A assistência técnica fornecida por Jaipreet Bharj. Este trabalho foi apoiado por subsídios da UE-FP7 (SYSCILIA -241.955) e The Dutch Kidney Foundation (CP11.18).

Declaração de Ética: Animal de manutenção, criação e procedimentos são definidos e controlados pelos Animais (Scientific Procedures) Act de 1986. Todos os experimentos com animais foi efectuada ao abrigo de licenças concedidas pelo Ministro da Administração Interna (PIL No. 70/7892), em conformidade com Biológica Serviços de Gestão do Grupo e da Comissão de Ética do Serviço Biológica, SGUL, Londres, Reino Unido. Foram feitos todos os esforços para reduzir o número de animais utilizados para refinar e ambos os procedimentos e pecuária, a fim de minimizar o sofrimento e melhorar o bem-estar. 1. Preparação de Instrumentos, anestésico, e corante fluorescente <ol><li> Usando um extractor de micropipeta e capilares padrão de borosilicato de parede (sem filamentos) puxam agulhas de comprimento adequado para microinjecção (Figura 1A). </li><li> Fazer um molde de agarose para orientação de embriões para injecção fácil no pericárdio (Figura 1B). Glue aproximadamente dez vidro microscópio slides juntos para formar uma &quot;escada&quot; de lâminas de compensado. Para melhores resultados, usar uma gota de cola de resina epoxi rápida conjunto no centro de cada lâmina. </li><li> Cortar uma seção de aproximadamente 78 mm de comprimento no meio duas pipetas de 10 ml de plástico com um bico de Bunsen bisturi aquecido, remova pipeta termina conforme o caso. Encaixe e secções de cola (resina epóxi) de pipeta para as lâminas de vidro empilhadas para proporcionar estabilidade para permitir que o molde de mergulhar em uma placa de Petri de 90 mm. Faça todos os esforços para garantir os cantos de slides alinhar perpendicular ao chão placa de Petri. Dê tempo cola para definir. </li><li> Lançar o molde em uma solução de agarose 2% feita em peixes de água (obtido a partir do aquário). Pour agarose em uma placa de Petri de 90 milímetros e colocar o molde por cima do prato de Petri abertas, permitindo que a lâmina de orlas empilhadas para submergir num ângulo abaixo da superfície de agarose. Deixar para definir sobre a bancada do laboratório durante 30 minutos. </li><li> Retirar o elenco slide e cobrir a agarose impressa-slide com água peixe frescocontendo tricaina anestésico (veja o passo 1.9) a uma razão de 1:25. </li><li> Faça soluções de rhodamine dextrano corante (RD). Ressuspender rodamina B 10.000 MW marcado de dextrano em água ultrapura esterilizada para fazer uma concentração de estoque de 50 mg / ml. Para micro-injecção, dilui-se ainda mais o material a uma concentração final de 5 mg / ml em água ultrapura esterilizada. NOTA: Pigmentado células começam a se diferenciar no peixe-zebra a partir de 24 horas pós fecundação (hpf); estes podem obscurecer marcadores fluorescentes na aquisição da imagem. </li><li> Inibir a formação de melanócitos usando N -Phenylthiourea (PTU), que bloqueia a melanogênese através da inibição da tirosinase. Adicione uma solução de estoque de 0,003% do PTU dissolvendo PTU pó em água do aquário, solução de calor a 60 ° C para solubilizar por completo. </li><li> Incubar embriões de peixes-zebra em solução de azul de metileno, um fungicida leve, para evitar blooms fúngicas e aumentar a sobrevida. Adicionar 2 ml de solução de estoque de azul de metileno, contendo 0,1% de azul de metileno em uágua ltrapure, para 1 L de água do aquário e utilização como meio de embrião padrão. </li><li> Certifique-se uma concentração de estoque 15 mM de tricaina sal metano / acetato de 3-aminobenzoate conforme as instruções em &#39;O Livro Zebrafish »23. Anestesiar os embriões e, consequentemente, eles imobilizadas para executar o procedimento de microinjecção. </li><li> Depois de anestesiar os embriões, orientá-los, para geração de imagens usando as propriedades não-tóxicos e viscosos de metilcelulose. Para fazer uma preparação de 3% de metilcelulose 200 ml, chill 130 ml de água à temperatura de -20 ° C durante 30 minutos e colocar em gelo. Aquecer 70 ml de água a 80 ° C numa proveta de vidro, adiciona-se 6 g de metilcelulose, e agita-se usando uma vareta de vidro, até que