NIH concede R01 HL085369, HL067322, HL082729, EB008999

1. Preparação <ol><li> Prepare recém solução Tyrodes feito &#39;(em mM, NaCl 128,2, 1,3 CaCl 2, 4,7 KCl, 1,19 NaH 2 PO 4, 1,05 MgCl 2, 20,0 NaHCO 3, e 11,1 glicose). Para agilizar a preparação diária de soluções, preparar duas soluções estoque com antecedência e estocá-los em 4 ° C frigorífico: (1) Stock I (em g/2L, 374,6 NaCl, CaCl 2 9,56, 17,52 KCl, 8,21 NaH 2 PO 4 , 10,67 MgCl 2) e (2) Stock II (em g/2L, 84,01 NaHCO 3). Para fazer 2L de solução suficiente para tomar um experimento Tyrodes &#39;1840mL de água deionizada e misture nele 80mL de Ações I, II 80mL de stock, e 4g de glicose. </li><li> Preparar soluções estoque de tinturas e desacopladores: (1) excitação-contração desacoplador solução estoque blebbistatin (Tocris solução, Bioscience 2mg/ml em DMSO), (2) sensíveis à voltagem corante solução estoque di-4-ANEPPS (Invitrogen, 1mg/mL solução em DMSO), (3) sensíveis à voltagem corante RH solução estoque 237 (Invitrogen, solução 1.25mg/ml em DMSO); (4) Indicador de cálcio Rhod 02:00-solução-mãe (Invitrogen, 1mg/ml solução em DMSO). Uma experiência única de coelho necessita de aproximadamente 30 mL da solução de di-4-ANEPPS, 30 mL da solução-mãe RH237, e 200 mL da Rhod-2:00 solução estoque. Para evitar congelamento e descongelamento repetidos, nós armazenamos 100 mL de alíquotas di-4-ANEPPS a -20 ° C. Outros corantes também são armazenadas a -20 ° C. Armazenar os blebbistatin dissolvido em quatro geladeira C °. </li><li> Antes da colheita do coração, a solução Tyrodes transferência &quot;dentro da garrafa 2L e colocá-lo em banho-maria (Fisher Scientific), que mantém a temperatura da solução a 37 ° C. A solução é oxigenada com 95% O 2 - 5% CO 2. O pH é mantida em 7,35 ± 0,05, ajustando o nível de oxigenação. A solução é distribuída no sistema de perfusão Langendorff e é filtrada por um filtro de nylon líquido (tamanho dos poros: 11μm, Millipore) colocado na linha de perfusão antes da cânula. </li><li> Prepare o equipamento de vigilância, antes da colheita do coração. Um transdutor de pressão (WPI) é usado para monitorar a pressão aórtica durante o experimento. Linha de base do transdutor de pressão é ajustado para zero mmHg quando o coração não está conectado ao sistema de perfusão. Pseudo-ECG eletrodos são colocados na câmara de chumbo aproximada I, II, e III do triângulo de Einthoven ECG. </li></ol> 2. Colheita e de perfusão de corações de coelho <ol><li> Corrigir o coelho no limitador de coelho. Euthanize o coelho por uma injeção intravenosa de pentobarbital sódico (50 mg / kg) de heparina U com 2000. Quando o coelho é completamente eutanásia, que é determinada pela falta de reflexo de dor, a cavidade torácica é rapidamente aberta eo coração e os pulmões são excisadas. </li><li> Faça um corte na extremidade superior da aorta ascendente antes de todos os ramos do arco aórtico. Expulsar o ar da aorta ascendente e então rapidamente canular o coração a uma cânula de calibre 16, que foi previamente ligado a um caçador bolha que é muito importante para manter o ar para fora de coronárias. Uma vez que o coração é perfundido retrogradamente em um sistema de perfusão não-recirculação Langendorff, faça um corte para abrir o pericárdio rapidamente. </li><li> Remover o pulmão, traquéia, gordura e tecido conjuntivo, enquanto o sangue é lavado pela perfusão. </li><li> Muito importante! Um tubo de silicone (~ 3cm de comprimento e 2mm de diâmetro) é inserido através de uma veia pulmonar e valva mitral para o ventrículo esquerdo (LV) e mantido lá durante todo o experimento. Este tubo libera a solução que está preso no LV. Sem circulação por horas durante o experimento Langedorff-perfusão em um coração mecânico imobilizada, é susceptível de causar isquemia severa na cavidade do VE e produzir arritmia. </li><li> Mover o coração com a cânula para a recirculação do sistema