Gostaríamos de agradecer a todos os muitos passados ​​de graduação, estudantes de graduação e pós-doutoramento que contribuíram com seu tempo e esforço para o estudo da fibrogênese colágeno em nosso laboratório. As Ciências Naturais e Engenharia do Conselho de Pesquisa do Canadá tem continuamente desde o financiamento para os nossos estudos de colágeno.

NOTA: A água utilizada em todos os protocolos tem uma resistividade&gt; 18 MΩ.cm. 1. Nativas fibrilas de colágeno <ol><li> Combinar 6 ul de água, 20 ul de 200 mM de Na 2 HPO 4 ajustada a pH 7 com HCl e 10 ul de 400 mM de KCl, em um tubo de microcentrífuga e misturar. </li><li> Adicionar 4 ul de colagénio monómero (~ 3 mg / ml em HCl 0,01 N) ao tubo de microcentrífuga e misturar. A solução deve ser límpida e incolor. </li><li> Colocar o tubo de microcentrífuga contendo a mistura de reacção num bloco de aquecimento que tenha sido pré-aquecido a 37 ° C, deixando repousar durante 3-4 horas. Neste ponto, a solução deve ser ligeiramente turva e contêm fibrilas de colagénio principalmente nativas. </li></ol> 2. Colágeno Espaçamento fibroso Longo <ol><li> Dializar 1 ml de colágeno monómero (~ 3 mg / ml em HCl 0,01 N), utilizando 12-14 kDa membrana MWCO contra 400 ml de água, trocando a água quatro vezes ao longo de um período de 24 horas à temperatura ambiente. O collag dialisadoen monómero que não é usado de imediato pode ser armazenado a 4 ° C para uso futuro. </li><li> Combinar 20 ul de água, 20 ul de 3 mg / ml de ácido glicoproteína α1-em-água e 20 ul de monómero de colagénio dialisada em tubo de microcentrífuga. A solução deve ser límpida e incolor. </li><li> Deixar o tubo de microcentrífuga contendo a mistura de reacção à temperatura ambiente durante 30 min. Neste ponto, a solução deve ser turva e contêm fibrilas de colagénio predominantemente FLS. </li></ol> 3. Colágeno Espaçamento segmentar Longo <ol><li> Combinar 67 ul de água, 60 ul de 100 mM de tampão de glicina-HCl a pH 3,3 e 40 ul de 10 mg / ml em ATP água em um tubo de microcentrífuga e misturar. </li><li> Adicionar 33 ul de colagénio monómero (~ 3 mg / ml em HCl 0,01 N) ao tubo de microcentrífuga e misturar. A solução deve ser límpida e incolor. </li><li> Deixar o tubo de microcentrífuga contendo a mistura de reacção à temperatura ambiente durante 2 hr. Neste ponto, a solução continua a aparecer claro, mas deveconter colágeno principalmente SLS. </li></ol> 4. AFM Caracterização <ol><li> Clivar a superfície de uma parte de mica ligado a um substrato de AFM, cobrindo a superfície de mica com um pedaço de fita adesiva e, em seguida, descascando-lo fora. Verifique a fita depois de confirmar que toda uma camada de mica foi clivado, a fim de reduzir as irregularidades na superfície e garantir que a amostra é removida de idade se a mica está a ser reutilizado. </li><li> Aplicar 20 ul da solução de colagénio fibrilar para o substrato de mica clivada de fresco. Deixar durante 5 minutos. </li><li> Gentilmente enxaguar solução de colágeno fibrilar com água. É aconselhável não aplicar a água directamente sobre o centro do substrato de mica, mas na borda e para permitir que ele flua através da amostra. </li><li> Seque a superfície sob uma corrente suave de azoto gasoso. É aconselhável para dirigir o fluxo na borda e não no centro do substrato de mica. </li><li> Sob um microscópio óptico de ampliação em 200 ×,as amostras de colágeno nativo e FLS deve mostrar aglomerados de fibras. Colágeno SLS não será visível. </li><li> As características únicas dos três estruturas diferentes de colagénio são observáveis ​​por AFM. Geralmente, nós, imagem nativa fibrilas de colágeno com um AFM no modo de contato intermitente com sondas de silício AFM, enquanto FLS e colágeno SLS fibrilas nós imagem tipicamente com um AFM no modo contato usando sondas de nitreto de silício AFM. Fazemos isso por causa do tempo e considerações de custo. Sondas de silício AFM são geralmente mais cortante do que as sondas de nitreto de silício de AFM, que os tornam particularmente úteis para imagiologia da estrutura de bandas mais estreitas de fibrilhas de colagénio nativo. Contudo, as sondas de silício AFM são muito mais propensos a contaminação por amostras de colágeno do que as sondas de nitreto de silício AFM e precisa ser substituído com frequência. Portanto, nós nos reservamos o uso de sondas de silício AFM principalmente para fibrilas de colágeno imagem nativas em que a resolução é uma maior necessidade e que operam em modo de contato intermitente prolong toda a sua vida de utilidade. </li></ol> Recomendamos uma inicial de 100 × 100 fim 2 varredura que deve mostrar pelo menos construções colágenas. A partir daí, o zoom, para fazer a varredura em tamanhos de 10 x 10 ^ M 2 e, em seguida 2 x 2 m 2 para observar a periodicidade de bandas de colagénio nativo e FLS, ou as características mais finas de um colagénio SLS. Também é uma boa ideia para verificar pelo menos duas outras regiões da amostra de colagénio para verificar que as verificações iniciais são representativos.