todas as partículas são molhadas e uniformemente dispersas. Adicionar a água com gelo, mistura, e permitir que a preparação para arrefecer a 4 ° C durante 30 min antes de alíquotas em tubos de 50 ml. NOTA: A redução da temperatura permite a metilcelulose para se tornar solúvel. A solução torna-se mais espessacomo os hidratos de pó. Metilcelulose a 3% pode ser armazenado sem o crescimento bacteriano por curtos períodos de uma semana a 4 ° C ou mais, à temperatura de -20 ° C. Certifique-se a metilcelulose atingiu RT antes do uso. </li><li> Para realizar injecções de corante fluorescente para o peixe-zebra usar microinjecção um set-up padrão (Figura 1C). Este é constituído por um compressor de ar ligado a um sistema regulador de pressão que alimenta um suporte pipeta linear para utilização com 1,0 de diâmetro exterior capilares. O titular da pipeta devem ser alojados dentro de um compacto micromanipulator controle de 3 eixos MM33 preso a uma placa de base de aço por um suporte magnético. Os embriões podem ser visualizados, manipulados e injectados utilizando um microscópio de dissecação estéreo. </li></ol> 2. Zebrafish Pecuária e Tratamento Pré-injeção <ol><li> Manter peixe-zebra, como previamente descrito 23. Use um aquário set-up que fornece água de recirculação fornecido a uma temperatura constante de 28,5 ° CCondicionadas ao pH 6,8-7,2 e condutividade de 450-550 uS com bicarbonato de sódio e Instant Oceano Mar Salgado, respectivamente. Use wildtype ou linhas de peixes-zebra transgénicos, conforme apropriado para o experimento, mantendo uma densidade de 15 machos e 15 fêmeas por 8 L tanque. Defina o photocycle facilidade de peixe para 14 horas de luz do dia entre 09:00-23:00. </li><li> Desova do peixe-zebra começa no início do photocycle, quando as luzes se acendem na parte da manhã. Para garantir o máximo de ovos podem ser recolhidos, sem perturbar o peixe, submergir tanques de criação (que contêm inserções de malha, disponíveis a partir de especialistas de peixe-zebra) em tanques de estoque de tipo selvagem a noite antes da coleta. </li><li> No dia da coleta, permitir que 30 - 40 min para os peixes para a desova, após o que coletar e enxaguar ovos usando um coador de chá e água do aquário fresco. Depositar os ovos limpos em um meio contendo embrião 90 milímetros placa de Petri e incubar a 28,5 ° C. </li><li> Trate os embriões com PTU para inibir melanogênese. Às 8 hpf, transferir embriões viáveis ​​em líquido mínimo para placas de Petri fresco com 1: 100 PTU e médio embrião e mais incubar a 28,5 ° C até 72 hpf. NOTA: PTU pode causar defeitos de desenvolvimento, se usado em fases anteriores por isso deve ser limitado ao postar 8 etapas HPF, mas pode ser tratada tão tarde quanto 24 hpf. Além Late of PTU não bloqueia totalmente a pigmentação do olho, mas é geralmente bem sucedido e inibir a formação de tronco dos melanócitos. </li></ol> 3. Microinjection NOTA: O pericárdio envolve o coração, mas é separado para a proteção e facilidade de movimento cardíaco por fluido no interior da cavidade do pericárdio. O objectivo deste procedimento é injectar RD na cavidade pericárdica, isto permite a absorção rápida do corante para o sistema vascular. <ol><li> Agulhas carga com 6 ul - diluída RD, usando dicas Microloader e seguro no porta-agulha da micromanipulator. Quebre a ponta da agulha usando tipp multafórceps ED (Figura 1A). Mova a solução RD à ponta da agulha, maximizando duração do pulso para a definição dos minutos, voltar para milisegundos, uma vez concluída. </li><li> Usar um micrómetro de plataforma, o regulador de pressão, e refinamentos de comprimento de ponta de agulha (utilizando pinças) para ajustar o tamanho da gotícula expelido a 100 um de diâmetro, isto equivale a um volume de 0,5 nl (Figura 2A). NOTA: Ao quebrar a agulha, tenha cuidado para não quebrar muito off caso contrário ele irá fazer a calibração do volume de injeção difícil. Se necessário, quebrar a ponta da agulha ainda mais para aumentar o tamanho de gota no entanto, manter uma espessura que permite a entrada da agulha no pericárdio sem uma curvatura excessiva ou danos no tecido. </li><li> Antes da injecção, anestesiar os embriões em meio contendo