Langendorff-perfusão com o aparelho de mapeamento óptico. </li></ol> 3. Realização de experimentos usando o Sistema de Mapeamento Panorâmica Optical <ol><li> Coloque o coração em uma câmara de hexágono feito por encomenda e se conectar a cânula para o sistema de perfusão. Manter a pressão aórtica em 60 ± 5 mmHg, ajustando a vazão da bomba de perfusão. Monitor de derivação I pseudo-ECG. Manter o pH em torno de 7,35 ± 0,05. </li><li> Desligue a luz da sala, porque é blebbistatin photoinactivated até o final UV e baixo (450-490 nm) 17 da parte visível do espectro. Injecte lentamente solução estoque blebbistatin através da porta de injeção no caçador bolha de ar localizado acima da cânula. Injecte lentamente blebbistatin 0,1 ml para cada injeção de bolus. Aguarde a pressão para estabilizar antes da próxima injeção. </li><li> Delicadamente, coloque o eletrodo de estimulação para o local específico para seu projeto experimental. </li><li> Focalizar a imagem do coração no vidro fosco localizadas no plano da imagem de cada matriz foto-diodo (PDA) a partir de trêsespaçados ângulos que envolve o coração. Ajustar a posição da cânula e as distâncias entre cada PDA eo coração a fim de encaixar o coração no campo de visão de todos os três PDAs. Tire uma foto de cada imagem focada no vidro fosco. </li><li> Injecte lentamente 10 ~ 20μL de solução stock di-4-ANEPPS através da porta de injeção na armadilha bolha de ar na solução de perfusão. Esperar 1 a 3 minutos antes de tomar gravações ópticas. </li><li> Para a primeira gravação, ligar a luz LED verde (sem filtro de excitação, FLOOD LED, LUMILEDS), tome gravações ópticas simultaneamente de três PDAs conectados com o sistema de aquisição de dados feito por encomenda, 5 e desligar a luz LED. Verificar a qualidade dos sinais de pixels diferente de todos os três PDAs. Adicionar 0,1 ~ 0,2 mL de solução stock blebbistatin se artefatos de movimento no potencial de ação ópticos são notados. Adicionar mais 5 mL de solução stock di-4-ANEPPS se o sinal-ruído é baixa. </li><li> Terminar o protocolo projetado experimental para o estudo funcional. Re-manchar o coração com adicional solução estoque 5μL di-4-ANEPPS se o sinal se deteriora durante os experimentos, devido à fotodegradação ou washout. </li><li> Ligue a luz da sala após a conclusão do estudo funcional. Tirar fotos do coração de 36 ângulos igualmente espaçados. Isto é conseguido através da rotação do coração em uma etapa de 10 ° com uma câmera digital fixa no local de um PDA. </li><li> Leve o coração para fora da câmara. Drenar todas as soluções. Lavar o sistema de perfusão na seqüência de DI água, álcool reagente 70%, e novamente de água DI. </li><li> A análise dos dados inclui a reconstrução da geometria do coração a partir de 36 fotografias digitais, o registro do sinal óptico sobre a superfície da geometria reconstruído, e quantificação da duração do potencial de acção (APD), velocidade de condução (CV), fase, etc 6 </li></ol> 4. Realização de experimentos usando o Sistema de Mapeamento de dupla <ol><li> (Continue após a parte 2) Coloque o coração canulados em uma câmara de vidro (Radnoti) e se conectar a cânula para o sistema de perfusão. Fechar o coração para o fundo da câmara de silício no ápice ventricular e átrios. </li><li> Desligar a luz do quarto. Injecte lentamente solução estoque blebbistatin (15 ~ 20 min para chegar 10μM), através da porta de injeção antes da cânula de perfusão para imobilizar o coração. </li><li> Colocar uma placa de Petri de plástico, ou cobrir outra janela de vidro, acima da superfície epicárdica para reduzir o movimento da superfície da solução. </li><li> Foco duas câmeras CMOS no sistema de mapeamento dual (Ultima-L, SciMedia) no mesmo campo de visão. Fluorescência emitida é separado por um espelho dicróico (635nm de corte, Omega Optical), e filtrado por um filtro de 700nm longpass (Thorlabs) para sinais de