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Purificou-monómero de colagénio é estável a pH baixo e temperatura e a formação de fibrilhas de colagénio nativo essencialmente envolve o aumento do pH e temperatura da solução de monómero de colagénio. Procedimentos para a reconstituição de fibrilas de colágeno em faixas de monômeros existem há mais de 50 anos. O procedimento que o nosso laboratório usado nos nossos primeiros estudos com colagénio de 15 anos atrás 7 foi baseada em procedimentos resumidos por Chapman e colaboradores em 1986 10. As condições para a formação de fibrilas de colagénio em que trabalhos anteriores foram 0,18 mg / ml de colagénio em monómeros de Na 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 (I = 0,2, pH 7,4) tampão a 34 ° C. O inconveniente deste e de outros procedimentos que tentámos é que existem sempre fibrilas unbanded formadas juntamente com as fibrilas desejados sombreadas. As nossas novas condições são ~ 0,3 mg / ml de colagénio em monómeros fosfato 100 mM e 100 mM de KCl, a pH 7 deixados a 37 ° C durante 3-4 horas. O procedimentomento aqui descrito difere em todos os aspectos do processo anterior para a tomada de fibrilhas de colagénio nativo. Mas o mais notavelmente, dobramos a força iónica, aumentando a concentração de tampão e adição de 100 mM de KCl. O aumento da força iônica na formação mais consistente de fibrilas de colágeno exclusivamente em faixas. Em nossa experiência, as únicas vezes que este procedimento não tem produzido o colágeno tipo nativo foi quando a solução de monômero de colágeno foi passado data recomendada pelo fabricante de uso. Quando isto ocorre, o que é observado varia de menos fibrilas que são todos unbanded para muitas fibrilas ainda observados, mas predominantemente unbanded. Note que monômero colágeno expirado muitas vezes pode ainda ser utilizado com sucesso para fazer colágeno nativo, mas quando falha, o monómero de novo colágeno deve definitivamente ser comprado. FLS foi identificado pela primeira vez por Highberger et al. 17 em preparações de colagénio creditados Orekhovich et al. 18. Mais estudos levaram Highberger e Schmitt a concluir que se tratava de glicoproteína α1-ácido que promove a formação de FLS 12. Nós foram posteriormente capaz de replicar o procedimento para fazer o colagénio FLS pela combinação de monómero de colagénio disponíveis comercialmente e α1-glicoproteína ácida a pH baixo e, lentamente, permitindo que o pH a subir por diálise da mistura contra água durante 24 h 11. Apresentamos agora uma modificação do referido processo de diálise por o monómero de colagénio contra água em primeiro lugar e simplesmente combinando-o com α1-glicoproteína ácida em água para formar colagénio FLS. As condições para FLS colagénio montagem aqui descritos são muito menos demorado. O monómero de colagénio ainda necessita de ser pré-dialisado contra água, mas ele pode ser feito em grandes quantidades e, em seguida, armazenada a 4 ° C de forma estável até ser utilizado. Isso gera novo procedimento predominantemente fls fibrilas de colágeno bandados. Pela nossa experiência, α1-ácido glicoproteína com um teor de proteína e água inferior combinado, e, por inferência, maior teor de açúcar, é fundamental para o sucesso fazendo fibrilas de fls. Nós normalmente verificar com o fabricante que o lote glicoproteína α1-ácido que usamos tem um combinado% de teor de proteína e água de 82 ou menos. E, como com o procedimento para a síntese de colagénio nativo, de monómero de colagénio que é demasiado antigo pode também resultar na incapacidade de produzir colagénio FLS. Além disso, a pureza da água utilizada para a diálise é crítica neste processo. Por exemplo, a diálise do monómero de colagénio mesmo contra ~ 8 MΩ.cm vez de&gt; 18 água resulta MΩ.cm em uma solução de colagénio que não irá formar colagénio FLS. Um dos três tipos de colagénio de fibrila, o mais fácil de fazer é colagénio SLS. A primeira preparação de SLS foi descrito por Schmitt e colegas de trabalho 15. Nós publicamos uma adaptação desse procedimento há 12 anos para fazer colágeno SLS usando coll disponível comercialmenteagen 14. O procedimento implica simplesmente combinar 2 mg / ml de ATP e 0,5 mg / ml de colagénio em monómeros de 0,05% (v / v) de ácido acético a pH 3,5, e deixando a mistura à temperatura ambiente durante a noite. Na nossa experiência, o aspecto crítico da montagem SLS que deve ser controlado é o pH da solução de reacção. SLS montado em condições mais básicas (~ pH 3,6-3,9) resulta em aglomerados de agregados de cristalitos. Condições mais ácidas (pH ~ 2,9-3,2) resulta em mais finas, cristalitos mais separados do que os montados sob as condições ideais de pH 3,3-3,5. PHs reação fora deste intervalo (&lt;2,8 e&gt; 4) não produzem qualquer colágeno SLS. No passado, foi ajustado o pH da mistura de reacção por adição de ácido acético. Para simplificar o processo ainda mais, neste manuscrito, introduzimos um tampão de glicina-HCl para controlar o pH. As três estruturas diferentes de colagénio formadas a partir dos protocolos descritos acima têm caráctercaracterísticas humanístico que só pode ser discernido por instrumentos capazes de resolução de nanômetros. Colágeno nativo e FLS são caracterizados por bandas periodicidades de ~ 67 nm e ~ 270 nm. A dimensão mais longa do colagénio SLS é apenas ~ 360 nm. Nós descrevemos especificamente como usamos um AFM para caracterizar as três estruturas de colágeno diferentes. No entanto, qualquer operação AFM em contacto ou o modo de contacto intermitente com qualquer sonda de AFM com &lt;raio nm 10 deve também ser capaz de imagem destas estruturas de colagénio. Além disso, a microscopia de electrões pode ser, e tem sido utilizado para caracterizar as estruturas de colagénio 19. A principal vantagem destes processos é que eles produzem, predominantemente, o colagénio desejado construir. A única outra forma de colagénio que se encontra nestas reacções é o monómero de partida, o que é muitas vezes visível no fundo das imagens de AFM. No caso do colagénio nativo e FLS, eles podem ser facilmente separados a partir de mais do unreamonómero CTED por centrifugação repetida e lavagem do resultante nativo ou colagénio FLS pellet com água. Apresentámos procedimentos simples e fiável para a tomada nativas, FLS e colagénio SLS utilizando avançadas, materiais de partida disponíveis comercialmente. O monómero de colagénio utilizada em todos estes processos é comercialmente disponível na forma purificada. α1-glicoproteína ácida e ATP também estão ambos disponíveis comercialmente.

