando ou 100% repete homóloga invertida (IRs) (pSR406 ) ou 91% homeologous IRs (pSR407) no locus HIS3 19. Recombinação entre os IRs permite a expressão da proteína His3 funcional. <ol><li> Em paralelo ao ensaio de viabilidade normal (como descrito acima), retire uma quantidade adequada de células a partir da cultura de envelhecimento, <ol><li> para pode r mutação, comece com ~ 2x10 7 células (200 mL de cultura dia 3); </li><li> para Trp + reversão, começa com ~ 10 8 células (500-1000 mL da cultura dia 3); </li><li> de Lys + mutação quadro-shift, começar com ~ 10 8 células (500-1000 mL da cultura dia 3); </li><li> para RCG, comece com 2-3x10 8 células (2-3 ml da cultura 3 dias); </li><li> para recombinação homóloga e homeologous, e começar com til; 5x10 7 células (200-500 mL de cultura dia 3); </li></ol> ajustar a quantidade de revestimento de acordo com a diminuição da viabilidade total e aumento da frequência de mutação durante o envelhecimento cronológico (Tabela 2). Em caso de cepas com fenótipo hypermutator (tais como aqueles com deficiências no reparo do DNA), reduzir a quantidade de amostragem em conformidade. </li><li> Sedimentar as células com bancada máquina de centrifugação (6000 rpm por 5 min). </li><li> Ressuspender as células em 1 ml de água esterilizada, e agregar as células novamente. </li><li> Ressuspender celular em 100 l de água. Células da placa, <ol><li> para pode r mutação, em arginina abandono-sintético placas médio completo (SDC-Arg, suplementada com 60 mg / ml de sulfato de L-canavanina); </li><li> para Trp + reversão, em triptofano abandono placas (SDC-Trp); </li><li> de Lys + mutação quadro-shift, em lisina abandono placas (SDC-Lys); </li><li> para RCG, em arginina abandono placas (SDC-Arg), suplementado com 5FOA (1 mg / ml) e L-canavanina sulfato (60 mcg / ml); </li><li> para recombinação homóloga e homeologous, em histidina abandono placas suplementado com galactose (2%). </li></ol></li><li> Contagem de UFC após incubação de 3-4 dias &#39;a 30 ° C. A frequência de mutação é normalizado para o número de células viáveis. </li></ol> Complementares para o ensaio de viabilidade em situ, dependente da idade Trp + reversão, Lys + shift-quadro de mutação, recombinação, ou pode r também pode ser estudado em células envelhecidas na placa. <ol><li> Células da placa (~ 10 8 células / placa) para Trp, Lys, sua desistência, ou L-canavanina sintéticos placas médio completo (como descrito acima). </li><li> A cada dois dias (ou no ponto de tempo de interesse), a pontuação das colônias recém-emergentes. </li><li> Frequência de mutação é estimada através da normalização colônias emergentes para o número total de células viáveis ​​do dia específico. </li></ol> 4. Síntese Translesion (TLS) A idade-dependente aumentar a frequência de mutação pode envolver mais de dano macromolécula, proteção celular diminuída / reparo, e aumentou o reparo do DNA errônea (como Polζ dependentes de síntese translesion, TLS) durante o envelhecimento. Por exemplo, a longa duração mutantes SCH9 Δ apresentam expressão elevada de SOD2, e diminuição da expressão da enzima propenso a erros de reparo do DNA Rev1 20. Aqui nós descrevemos um ensaio que combina template DNA danificado e extrair todo nuclear para avaliar a TLS in vitro. <ol><li> Preparar o extrato nuclear, como descrito por Wang et al 21;. Quantificar a concentração de proteína pelo BCA ensaio (Pierce). </li><li> Adicionar 0, 5, 10 ou 20 mg de extratos nucleares para 50 ul (volume final) reações contendo TLS tampão (20 mM HEPES, 7 mM MgCl 2, 1 mM DTT, 25 mM NaCl, pH 7,8), 200 e 100 nM μMdNTPs 5&#39;-32 P-12-mer rotulados primer (5&#39;-TGG TAC CGA GGA-3 &#39;) recozido para um modelo de 48 mer contendo o dano ao DNA de interesse (5&#39;-ATA TCG CTG GTA CTA ATG ATT AAC GAC TXA AGC ACG TCC GTA TCG CCA-3 &#39;, em que X é o local danificado, por exemplo, abasic site, 8-oxo-G, etc.) </li><li> Incubar a mistura a 30 ° C por 30 min, terminar a reação com a adição de 2,5 mL de EDTA (20 mM) e 2 mL de proteinase K (10 mg / mL). </li><li> Purificar