tensão e por um filtro passa-banda 590 / 30 nm (Omega Optical) para sinais de cálcio. </li><li> Aponte a guias de luz de duas lâmpadas de halogênio (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT; SciMedia, Costa Mesa, CA) para o mapeamento de campo de vista para conseguir uma iluminação uniforme. Filtros de excitação (nm 531/40, SemRock) são utilizados. </li><li> Manchar o coração com o RH corante sensíveis à voltagem solução estoque 237 (10 ~ 30 mL) através da porta de injeção. </li><li> Misture o Rhod-2:00 (0,2 mL) solução estoque com PLURONIC F-127 (Invitrogen, 1:1 mistura). Sonicate por 1min em um sonicador banho-maria. Injetar a mistura através da porta do caçador bolha. Aguarde cerca de 20 minutos para permitir que a de-esterificação do Rhod-2:00 antes do início do mapeamento. </li><li> Para uma gravação, desligar a bomba superfusão para evitar o movimento na superfície da solução; ligar a fonte de luz de excitação (as lâmpadas halógenas); tomar gravações ópticas usando ambas as câmeras conectadas ao sistema de aquisição de dados (Ultima-L, SciMedia) ; desligar a luz de excitação, e ligue a bomba superfusão. Verificar a qualidade dos sinais ópticos. Re-mancha o tecido, se necessário. </li><li> Terminar o resto do protocolo projetado para um estudo experimental. </li><li> Ligue a luz da sala e tirar uma fotografia do coração que contém o campo de visão. Leve o coração para fora da câmara. Drenar todas as soluções. Lavar o sistema de perfusão na seqüência de DI água, álcool reagente 70% (Fisher Scientific) e água DI. </li><li> Análise de dados contém as medidas de APD, CV, duração de cálcio transiente (CaTD), o atraso entre a AP movimento ascendente e aumento do gato, o tempo de subida do cálcio transiente, ea constante de tempo de um ajuste monoexponencial da decadência do CAT. </li></ol> Resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/3160/3160fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Representante resultados de um experimento de coelho Langendorff-perfundidos usando o sistema de mapeamento panorâmico óptica. (A) A visão anterior do coração do coelho e da geometria do coração reconstruído coelho na forma de uma imagem tridimensional da superfície de malha de grade. (B) Tele abriu superfície epicárdica de cores por fase (obtidos a partir do plano de análise de fase 18), indicando a frente de onda mostrada em vermelho durante um episódio de taquiarritmia. (C) As gravações ação óptica potencial de cinco posições em torno da singularidade fase marcada por 1-5 no painel B. (D) Oito instantâneos de frente de onda de ativação (cor vermelha) durante um ciclo de propagação de uma arritmia reentrante estável. Os círculos de frente de onda no sentido horário em torno de uma singularidade de fase, que é visível na superfície anterior do coração. A cor de repolarização (azul) está definido para ser parcialmente transparente para que a frente de onda posterior é visível (por exemplo, em 80ms, 100ms, 120ms e). Um filme desta arritmia reentrante é fornecido no vídeo suplementar 1. Os métodos para a reconstrução da geometria, o registro do sinal, o cálculo do mapa de fase, ea revelação de superfície são descritas em detalhes em outros lugares 6. <img src="/files/ftp_upload/3160/3160fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Representante resultados de um experimento coração Langendorff-perfundido de coelho usando o sistema de mapeamento dual (mapeamento do potencial de ação simultânea de cálcio e transitória). (A) A superfície anterior do coração com o campo de mapeamento de vista coberta por pontos pretos. (B) Uma visão de close-up das gravações de um site. (C) traça amostra do potencial de ação (azul) e de cálcio transiente (vermelho) de uma série de pontos espaçados marcada por pontos pretos no painel A. Note que nem todas as gravações de pixels são mostrados ea resolução espacial é 200μm.