O colagénio é uma classe de proteínas estruturais que têm uma estrutura helicoidal tripla formada a partir de três cadeias polipeptídicas. Estes monómeros helicoidais triplas adicionais montar de uma maneira hierárquica de modo a formar estruturas progressivamente maiores. Existem pelo menos 28 tipos de colagénio geneticamente diferentes que foram identificadas 1. Combinados, colágenos representam 30% do total de proteínas encontradas em animais, do tipo I, a contabilidade de forma predominante para até 90% de todas as proteínas de colágeno 2. O colágeno tipo I é encontrado como estruturas fibrillous na pele, ligamentos, tendões e ossos. Microscópio de força atômica (AFM) e microscopia eletrônica (ME) imagens de Tipo I fibras de colágeno nativo normalmente mostram faixas com um período característico de ~ 67 nm (muitas vezes referido como D-faixas) 3-5. O tipo I é um monómero de colagénio helicoidal triplo heterotrimero constituído por dois α1 idênticos (I) e uma cadeia α2 (I) de cadeia, cada um mais do que ummil aminoácidos de comprimento. É longo e fino com dimensões de 300 nm de comprimento e 1,4 nm de diâmetro. Colagénio do tipo I de monómero pode ser prontamente obtido por decomposição formados naturalmente estruturas de ordem superior 6. Nós 7 e 8-10 muitos outros têm mostrado que estes blocos de construção monoméricos solúveis em seguida, pode ser usado para reconstruir D-bandados fibrilhas in vitro (Figura 1). Além de fibrilhas de colagénio nativo, duas outras estruturas mais elevadas de colagénio de ordem foi encontrado para formar in vitro, utilizando o bloco de construção mesmo monómero. As duas estruturas são espaçamento longo fibroso (FLS) e um espaçamento de longo segmentar (SLS) colágeno (Figura 1). FLS colagénio é uma construção fibrillous como colagénio nativo, mas é caracterizada por uma maior periodicidade bandas de colagénio nativo 11. In vitro, o colagénio FLS forma quando o monómero é combinada com colágeno α1-glicoproteína ácida <sup&gt; 12. FLS colagénio tem sido observada in vivo, bem como, embora raramente 13. Colagénio SLS é descrito como cristais porque os monómeros são alinhados no registo como numa estrutura de cristal 14. SLS colagénio forma-se quando o monómero de colagénio é combinado com o trifosfato de adenosina (ATP) 15. Que ocorre naturalmente colagénio SLS foi observado no meio de cultura de fibroblastos, mas não em amostras de tecido extraídos, provavelmente devido ao seu pequeno tamanho e falta de características topográficas distintas 16. O objetivo deste artigo é apresentar os procedimentos detalhados para a tomada de fibrilas de colágeno nativas como FLS bem e colágeno SLS que mesmo o pesquisador mais inexperiente pode reproduzir. Usando disponíveis comercialmente a partir de materiais avançados, temos tentado fazer os protocolos tão simples quanto possível e ainda tê-los funcionar de forma confiável. Nós também detalhes como usar um AFM para caracterizar a estrutura do colágeno diferentes que são feitas. Este trabalho será benéfico para pesquisadores que querem estudar uma ou mais dessas estruturas superiores de colágeno de ordem e / ou utilizá-los como precursores em outras aplicações, mas que não têm o conhecimento ou simplesmente não querem trabalhar com amostras de tecido.