tricaina embrião. Configure 2 x 35 milímetros placas de Petri contendo 5 ml de meio de embrião, uma etiqueta do &#39;tricaina&#39; eo outro &#39;Recovery&#39;. </li><li> Adicionar 200ul de estoque tricaina ao prato devidamente rotulados. Uma vez pronto para injetar, selecionar um embrião humano no 72 hpf e transferir em líquido mínimo para o prato tricaina. Monitorizar a actividade do embrião, o embrião é testar anestesiados e imobilizados por agitação suave usando uma ponta microloader truncado. </li><li> Transferir o embrião anestesiado para o molde de injecção e orientação do embrião dentro de uma calha de agarose de modo que o lado esquerdo está virada para cima, o posicionamento do coração para a esquerda do campo de visão. </li><li> Para injectar a RD para o coração, o pericárdio perfurar com a agulha e injectam-se 1 nl de RD na cavidade pericárdica do embrião anestesiados (Figura 2B, painel da direita). Retire a agulha após a injeção. Transferir o embrião injectado no líquido mínimo para o &quot;prato de recuperação &#39;e monitorar durante 1 min. Transferência do embrião individual a uma placa de 24 poços contendo 1 ml de meio de embrião fresco (contendo o PTU) e etiqueta apropriadamente. NOTA: O pericárdio é difícil, no entanto, há um ponto fraco notável no cruzamento onde o pericárdio atende aos arcos faríngeos ventro-caudal e dorso-rostral saco vitelino (Figura 2B ponta de seta). A agulha deve ser direcionado para este groove. Quando a agulha está no lugar, uma torneira firme de um dedo na parte superior do micromanipulador vai facilitar a entrada na cavidade pericárdica. </li><li> Repita os passos de 3,2-3,6 por pelo menos 10 embriões por grupo experimental, coloque cada peixe em um bem separado e exclusivamente labelto autorização individuais experimentais follow-ups. Incubar a 28,5 ° C durante 3 h. </li></ol> 4. Imaging Acquisition <ol><li> Às 3 horas pós injeção (HPI) anestesiar embriões como descrito anteriormente e transfira para um prato de 35 milímetros Petri contendo 3% de metilcelulose. Com cuidado, empurre embriões na metilcelulose e orientar para que o lateral pode ser trabalhada. </li><li> Adquirir uma imagem do embrião sob UV, utilizando um filtro para o visualizaçãof a luz emitida a 570 nm (Figura 2C). Após a aquisição da imagem, permitir que o embrião para se recuperar antes de substituir no poço designado. Aquisição de imagens para todos os embriões injetados e mais incubar a 28,5 ° C. NOTA: Neste protocolo foi utilizado um microscópio estereoscópico fluorescente com um conjunto de filtros TXR, uma câmera DFC300FX e respectivo software aplicativo. Anote as configurações de aquisição exatas para aquisição de imagem subsequente. </li><li> Aos 24 hpi, adquirir uma segunda rodada de imagens como descrito acima. Uma vez que todas as imagens foram adquiridas, tanto a 3 hpi e 24 hpi, humanamente descarte dos embriões ou utilização para outros meios experimentais, por exemplo, imuno-histoquímica. </li></ol> 5. Processamento de Imagem <ol><li> Quantificar intensidade de fluorescência de cada embrião injetado, em 3 hpi e 24 hpi, através da análise de imagens usando o software ImageJ do NIH. Para medir a intensidade de fluorescência, abra uma imagem em ImageJ e especificar uma região de interesse (ROI) a 100 px 2 (Edit → seleção → especificar). </li><li> Posicione o coração no centro do roi (Figura 2C), definir as medidas a incluir escala de cinza médio e área (Analisar → medições de conjunto), efectuar a medição (Analisar → medida). Completar para cada conjunto de imagens, em 3 hpi e 24 hpi, por embrião e transferir valores médios de escala de cinza para uma folha de cálculo para posterior processamento. NOTA: Nós selecionamos um tamanho roi fixa de 100 px 2 como esta engloba corações individuais entre embriões. O coração foi escolhido para realizar medições, devido ao seu grande tamanho que permite uma localização conveniente para medir o teor de fluorescência do sangue antes de entrar no rim. </li><li> Realizar a análise estatística usando o software estatístico adequado. Compare grupos para significância estatística usando o teste t de um estudante. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