<ol>
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Não há conflitos de interesse declarados.

Com base em nossa experiência, as chaves para o sucesso do experimento coração Langendorff-perfundido de coelho incluem solução bem preparado Tyrodes &#39;, a colheita rápida do coração, bem mantida a pressão de perfusão e pH adequado da solução oxigenada no sistema de perfusão. , A fim de gravar o sinal com maior relação sinal-ruído possível, é preciso considerar fatores como fonte de luz, filtros ópticos, com foco óptica, fotodetectores, etc 19. Detalhes sobre estes aspectos são discutidos em outros 19. Coelhos jovens (faixa etária: 4-5 meses, peso de 7-9 libras) poderia ser usado para evitar a gordura epicárdica, que diminui a relação sinal-ruído dos sinais ópticos. O sinal gravado por cada pixel é uma integração ponderada de luz emitida a partir de um volume de tecido. A profundidade deste volume de tecido depende do comprimento de onda de excitação e emissão do corante utilizado. Para di-4-ANEPPS, como exemplo, a profundidade de penetração estimada é de 300μm, no coração de coelho 20. Assim, a interpretação do sinal óptico deve ser feita com cautela quando a heterogeneidade local da função elétrica estão presentes no nó sinusal, nó atrioventricular, e durante arritmia ventricular 1,21,22. Uma limitação da técnica de mapeamento óptico em comparação com a gravação do eletrodo é que a fase de repolarização do potencial de ação é muitas vezes distorcida ótica de artefato de movimento causado pela contração cardíaca. Restrição mecânica pode ser usado para reduzir o artefato, mas não pode eliminá-lo completamente. Em comparação, farmacológicos excitação-contração desacopladores são eficazes na remoção do artefato de movimento. No entanto, estes desacopladores (por exemplo, 2,3-Monoxime Butanedione) poderia ter efeitos significativos no lado eletrofisiológico. Blebbistatin, foi demonstrado que não têm efeitos colaterais adversos sobre a eletrofisiologia cardíaca no coração normal 23, e é, portanto, um desacoplador promissoras para o mapeamento óptico. Deve-se notar que a aceleração de edema devido à abolição da contração também pode afetar a eletrofisiologia.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Companhia </td><td> Número Catálogo </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S271-1 </td></tr><tr><td> CaCl 2 (2H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> C79-500 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> Técnica S217-500 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (6H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> M33-500 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 (H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S369-500 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S233-3 </td></tr><tr><td> D-Glicose </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> D16-1 </td></tr><tr><td> Blebbistatin </td><td> Tocris Bioscience, Ellisville, MO </td><td> 1760 </td></tr><tr><td> Di-4-ANEPPS </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> D1199 </td></tr><tr><td> RH237 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> S1109 </td></tr><tr><td> Rhod-02:00 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> R1244 </td></tr><tr><td> PLURONIC F127 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> P3000MP </td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido (DMSO) </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> D2650 </td></tr></tbody></table>