<table border="1"><tbody><tr><td> Material / reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Colagénio do tipo I de monómero (~ 3 mg / ml em HCl 0,01 N) </td><td> Inamed Avançado Biomatrix </td><td> 5409 5005-B </td><td> Lote 1261443 (2,9 mg / ml, pH 2,1) Lote 1629346 (3,2 mg / ml, pH 2,1) Lot 6006 (3,2 mg / ml, pH 2,1) </td></tr><tr><td> ATP </td><td> Bioquímicos de investigação internacionais </td><td> A-141 </td><td> Lote FBJ-1194A </td></tr><tr><td> α1-glicoproteína ácida a partir de plasma de bovino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G3643 </td><td> Lote 051K7440 (89,8%) Lote 011K7410 (82%) Lote 065K7405 (71,2%) Lote 063K7495 (71,9%) Lote 117K7535 (75,9%) (Proteína teor de água +) </td></tr><tr><td> a1-ácido glycoprotein de plasma humano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9885 </td><td> Lote 128H7606 (70,9%) Lote 049K7565V (68%) (Proteína teor de água +) </td></tr><tr><td> mica </td><td> Ted Pella </td><td> 53 </td><td></td></tr><tr><td> Pointprobe - Silicon SPM-Sensor </td><td> Nanoworld </td><td> NHC </td><td> Silício AFM sonda que nós usamos para o modo de contato intermitente </td></tr><tr><td> Nanoprobe Dicas Veeco </td><td> Veeco (Agora sondas Bruker AFM) </td><td> NP-S </td><td> Nitreto de silício sonda de AFM que usamos para o modo de contato </td></tr></tbody></table>