DNA com a extração de fenol e precipitação de etanol. </li><li> Ressuspender o DNA em 50 ul de gel de tampão de carregamento (98% formamida, 20 mM EDTA, e corante). </li><li> Resolve os produtos de síntese translesion em géis de poliacrilamida 19%. </li><li> Quantificar o TLS usando phosphorimaging (Figura 1). </li></ol> 5. Resultados representante Nós normalmente utilizado a contagem de UFC no dia 3 de 100 por cento de sobrevivência na análise CLS padrão líquido. A sobrevivência percentual nos dias subseqüentes podem ser equipados para calcular a média (50% de sobrevivência) e máximo de vida (10% de sobrevivência) abrange 12. Tempo de vida resultados obtidos a partir do ensaio de viabilidade em situ são geralmente consistentes com aqueles utilizando o ensaio CLS líquido, mas com redução da expectativa de vida média, que é devido em parte ao fato de que as células estão constantemente expostos aos nutrientes. Presença de glicose inibe a atividade de proteção celular como mostrou pela transativação redução de estresse fator de transcrição de resposta, como MSN2 / 4 e Gis1 12. Idade-dependente frequência de mutação varia muito, dependendo da tensão de fundo, a manipulação genética, condições de cultura e idade. A Tabela 2 mostra os resultados típicos obtidos na cepa do tipo selvagem (DBY746). <table border="1"><tbody><tr><th> Componente </th><th> g / L </th></tr><tr><td> D-glucose </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Sulfato de amônio </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Nitrogênio base (-AS/-AA) </td><td> 1,8 </td></tr><tr><td> NaH2PO4 </td><td> 1,4 </td></tr><tr><td></td><td> mg / L </td></tr><tr><td> Adenina </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-Arginina </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Ácido L-aspártico </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Ácido L-glutâmico </td><td> 100 </td></tr><tr><td> L-Histidina </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-isoleucina </td><td> 60 </td></tr><tr><td> L-leucina </td><td> 120 </td></tr><tr><td> L-Lisina </td><td> 60 </td></tr><tr><td> L-Metionina </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-Fenilalanina </td><td> 60 </td></tr><tr><td> L-Serina </td><td> 400 </td></tr><tr><td> L-Treonina </td><td> 200 </td></tr><tr><td> L-Triptofano </td><td> 80 </td></tr><tr><td> L-Tirosina </td><td> 40 </td></tr><tr><td> L-valina </td><td> 150 </td></tr><tr><td> Uracil </td><td> 80 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Médias de glicose sintética completa, SDC (ajustar para pH 6,0 com NaOH). 4 vezes o excesso de histidina, leucina, triptofano e uracila são incluídos para compensar a auxotrophy da cepa DBY746. <table border="1"><tbody><tr><th></th><th> Dia 3 (média ± SEM) </th><th> Até (durante o envelhecimento) </th></tr><tr><td> Pode r </td><td> 1,76 ± 0,12 x10 -6 </td><td> 08/06 x10 -6 </td></tr><tr><td> Trp + reversão </td><td> 6,60 ± 1,70 x10 -8 </td><td> 1,60 x10 -6 </td></tr><tr><td> Lys + mutação quadro-shift </td><td> 3,00 ± 0,78 x10 -8 </td><td> 0,70 x10 -6 </td></tr><tr><td> RCG </td><td> 0,62 ± 0,10 x10 -8 </td><td> 0,30 x10 -6 </td></tr><tr><td> Recombinação homóloga </td><td> 5,55 ± 2,74 x10 -6 </td><td> 27,00 x10 -6 </td></tr><tr><td> Recombinação Homeologous </td><td> 0,12 ± 0,04 x10 -6 </td><td> 0,48 x10 -6 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Freqüências de mutação típica de células de tipo selvagem (DBY746) durante o envelhecimento cronológico. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3030/3030fig1.jpg" /> Figura 1. Resultado da síntese translesion (TLS) 20. Extratos nucleares de 3 dias de idade, fase estacionária do tipo selvagem (DBY746) e células SCH9 Δ mutante foram incubadas com ou sem danos abasic modelos de site contendo DNA por 30 min a 30 ° C. TLS produtos são indicados por sólidos (com modelo sem danos) ou pontilhado (com modelo danificado) linhas. Não houve síntese translesion observado no extrato nuclear de SCH9 mutantes Δ. Primers livre são indicados pela seta aberta.