multiparametric optical mapping of the langendorff-perfused rabbit heart

Imagens ópticas e sondas fluorescentes têm avançado significativamente metodologia de pesquisa no campo da eletrofisiologia cardíaca de uma forma que não poderia ter sido realizado por outras abordagens 1. Com a utilização dos corantes em cálcio e sensíveis à voltagem, mapeamento óptico permite a medição do potencial transmembrana de ação e transientes de cálcio com alta resolução espacial sem o contato físico com o tecido. Isso faz com que as medições da atividade elétrica cardíaca possível sob muitas condições onde o uso de eletrodos é inconveniente ou impossível 1. Por exemplo, as gravações ópticas fornecer informações precisas alterações morfológicas do potencial de membrana durante e imediatamente após a estimulação e desfibrilação, enquanto as técnicas convencionais de eletrodos sofrem de estímulo induzido artefatos durante e após estímulos, devido à polarização do eletrodo 1. O coração de coelho Langendorff-perfundidos é um dos modelos mais estudados da fisiologia e fisiopatologia do coração humano. Muitos tipos de arritmias observadas clinicamente poderia ser recapitulada no modelo de coração de coelho. Foi mostrado que os padrões de ondas no coração de coelho durante arritmias ventriculares, determinado pelo tamanho efetivo do coração e do comprimento de onda de reentrada, são muito semelhantes aos que nos dois coração humano. Também foi mostrado que os aspectos críticos da excitação-contração (CE) no acoplamento de coelho miocárdio, tais como a contribuição relativa de retículo sarcoplasmático (SR), é muito semelhante ao acoplamento CE humanos 3. Apresentamos aqui os procedimentos básicos de experimentos de mapeamento óptico nos corações perfundidos Langendorff-coelho, incluindo a configuração do sistema de perfusão Langendorff, o mapeamento de instalação de sistemas ópticos, o isolamento e canulação do coração de perfusão, e corante coloração do coração, excitação-contração desacoplamento, recolha e de sinais ópticos. Estes métodos podem ser aplicados também para o coração de outras espécies de coelho com ajustes para taxas de fluxo, óptica, soluções, etc Dois sistemas de mapeamento óptico são descritos. O sistema de mapeamento panorâmico é usado para mapear todo o epicárdio do coração de coelho 4-7. Este sistema proporciona uma visão global da evolução dos circuitos reentrantes durante arritmogênese e desfibrilação, e tem sido usado para estudar os mecanismos das arritmias e terapia antiarrhythmia 8,9. O sistema de mapeamento dupla é usada para mapear o potencial de ação (AP) e cálcio transiente (CAT) simultaneamente a partir do mesmo campo de visão 10-13. Esta abordagem tem melhorado nossa compreensão do importante papel do cálcio no alternância elétrica ea indução de arritmia 14-16.

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Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Este artigo descreve os procedimentos básicos para a realização de experimentos de mapeamento óptico no coração de coelho Langendorff-perfundidos usando o sistema de imagem panorâmica, ea modalidade de imagem dupla (tensão e cálcio).

Multiparamétrico Mapping Optical do Coração Coelho Langendorff-perfundidos

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

multiparametric-optical-mapping-langendorff-perfused-rabbit

Research

JoVE Journal

Bioengineering

22.4K visualizações.  Washington University in St. Louis. Este artigo descreve os procedimentos básicos para a realização de experimentos de mapeamento óptico no coração de coelho Langendorff-perfundidos usando o sistema de imagem panorâmica, ea modalidade de imagem dupla (tensão e cálcio).

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Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

Mapeamento de potenciais de ação óptica e transientes de cálcio no coração de rato

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Bioengenharia

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

A Cre-Lox Abordagem Recombinação P para Detecção de fusão celular In Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

Em síntese in vitro de Nativo, Espaçamento fibroso Long e Colágeno Espaçamento segmentar Longo

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Patient-specific Modeling of the Heart: Estimation of Ventricular Fiber Orientations

Patient-specific simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered by the absence of in vivo imaging technology for clinically acquiring myocardial fiber orientations. The objective of this project was to develop a methodology to estimate cardiac fiber orientations from in vivo images of patient heart geometries. An accurate representation of ventricular geometry and fiber orientations was reconstructed, respectively, from high-resolution ex vivo structural magnetic resonance (MR) and diffusion tensor (DT) MR images of a normal human heart, referred to as the atlas. Ventricular geometry of a patient heart was extracted, via semiautomatic segmentation, from an in vivo computed tomography (CT) image. Using image transformation algorithms, the atlas ventricular geometry was deformed to match that of the patient. Finally, the deformation field was applied to the atlas fiber orientations to obtain an estimate of patient fiber orientations. The accuracy of the fiber estimates was assessed using six normal and three failing canine hearts. The mean absolute difference between inclination angles of acquired and estimated fiber orientations was 15.4 &deg;. Computational simulations of ventricular activation maps and pseudo-ECGs in sinus rhythm and ventricular tachycardia indicated that there are no significant differences between estimated and acquired fiber orientations at a clinically observable level.The new insights obtained from the project will pave the way for the development of patient-specific models of the heart that can aid physicians in personalized diagnosis and decisions regarding electrophysiological interventions.