in vitro synthesis of native, fibrous long spacing and segmental long spacing collagen

Fibrilhas de colagénio estão presentes na matriz extracelular de tecido animal para fornecer um andaime estrutural e resistência mecânica. Estas fibrilas de colagénio nativo tem uma periodicidade característica de bandas de ~ 67 nm e são formados in vivo, através do conjunto hierárquico de monómeros de colagénio do Tipo I, que são de 300 nm de comprimento e 1,4 nm de diâmetro. In vitro, através da variação das condições a que a blocos de construção monoméricos são expostos, estruturas únicas que variam em escalas de comprimento até 50 microns pode ser construído, incluindo não só as fibras do tipo nativo, mas também fibras de colagénio e espaçamento de longo prazo espaçamento segmentar. Este trabalho apresenta os procedimentos para a formação das três estruturas diferentes de colagénio a partir de um monómero de colagénio comum disponível comercialmente. Utilizando os protocolos que nós e outros já publicados no passado para fazer estes três tipos tipicamente levam a misturas de estruturas. Em particular, fibrilas unbanded eram geralmente found ao fazer colágeno nativo, e fibras nativas foram muitas vezes presente na tomada de colágeno fibroso espaçamento longo. Estes novos procedimentos têm a vantagem de produzir o desejado tipo de colagénio fibrilar quase exclusivamente. A formação das estruturas desejadas é verificada por imagem usando um microscópio de força atómica.