<ol>
	<li>Longo, V. D., Finch, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+medicine:+from+dwarf+model+systems+to+healthy+centenarians.">Evolutionary medicine: from dwarf model systems to healthy centenarians.</a> Science. 299, 1342-1346 (2003).</li><li>Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+healthy+life+span--from+yeast+to+humans.">Extending healthy life span--from yeast to humans.</a> Science. 328, 321-326 (2010).</li><li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+span+of+individual+yeast+cells.">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183, 1751-1752 (1959).</li><li>Muller, I., Zimmermann, M., Becker, D., Flomer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calendar+life+span+versus+budding+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Calendar life span versus budding life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mech. Ageing Dev. 12, 47-52 (1980).</li><li>Jazwinski, S. M., Egilmez, N. K., Chen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+control+and+cellular+life+span.">Replication control and cellular life span.</a> Exp. Gerontol. 24, 423-436 (1989).</li><li>Pohley, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+formal+mortality+analysis+for+populations+of+unicellular+organisms+(Saccharomyces+cerevisiae.">A formal mortality analysis for populations of unicellular organisms (Saccharomyces cerevisiae.</a> Mech Ageing Dev. 38, 231-243 (1987).</li><li>Longo, V. D., Gralla, E. B., Valentine, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+dismutase+activity+is+essential+for+stationary+phase+survival+in+Saccharomyces+cerevisiae.+Mitochondrial+production+of+toxic+oxygen+species+in+vivo.">Superoxide dismutase activity is essential for stationary phase survival in Saccharomyces cerevisiae. Mitochondrial production of toxic oxygen species in vivo.</a> J Biol Chem. 271, 12275-12280 (1996).</li><li>Longo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Studies of superoxide dismutase, Ras and Bcl-2 [dissertation]. , (1997).</li><li>Fabrizio, P., Pozza, F., Pletcher, S. D., Gendron, C. M., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+longevity+and+stress+resistance+by+Sch9+in+yeast.">Regulation of longevity and stress resistance by Sch9 in yeast.</a> Science. 292, 288-290 (2001).</li><li>Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae.">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Aging Cell. 2, 73-81 (2003).</li><li>Madia, F., Gattazzo, C., Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+model+system+for+age-dependent+DNA+damage+and+cancer.">A simple model system for age-dependent DNA damage and cancer.</a> Mech Ageing Dev. 128, 45-49 (2007).</li><li>Wei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+span+extension+by+calorie+restriction+depends+on+Rim15+and+transcription+factors+downstream+of+Ras/PKA,+Tor,+and+Sch9.">Life span extension by calorie restriction depends on Rim15 and transcription factors downstream of Ras/PKA, Tor, and Sch9.</a> PLoS Genet. 4, e13-e13 (2008).</li><li>Fabrizio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+is+a+mediator+of+an+altruistic+aging+program+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Biol. 166, 1055-1067 (2004).</li><li>Wei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tor1/Sch9-regulated+carbon+source+substitution+is+as+effective+as+calorie+restriction+in+life+span+extension.">Tor1/Sch9-regulated carbon source substitution is as effective as calorie restriction in life span extension.</a> PLoS Genet. 5, e1000467-e1000467 (2009).</li><li>Capizzi, R. L., Jameson, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+table+for+the+estimation+of+the+spontaneous+mutation+rate+of+cells+in+culture.">A table for the estimation of the spontaneous mutation rate of cells in culture.</a> Mutat Res. 17, 147-148 (1973).</li><li>Heidenreich, E., Novotny, R., Kneidinger, B., Holzmann, V., Wintersberger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-homologous+end+joining+as+an+important+mutagenic+process+in+cell+cycle-arrested+cells.">Non-homologous end joining as an important mutagenic process in cell cycle-arrested cells.</a> Embo J. 22, 2274-2283 (2003).</li><li>Heidenreich, E., Wintersberger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-dependent+and+selection-induced+mutations+in+respiration-competent+and+respiration-deficient+strains+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Replication-dependent and selection-induced mutations in respiration-competent and respiration-deficient strains of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Gen Genet. 260, 395-400 (1998).</li><li>Chen, C., Kolodner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gross+chromosomal+rearrangements+in+Saccharomyces+cerevisiae+replication+and+recombination+defective+mutants.">Gross chromosomal rearrangements in Saccharomyces cerevisiae replication and recombination defective mutants.</a> Nat Genet. 23, 81-85 (1999).