A methodology to estimate ventricular fiber orientations from in vivo images of patient heart geometries for personalized modeling is described. Validation of the methodology performed using normal and failing canine hearts demonstrate that that there are no significant differences between estimated and acquired fiber orientations at a clinically observable level.

Paciente específico Modelagem do Coração: Estimativa de Orientações de fibra ventriculares

Patient-specific  simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered  by the absence of in vivo imaging technology for ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

A detecção óptica de<em&gt; E. coli</em&gt; Bactérias por mesoporosos Silicon Biossensores

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

NANOmanipulação de Solteiro RNA Moléculas por pinça óptica

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

Em Situ Mapeamento das propriedades mecânicas de biofilmes por de rastreamento de partículas Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Intraductal Delivery to the Rabbit Mammary Gland

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and adverse effects1,2,3,4,5,6,7. However, several challenges remain before these treatments can be applied more widely. The development and validation of intraductal therapeutics in an appropriate animal model facilitate the development of intraductal therapeutic strategies for patients. While the mouse mammary gland has been widely used as a model system of mammary development and tumorigenesis, the anatomy is distinct from the human gland. A larger animal model, such as the rabbit, may serve as a better model for mammary gland structure and intraductal therapeutic development. In contrast to mice, in which ten ductal trees are spatially distributed along the body axis, each terminating in a separate teat, the rabbit mammary gland more closely resembles the human gland, with multiple overlapping ductal systems that exit through separate openings in one teat. Here, we present minimally invasive methods for the delivery of reagents directly into the rabbit mammary duct and for visualization of the delivery itself with high-resolution ultrasound imaging.

Here, we describe a technique for the localized delivery of reagents to the rabbit mammary gland via an intraductal injection. In addition, we describe a protocol for visualization and the confirmation of delivery by high-resolution ultrasound imaging of contrast agents.

Entrega Intraductal ao Coelho glândula mamária

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

Microscopia de fluorescência de luz-folha para o estudo do coração murino

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive models, which provide a mathematical representation of the mechanical function of those structures. This presented biaxial mechanical testing protocol involves (i) tissue acquisition, (ii) the preparation of tissue specimens, (iii) biaxial mechanical testing, and (iv) postprocessing of the acquired data. First, tissue acquisition requires obtaining porcine or ovine hearts from a local Food and Drug Administration-approved abattoir for later dissection to retrieve the valve leaflets. Second, tissue preparation requires using tissue specimen cutters on the leaflet tissue to extract a clear zone for testing. Third, biaxial mechanical testing of the leaflet specimen requires the use of a commercial biaxial mechanical tester, which consists of force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation testing protocols to characterize the leaflet tissue&#39;s mechanical properties. Finally, post-processing requires the use of data image correlation techniques and force and displacement readings to summarize the tissue&#39;s mechanical behaviors in response to external loading. In general, results from biaxial testing demonstrate that the leaflet tissues yield a nonlinear, anisotropic mechanical response. The presented biaxial testing procedure is advantageous to other methods since the method presented here allows for a more comprehensive characterization of the valve leaflet tissue under one unified testing scheme, as opposed to separate testing protocols on different tissue specimens. The proposed testing method has its limitations in that shear stress is potentially present in the tissue sample. However, any potential shear is presumed negligible.

This protocol involves characterizations of atrioventricular valve leaflets with force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation biaxial mechanical testing procedures. Results acquired with this protocol can be used for constitutive model development to simulate the mechanical behavior of functioning valves under a finite element simulation framework.

Biaxial caracterizações mecânicas das válvulas cardíacas Atrioventricular

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...