Colágeno nativo A mistura de reacção de monómeros de colagénio ~ 0,3 mg / ml em 100 mM de fosfato de KCl e 100 mM a pH 7, à esquerda, a 37 ° C durante 3-4 horas irá produzir uma solução que contém fibras de colagénio nativo de tipo com clara ~ 67 nm D-bandas, sem fibrilas unbanded. Sob um microscópio óptico de ampliação a 200 ×, aglomerados de fibras de várias podem ser visto normalmente sobre o substrato de mica em particular quando visualizado por contraste de interferência diferencial (DIC) microscopia (Figura 2). Num exemplo típico, um 100 × 100 um aleatório 2 digitalização por AFM normalmente apresentam pelo menos alguns que são fibrilas 5-50 microns de comprimento (Figuras 3a-c). Individual, fibrilas de colagénio separados podem ser facilmente identificados na presente fase. Com uma varredura de pixel 512 512 × imagem 2, zoom em um tamanho de 10 10 pM × scan 2 mostra que todas as fibrilas estão em faixas (Figuras 3d-f </strong&gt;). A fim de medir com precisão a periodicidade de bandas, é melhor para aumentar o zoom em um 2 × 2 m tamanho de digitalização 2 (Figuras 3g-i). Bandeamento periodicidade pode ser determinada por simples medição e calculando a média da distância longitudinal entre vários picos ou vales. Alternativamente, se o software permite AFM, um Fourier unidimensional ao longo de uma transformação corte longitudinal podem também ser usados. Figura 4 mostra uma imagem AFM altura de uma fibrila e uma correspondente secção transversal longitudinal. FLS colágeno A mistura de reacção de 1 mg / ml de ácido-glicoproteína μ1 e 1 ~ monómero colagénio mg / ml em água deixada à temperatura ambiente durante 30 minutos irá produzir uma solução de fibrilas de colagénio FLS. Aglomerados de fibras, semelhante à que se observa no caso do colagénio nativo, pode ser facilmente visto sobre o substrato de mica com um microscópio óptico a 200 × magnification. Em uma amostra típica, um aleatório de 100 × 100 fim 2 varredura por AFM normalmente irá mostrar pelo menos algumas fibrilas. Com um 512 x 512 pixel de tamanho da digitalização da imagem 2, a periodicidade de bandas pode ser medido por um zoom em 10 x 10 um 2 scan (Figura 5a) ou, mais precisamente, com uma 2 x 2 m 2 de varredura (Figura 5b). Figura 5c mostra uma secção transversal longitudinal de uma fibrila FLS. SLS colágeno A mistura de reacção de 2 mg / ml e ATP ~ 0,5 mg / ml de colagénio de monómero em 100 mM de tampão de glicina-HCl a pH 3,3 foi deixada à temperatura ambiente durante 2 horas vai produzir uma solução de colagénio SLS. Normalmente, cristalitos SLS não será visível ao microscópio óptico. Um AFM é necessária para confirmar a presença dos cristalitos SLS. Em uma amostra típica, um aleatório de 100 × 100 fim 2 varredura por AFM normalmente irá mostrar muitospontos. Zoom em um 10 de 10 um × 2 varredura normalmente irá mostrar vários cristalitos SLS (Figura 6). E um 2 x 2 m 2 de varredura (Figura 6b) mostra a estrutura fina de um cristalito SLS. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig1.jpg" /> Figura 1. As três formas estruturalmente diferentes de fibrilas de colagénio que podem ser formados in vitro a partir de monómeros de colagénio. Imagens de AFM mostrando monômero de colágeno e as três estruturas superiores de colágeno ordem tudo na escala de mesmo tamanho (2 × 2 m 2). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig2.jpg" /> Figura 2. Imagem digital em ~ ampliação × 200 por microscopia óptica DIC de fibrilas de colágeno nativo em mica (a) intocado e (b) limiarizadas e afiada tó destacar as fibrilas. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig3.jpg" /> Imagens Figura 3. AFM de fibrilas de colágeno nativo em mica. Intermitentes de contacto modo imagens de AFM de amplitude são mostradas. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig4.jpg" /> Figura 4. (A) 0,5 × 1 um 2 modo intermitente contacto imagem AFM altura (escala vertical = 100 nm) e (b) secção transversal longitudinal de um nativo do colagénio fibrilar. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig5.jpg" /> Figura 5. Imagens AFM de fibrilhas de colagénio sobre FLS mica. (A) 10 × 10 um 2 contacto modo deflexão imagem AFM, (b) 2 x 2 m 2 de contactos de modo de imagem deflexão AFM e (c) longitudinalsecção transversal de uma fibrila de colagénio FLS. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/4417/4417fig6.jpg" /> Figura 6. Imagens AFM de SLS colagénio em mica. Intermitentes de contacto modo imagens de AFM de amplitude são mostradas.