</li><li>Datta, A., Adjiri, A., New, L., Crouse, G. F., JinksRobertson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+crossovers+between+diverged+sequences+are+regulated+by+mismatch+repair+proteins+in+Saccaromyces+cerevisiae.">Mitotic crossovers between diverged sequences are regulated by mismatch repair proteins in Saccaromyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 16, 1085-1093 (1996).</li><li>Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene+homologue+Sch9+promotes+age-dependent+mutations+by+a+superoxide+and+Rev1/Polzeta-dependent+mechanism.">Oncogene homologue Sch9 promotes age-dependent mutations by a superoxide and Rev1/Polzeta-dependent mechanism.</a> J Cell Biol. 186, 509-523 (2009).</li><li>Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+recombinant+genes+and+preparation+of+cell-free+extracts+in+yeast.">Controlled expression of recombinant genes and preparation of cell-free extracts in yeast.</a> Methods Mol Biol. 313, 317-331 (2006).</li><li>Fabrizio, P., Pletcher, S. D., Minois, N., Vaupel, J. W., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronological+aging-independent+replicative+life+span+regulation+by+Msn2/Msn4+and+Sod2+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Chronological aging-independent replicative life span regulation by Msn2/Msn4 and Sod2 in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Lett. 557, 136-142 (2004).</li><li>Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+quiescent+and+nonquiescent+cells+from+yeast+stationary-phase+cultures.">Isolation of quiescent and nonquiescent cells from yeast stationary-phase cultures.</a> J Cell Biol. 174, 89-100 (2006).</li><li>Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longevity+mutation+in+SCH9+prevents+recombination+errors+and+premature+genomic+instability+in+a+Werner/Bloom+model+system.">Longevity mutation in SCH9 prevents recombination errors and premature genomic instability in a Werner/Bloom model system.</a> J Cell Biol. 180, 67-81 (2008).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Líquido culturas envelhecimento exibem algum regrowth / fenótipo ofegante 13, o que complica a análise CLS. Rebrota normalmente ocorre quando mais de 90-99% da população perdeu viabilidade. Este fenótipo é freqüentemente associada com aumento do estresse oxidativo e / ou protecção diminuição na célula. Por exemplo, a freqüência desse fenótipo mais do que duplica em células falta superóxido dismutase citosólica e reduz em longa vida mutantes (por exemplo, SCH9 Δ ou Δ RAS2) ou mutantes superóxido superexpressão superóxido 22. Na prática, nós definimos rebrota como um aumento na viabilidade ou estabilização da viabilidade de três amostragens consecutivas na fase de alta taxa de mortalidade durante o envelhecimento cronológico. Dependente da idade as freqüências de mutações no DNA diferentes variam muito, dependendo da tensão de fundo, a manipulação genética, condições de cultura, bem como regrowth / ofegante e sobrevivência extremamente baixa. Pré-experimentos devem ser realizados em momentos como a sobrevida média e máxima com densidade chapeamento de vários ensaios de mutação para a determinação da faixa de freqüência de mutação antes performingthe completa análise de tempo de escala de vida. A cepa selvagem deve sempre ser incluídos em um tempo de vida ou de estudo de frequência de mutação em paralelo a qualquer tratamento ou mutantes genéticos, de tal forma que experimento inter-variações podem ser contabilizados. Múltiplas réplicas biológicas devem ser incluídos no estudo, e, tanto líquido e in situ viabilidade / mutação ensaios devem ser realizados para confirmar os resultados. Em vez de focar em um tipo específico de mutação do DNA, o perfil de idade-dependente instabilidade genômica usando múltiplos ensaios em combinação, podem lançar luz sobre danos no DNA específico e sistema de reparo do DNA dano (s) que contribuem para a idade-dependente instabilidade genômica. Por exemplo, um aumento significativo em bruto rearranjos cromossômicos (RCG), em comparação aos de outras mutações no DNA, é observada na levedura do tipo selvagem, sugerindo uma pausa vertente elevationof dupla e / ou um prejuízo no não-homólogos final juntar (NHEJ) durante a levedura envelhecimento cronológico (Tabela 2). O espectro de mutação CAN1 (seqüenciamento do gene CAN1) obtidos na levedura de envelhecimento do tipo selvagem sugeriu um aumento no dano oxidativo durante o envelhecimento cronológico e propenso a erros de reparo do DNA e que, em vida longa SCH9 mutantes Δ, dano oxidativo e de DNA muito reduzido propenso a erros síntese translesion foram observados 20. Métodos descritos aqui podem ser ainda mais gastos para estudar a idade-dependente instabilidade genômica. Por exemplo, as células quiescentes e não em repouso pode ser isolado de levedura fase estacionária de culturas usando o método de gradiente de densidade descrito por Allen et al. 23. Combinado com a ensaios de mutação descrita aqui, temos verificado que uma parcela grande de idade-dependente mutações surge a partir de células quiescentes, em vez da divisão, as células danificadas ou apoptose 20,24.