Zebrafish oferecer uma ferramenta valiosa para modelar doença genética humana, a sua utilização como um instrumento científico para a pesquisa in vivo têm permitido estudos detalhados sobre a repartição genética de muitos sistemas biológicos, incluindo o rim. Muito se agora sabe sobre como o rim zebrafish desenvolve e funções. As semelhanças com nefrogênese humana e homologia com a doença que causa genes 21 ilustrou como peixe-zebra tornaram-se fundamentais na compreensão de ...

O rim humano desempenha um papel crucial na filtragem de resíduos metabólicos do sangue e recuperando os solutos necessários para manter a homeostase celular. Há um número de doenças genéticas humanas que causam disfunção renal. A doença renal hereditária mais comum é a doença renal policística autossómica dominante (ADPKD) caracterizada pelo desenvolvimento de sacos cheios de fluido dentro dos túbulos nefríticos; os danos causados ​​por cistogénese é prejudicial para a função renal a 10. ADPKD tem uma ocorrência de 1: 800-1: 1000 e responsável por 8 - 10% de doentes com insuficiência renal em fase terminal (ESRF) 11. Vários genes têm sido implicados para causar ADPKD incluindo policistina-1 (PKD1) e -2 (PKD2), representando cerca de 85% e 15% dos casos, respectivamente, 12,13. Além disso, os produtos do gene PKD1 para localizar e -2 para o cílio e são fundamentais para ciliogênese 14,15. Existe agora uma família reconhecida de doenças genéticas humanas, conhecidas comoos ciliopathies, que afetam a função dos cílios e resultam em CKD 16. O crescente número de doenças genéticas humanas que afetam o desenvolvimento e função ciliar está despertando o interesse global nesta organela vestigial uma vez considerado. O cílio, uma saliência celular cabelo semelhante, é enriquecido com os receptores e canais necessários para a transdução de eventos de sinalização celular chave de iões. O cílio consiste de um axoneme à base de microtúbulos, normalmente estruturada em nove duplas de microtúbulos dispostos radialmente com ou sem um par central de microtúbulos singletos. A estrutura axonemais define o tipo e modo de acção ciliar. O arranjo de microtúbulos 9 + 2 confere a motilidade do cílio, onde é utilizada no movimento de fluidos através de superfícies epiteliais. A configuração 9 + 0 é não móveis, mas acredita-se principalmente a função em eventos de sinalização celular 17. Além de CKD, as conseqüências da disfunção ciliar são um conjunto de característicasciliopathy características que incluem, obesidade, degeneração da retina, polidactilia, e disfunção cognitiva 16. No entanto, a DRC está entre as mais prejudiciais para a qualidade de vida do paciente e, portanto, uma importante força motriz por trás do desenvolvimento adequado em modelos in vivo para ciliar relacionado CKD. O peixe-zebra é um excelente modelo para compreender a etiologia da doença genética humana. O seu desenvolvimento rápido, a produção de um grande número de ovos, tecido transparente, e crescimento ex utero permite que os processos de desenvolvimento de peixe-zebra para ser visualizado e eventos biológicos manipulados com facilidade considerável. Genes podem ser geneticamente alterada usando o recente sucesso de ferramentas de edição do genoma (CRISPR 18 e TALENS 19), derrubou usando antisense tecnologia morfolino 20, ou farmacologicamente regulado pela adição de compostos ao seu ambiente aquático. De fato, peixe-zebra oferecer uma plataforma para realizar experiments que não são permissivas em outros modelos animais. Embora peixe-zebra são animais vertebrados relativamente simples (em comparação com os seres humanos) que partilham muitos órgãos funcionalmente conservadas, genes e processos de sinalização em comum com os seres humanos. Por exemplo, o rim do peixe-zebra é notavelmente semelhante em estrutura e função de comparação para os seres humanos 21,22. No entanto, ao contrário do rim de mamíferos que se desenvolve através de uma sucessão de fases, cada uma marcada por um rim mais desenvolvida (pronephros, mesonephros e metanephros), o peixe-zebra embrionário desenvolve apenas um pronephros, a forma mais imatura de um rim. Enquanto milhões de nefrónios podem ser encontrados formando os blocos de construção de rim de mamífero, o embrião do peixe-zebra possuem apenas dois. Os glomérulos, que permitem o filtrado do sangue inicial, são fundidos na linha média ventral apenas para a aorta. Filtros de sangue através dos glomérulos nos túbulos pronephric que correm caudalmente ao longo do eixo, fundindo antes de sair através da cloaca. O pronephric tutúbulos são fortemente ciliada com cílios motilidade que são permissivas para o fluxo de filtrado para o caudal de saída de 3,4. Esta estrutura pronephric simples mantém a homeostase do peixe-zebra através de várias semanas de crescimento larval onde eventualmente evoluir para uma estrutura mais complexa mesonephros 21. No entanto, o peixe-zebra nunca desenvolve um metanephros 21. Apesar das idiossincrasias de peixe-zebra, o néfron peixe-zebra é segmentado, com perfis de expressão gênica iguais aos observados em mamíferos e, portanto, oferece uma inigualável no modelo vivo para nefrogênese 3,22. Rotineiramente, os pacientes são testados quanto à função renal através de uma série de análises de sangue e urina. Tipicamente, o sangue é analisado por sais dissolvidos, ureia e creatinina. Altos níveis de ureia, creatinina e concentrações anormais de sal são indicativas de problemas com a função renal. O exame de urina usando uma vareta colorimétrico detecta níveis anormais de proteínas, Blood, pus, bactérias e açúcar presente em amostras de urina. Tais ensaios requerem normalmente cerca de 30 ml de urina ou de 5 - 10 ml de sangue. Tem sido difícil de traduzir estes tipos de ensaios para pequeno em organismos modelo in vivo, tais como o peixe-zebra, principalmente devido à natureza impossível de recolha de sangue ou de urina suficiente para realizar o ensaio. Aqui, vamos abordar a falta de testes de função do rim zebrafish adequadas e descrever uma técnica inovadora para o seu estudo. Ao injectar um corante fluorescente para a corrente sanguínea que são capazes de monitorizar e quantificar individualmente ao longo do tempo a filtração e a excreção de actividade fluorescente a partir do sangue pelo rim. Este método pode ser usado para estudar os danos causados ​​por doença renal, que fornecem um exemplo de.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="708">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:136px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller</td>
			<td style="width:136px;">Intracel</td>
			<td style="width:136px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">borosilicate standard wall capillaries</td>
			<td style="width:136px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:136px;">30-0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Glass microscope slides</td>
			<td style="width:136px;">VWR International</td>
			<td>631-0109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Epoxy Resin Glue</td>
			<td style="width:136px;">Evo-Stik</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran</td>
			<td>Life technologies&#160;</td>
			<td>D-1824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">air compressor&#160;</td>
			<td>Jun-Air</td>
			<td>OF302-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Picospritzer III&#160;</td>
			<td>Parker Instruments&#160;</td>
			<td>051-0500-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">compact 3-axis control micromanipulator&#160;</td>
			<td>Marzhauser</td>
			<td>MM33&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">Dissecting stereo microscope</td>
			<td style="width:136px;">Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:269px;">microloader tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right">5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 forceps&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stage micrometer&#160;</td>
			<td>Pyser- SGI</td>
			<td>02A00404</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay

O embrião de peixe-zebra oferece um modelo tratável para estudar a organogênese e modelo de doença genética humana. Apesar da sua relativa simplicidade, o rim do peixe-zebra e desenvolve funções em quase da mesma maneira como os seres humanos. Uma diferença importante na construção do rim humano é a presença de milhões de nefrónios em comparação com o peixe-zebra que possui apenas dois. No entanto, simplificando um sistema tão complexo em unidades funcionais básicas ajudou nossa compreensão de como o rim desenvolve e opera. No peixe-zebra, a linha média localizada glomérulo é responsável pela filtragem do sangue inicial em duas túbulos pronephric que divergem para funcionar bilateralmente a partir do eixo embrionário antes da fusão para o outro na cloaca. Os túbulos pronephric são fortemente povoada por cílios motilidade que facilitam a circulação de filtrado ao longo do túbulo segmentada, permitindo a troca de vários solutos antes de finalmente sair através da cloaca 2-4. Muitos genes responsáveis ​​pela DRC, including aqueles relacionados à ciliogênese, têm sido estudadas em peixes-zebra 5. No entanto, um grande atrativo para trás tem sido a dificuldade em avaliar a função renal zebrafish após manipulação genética. Ensaios tradicionais para medir a disfunção renal em humanos provaram não translacional de peixe-zebra, principalmente devido ao seu ambiente aquático e pequeno porte. Por exemplo, não é fisicamente possível para extrair sangue de peixes embrionários encenado para análise do teor de ureia e creatinina, como eles são muito pequenos. Além disso, o peixe-zebra não produzem urina suficiente para testar em um simples proteinúria &#39;vareta&#39;, que muitas vezes é realizado durante os exames iniciais dos pacientes. Descreve-se um ensaio fluorescente que utiliza a transparência óptica do peixe-zebra para monitorar quantitativamente a depuração de um corante fluorescente, ao longo do tempo, a partir da vasculatura e para fora através do rim, para dar uma leitura de função renal 1,6-9.