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In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Procedimentos simples e reprodutíveis são descritos por fazer três conjuntos de colágeno estruturalmente distintos de um tipo comum disponível comercialmente eu monômero de colágeno. Tipo nativo, o espaçamento de tempo de colagénio fibroso ou espaçamento segmentar longo pode ser construído através da variação das condições a que os 300 nm de comprimento e 1,4 nm de diâmetro bloco de construção de monómero é exposta.

Em síntese in vitro de Nativo, Espaçamento fibroso Long e Colágeno Espaçamento segmentar Longo

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

13.6K visualizações.  University of Toronto. Procedimentos simples e reprodutíveis são descritos por fazer três conjuntos de colágeno estruturalmente distintos de um tipo comum disponível comercialmente eu monômero de colágeno. Tipo nativo, o espaçamento de tempo de colagénio fibroso ou espaçamento segmentar longo pode ser construído através da variação das condições a que os 300 nm de comprimento e 1,4 nm de diâmetro bloco de construção de monómero é exposta.

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Tri-layered Electrospinning to Mimic Native Arterial Architecture using Polycaprolactone, Elastin, and Collagen: A Preliminary Study

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery under pulsatile deformations. The goal of this study was to mimic the structure of native artery by fabricating a multi-layered electrospun conduit composed of poly(caprolactone) (PCL) with the addition of elastin and collagen with blends of 45-45-10, 55-35-10, and 65-25-10 PCL-ELAS-COL to demonstrate mechanical properties indicative of native arterial tissue, while remaining conducive to tissue regeneration. Whole grafts and individual layers were analyzed using uniaxial tensile testing, dynamic compliance, suture retention, and burst strength. Compliance results revealed that changes to the middle/medial layer changed overall graft behavior with whole graft compliance values ranging from 0.8 - 2.8 % / 100 mmHg, while uniaxial results demonstrated an average modulus range of 2.0 - 11.8 MPa. Both modulus and compliance data displayed values within the range of native artery. Mathematical modeling was implemented to show how changes in layer stiffness affect the overall circumferential wall stress, and as a design aid to achieve the best mechanical combination of materials. Overall, the results indicated that a graft can be designed to mimic a tri-layered structure by altering layer properties.

The aim of this study was to mimic the native three layered architecture of the arterial wall. To accomplish this, electrospinning was employed with the use of a 3-1 (input-output) nozzle and blends of polycaprolactone, elastin, and collagen.

Tri-layered Electrospinning para Mimic Arquitetura Arterial nativos usando policaprolactona, elastina e colágeno: um estudo preliminar

Throughout native artery, collagen and elastin play an important role, providing a mechanical backbone, preventing vessel rupture, and promoting recovery ...

Bioengenharia

A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke

Cigarette smoking is associated with human cancers. It has been reported that most of the lung cancer deaths are caused by cigarette smoking 5,6,7,12. Although tobacco tars and related products in the particle phase of cigarette smoke are major causes of carcinogenic and mutagenic related diseases, cigarette smoke contains significant amounts of free radicals that are also considered as an important group of carcinogens9,10. Free radicals attack cell constituents by damaging protein structure, lipids and DNA sequences and increase the risks of developing various types of cancers. Inhaled radicals produce adducts that contribute to many of the negative health effects of tobacco smoke in the lung3. Studies have been conducted to reduce free radicals in cigarette smoke to decrease risks of the smoking-induced damage. It has been reported that haemoglobin and heme-containing compounds could partially scavenge nitric oxide, reactive oxidants and carcinogenic volatile nitrosocompounds of cigarette smoke4. A 'bio-filter' consisted of haemoglobin and activated carbon was used to scavenge the free radicals and to remove up to 90% of the free radicals from cigarette smoke14. However, due to the cost-ineffectiveness, it has not been successfully commercialized. Another study showed good scavenging efficiency of shikonin, a component of Chinese herbal medicine8. In the present study, we report a protocol for introducing common natural antioxidant extracts into the cigarette filter for scavenging gas phase free radicals in cigarette smoke and measurement of the scavenge effect on gas phase free radicals in mainstream cigarette smoke (MCS) using spin-trapping Electron Spin Resonance (ESR) Spectroscopy1,2,14. We showed high scavenging capacity of lycopene and grape seed extract which could point to their future application in cigarette filters. An important advantage of these prospective scavengers is that they can be obtained in large quantities from byproducts of tomato or wine industry respectively11,13