studying age-dependent genomic instability using the s. cerevisiae chronological lifespan model

Estudos utilizando o modelo Saccharomyces cerevisiae envelhecimento descobriram caminhos tempo de vida de regulamentação que estão parcialmente conservados em eucariotos superiores 1-2. A simplicidade eo poder do modelo de fermento de envelhecimento também pode ser explorado para o estudo de danos ao DNA e manutenção do genoma, bem como suas contribuições para doenças durante o envelhecimento. Aqui, descrevemos um sistema para estudar as mutações idade-dependente de DNA, incluindo substituição de base, mudança de quadro de mutações, rearranjos cromossômicos bruta, e homóloga / recombinação homeologous, bem como atividade de reparo de DNA nuclear, combinando o fermento esperança de vida cronológica com DNA simples danos e ensaios de mutação. Os métodos descritos aqui devem facilitar a identificação de genes / vias que regulam a instabilidade genômica e os mecanismos que estão por trás mutações idade-dependente e câncer de DNA em mamíferos.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model at JoVE.com

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Aqui nós descrevemos um conjunto de ensaios de mutação de DNA que podem ser combinados com o fermento modelo de extensão cronológica vida ao estudo dos genes / vias que regulam ou contribuir para a instabilidade do DNA genômico durante o envelhecimento.

Estudando Idade-dependente Instabilidade Genômica usando o S. cerevisiae Modelo Lifespan cronológica

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

studying-age-dependent-genomic-instability-using-s-cerevisiae

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

15.5K visualizações.  University of Southern California, Los Angeles. Aqui nós descrevemos um conjunto de ensaios de mutação de DNA que podem ser combinados com o fermento modelo de extensão cronológica vida ao estudo dos genes / vias que regulam ou contribuir para a instabilidade do DNA genômico durante o envelhecimento.

Vídeo: Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

Ensaio para a Adesão e Invasão Agar em S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Biologia

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Um método de alto rendimento para estudar a morfologia global organela em S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identificação de complexos de proteínas com proteômica quantitativa em S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Genomic MRI - a Public Resource for Studying Sequence Patterns within Genomic DNA