A síndrome de Bardet-Biedl (BBS) é um ciliopathy heterogêneo rara que afeta cerca de 1: 160 mil pessoas em todo o mundo 16. Os pacientes apresentam uma série de problemas associados, incluindo rins policísticos, posteriormente pacientes frequentemente necessitam de diálise ou transplante renal 24. ESRF é a causa mais comum de morte em BBS, com cerca de 30% dos pacientes em desenvolvimento CKD 16. Actualmente, 20 genes não relacionados têm sido implicados em BBS sem associação ...

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Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

O peixe-zebra é uma ferramenta popular para modelar doença renal crônica (DRC). No entanto, seu pequeno tamanho torna impossível avaliar a função renal através de métodos tradicionais. Nós descrevemos um teste de eliminação fluorescente rim corante 1, que permite a análise quantitativa da função renal zebrafish em CKD.

Avaliação da Função Renal Zebrafish Usando um teste de eliminação fluorescente

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

evaluation-zebrafish-kidney-function-using-fluorescent-clearance

Research

JoVE Journal

Biology

13.1K visualizações.  University College London.  O peixe-zebra é uma ferramenta popular para modelar doença renal crônica (DRC). No entanto, seu pequeno tamanho torna impossível avaliar a função renal através de métodos tradicionais. Nós descrevemos um teste de eliminação fluorescente rim corante 1, que permite a análise quantitativa da função renal zebrafish em CKD. 

Vídeo: Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Transplante de Medula Renal inteiro em Zebrafish Adulto

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Biologia

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjeção de embriões Zebrafish para analisar a função do gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish Whole Mount Alta Resolução Duplo Fluorescente In Situ Hibridização

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Usando a resposta optocinético para estudar a função visual de zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microinjeções intravenosa de larvas do peixe para o Estudo de lesão renal aguda

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Transplante de células diretamente no Rim de Adulto Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissecção do rim Zebrafish Adulto

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in the brain, heart, skeletal muscle and endocrine tissue1,2. GIRK channels become activated following the binding of ligands (neurotransmitters, hormones, drugs, etc.) to their plasma membrane-bound, G protein-coupled receptors (GPCRs). This binding causes the stimulation of G proteins (Gi and Go) which subsequently bind to and activate the GIRK channel. Once opened the GIRK channel allows the movement of K+ out of the cell causing the resting membrane potential to become more negative. As a consequence, GIRK channel activation in neurons decreases spontaneous action potential formation and inhibits the release of excitatory neurotransmitters. In the heart, activation of the GIRK channel inhibits pacemaker activity thereby slowing the heart rate.
GIRK channels represent novel targets for the development of new therapeutic agents for the treatment neuropathic pain, drug addiction, cardiac arrhythmias and other disorders3. However, the pharmacology of these channels remains largely unexplored. Although a number of drugs including anti-arrhythmic agents, antipsychotic drugs and antidepressants block the GIRK channel, this inhibition is not selective and occurs at relatively high drug concentrations3.
Here, we describe a real-time screening assay for identifying new modulators of GIRK channels. In this assay, neuronal AtT20 cells, expressing GIRK channels, are loaded with membrane potential-sensitive fluorescent dyes such as bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol [DiBAC4(3)] or HLB 021-152 (Figure 1). The dye molecules become strongly fluorescent following uptake into the cells (Figure 1). Treatment of the cells with GPCR ligands stimulates the GIRK channels to open. The resulting K+ efflux out of the cell causes the membrane potential to become more negative and the fluorescent signal to decrease (Figure 1). Thus, drugs that modulate K+ efflux through the GIRK channel can be assayed using a fluorescent plate reader. Unlike other ion channel screening assays, such atomic absorption spectrometry4 or radiotracer analysis5, the GIRK channel fluorescent assay provides a fast, real-time and inexpensive screening procedure.

A real-time screening procedure for identifying drugs that interact with G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels is described. The assay utilizes membrane potential-sensitive fluorescent dyes to measure GIRK channel activity. This technique is adaptable for use on a number of cell lines.

Um ensaio de rastreio fluorescente para identificação Moduladores de Canais GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Análise de Composição Nephron e função no rim adulto Zebrafish

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Manutenção de um<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Gaiola População

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...