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in their nucleotide composition and consist of a complex mosaic of sequence patterns. These patterns include so-called Mid-Range Inhomogeneity (MRI) regions -- sequences 30-10000 nucleotides in length that are enriched by a particular base or combination of bases (e.g. (G+T)-rich, purine-rich, etc.). MRI regions are associated with unusual (non-B-form) DNA structures that are often involved in regulation of gene expression, recombination, and other genetic processes (Fedorova &amp; Fedorov 2010). The existence of a strong fixation bias within MRI regions against mutations that tend to reduce their sequence inhomogeneity additionally supports the functionality and importance of these genomic sequences (Prakash et al. 2009).
Here we demonstrate a freely available Internet resource -- the Genomic MRI program package -- designed for computational analysis of genomic sequences in order to find and characterize various MRI patterns within them (Bechtel et al. 2008). This package also allows generation of randomized sequences with various properties and level of correspondence to the natural input DNA sequences. The main goal of this resource is to facilitate examination of vast regions of non-coding DNA that are still scarcely investigated and await thorough exploration and recognition.

We present a public computational web site for the analysis of genomic sequences. It detects DNA sequence patterns with various non-random nucleotide compositions. This resource also generates randomized sequences with diverse levels of complexity.

Genômica MRI - um recurso público para estudar os padrões de seqüência dentro de DNA genômico

Non-coding genomic regions in complex eukaryotes, including intergenic areas, introns, and untranslated segments of exons, are profoundly non-random in ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

Purificação Citometria de Fluxo com base em<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigotos

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

Avaliação da Função Renal Zebrafish Usando um teste de eliminação fluorescente

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

Usando dispositivos microfluídicos medir Longevidade e Celular fenótipos em células individuais levedura de brotamento

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived inheritance encoded in protein conformation (rather than sequence) has long been viewed as paradigm-shifting but rare. The best characterized examples of such epigenetic elements are prions, which possess a self-assembling behavior that can drive the heritable manifestation of new phenotypes. Many archetypal prions display a striking N/Q-rich sequence bias and assemble into an amyloid fold. These unusual features have informed most screening efforts to identify new prion proteins. However, at least three known prions (including the founding prion, PrPSc) do not harbor these biochemical characteristics. We therefore developed an alternative method to probe the scope of protein-based inheritance based on a property of mass action: the transient overexpression of prion proteins increases the frequency at which they acquire a self-templating conformation. This paper describes a method for analyzing the capacity of the yeast ORFeome to elicit protein-based inheritance. Using this strategy, we previously found that &gt;1% of yeast proteins could fuel the emergence of biological traits that were long-lived, stable, and arose more frequently than genetic mutation. This approach can be employed in high throughput across entire ORFeomes or as a targeted screening paradigm for specific genetic networks or environmental stimuli. Just as forward genetic screens define numerous developmental and signaling pathways, these techniques provide a methodology to investigate the influence of protein-based inheritance in biological processes.

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

This protocol describes a high-throughput methodology to functionally screen for protein-based inheritance in S. cerevisiae.

Elevado-throughput Screening para herança à base de proteínas no S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

A Mouse Model of Lumbar Spine Instability

Intervertebral disc degeneration (IDD) is a common pathological change leading to low back pain. Appropriate animal models are desired for understanding the pathological processes and evaluating new drugs. Here, we introduced a surgically induced lumbar spine instability (LSI) mouse model that develops IDD starting from 1 week post operation. In detail, the mouse under anesthesia was operated by low back skin incision, L3&#8211;L5 spinous processes exposure, detachment of paraspinous muscles, resection of processes and ligaments, and skin closure. L4&#8211;L5 IVDs were chosen for the observation. The LSI model develops lumbar IDD by porosity and hypertrophy in endplates at an early stage, decrease in intervertebral disc volume, shrinkage in nucleus pulposus at an intermediate stage, and bone loss in lumbar vertebrae (L5) at a later stage. The LSI mouse model has the advantages of strong operability, no requirement of special equipment, reproducibility, inexpensive, and relatively short period of IDD development. However, LSI operation is still a trauma that causes inflammation within the first week post operation. Thus, this animal model is suitable for study of lumbar IDD.

We developed a lumbar intervertebral disc degeneration mouse model by resection of L3&#8211;L5 spinous processes along with supra- and inter-spinous ligaments and detachment of paraspinous muscles.

Um modelo de mouse de instabilidade lombar

Intervertebral disc degeneration (IDD) is a common pathological change leading to low back pain. Appropriate animal models are desired for understanding ...