Spin-trapping ESR spectroscopy was used to study the effect of plant antioxidants lycopene, pycnogenol and grape seed extract on scavenging gas-phase free radicals in cigarette smoke.

Um Protocolo para Detecção e eliminação em fase gasosa radicais livres do fumo do cigarro Mainstream

Cigarette smoking is associated with human cancers. It has been reported that most of the lung cancer deaths are caused by cigarette smoking 5,6,7,12.  ...

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a high resolution X-ray microscope, thus enabling visualization of internal structural elements under simulated physiological loads and wet conditions. Experimental specimens will include intact bone-periodontal ligament (PDL)-tooth fibrous joints. Results will illustrate three important features of the protocol as they can be applied to organ level biomechanics: 1) reactionary force vs. displacement: tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics: geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. from concentric to eccentric loads. Efficacy of the proposed protocol will be evaluated by coupling mechanical testing readouts to 3D morphometrics and overall biomechanics of the joint. In addition, this technique will emphasize on the need to equilibrate experimental conditions, specifically reactionary loads prior to acquiring tomograms of fibrous joints. It should be noted that the proposed protocol is limited to testing specimens under ex vivo conditions, and that use of contrast agents to visualize soft tissue mechanical response could lead to erroneous conclusions about tissue and organ-level biomechanics.

In situ Compressive Loading and Correlative Noninvasive Imaging of the Bone-periodontal Ligament-tooth Fibrous Joint

In this study, the use of an in situ loading device coupled with micro-X-ray computed tomography for fibrous joint biomechanics will be discussed. Experimental readouts identifiable with an overall change in joint biomechanics will include: 1) reactionary force vs. displacement, i.e. tooth displacement within the alveolar socket and its reactionary response to loading, 2) three-dimensional (3D) spatial configuration and morphometrics, i.e.&#160;geometric relationship of the tooth with the alveolar socket, and 3) changes in readouts 1 and 2 due to a change in loading axis, i.e. concentric or eccentric loads.

In situ compressão de carga e de imagem não invasivos Correlative do Osso-Ligamento periodontal de dentes fibrosa Joint

This study demonstrates a novel biomechanics testing protocol. The advantage of this protocol includes the use of an in situ loading device coupled to a ...

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue function during development and organ homeostasis. It does so by acting via biochemical, biomechanical, and biophysical signaling pathways, such as through the release of bioactive ECM protein fragments, regulating tissue tension, and providing pathways for cell migration. The extracellular matrix of the tumor microenvironment undergoes substantial remodeling, characterized by the degradation, deposition and organization of fibrillar and non-fibrillar matrix proteins. Stromal stiffening of the tumor microenvironment can promote tumor growth and invasion, and cause remodeling of blood and lymphatic vessels. Live imaging of matrix proteins, however, to this point is limited to fibrillar collagens that can be detected by second harmonic generation using multi-photon microscopy, leaving the majority of matrix components largely invisible. Here we describe procedures for tumor inoculation in the thin dorsal ear skin, immunolabeling of extracellular matrix proteins and intravital imaging of the exposed tissue in live mice using epifluorescence and two-photon microscopy. Our intravital imaging method allows for the direct detection of both fibrillar and non-fibrillar matrix proteins in the context of a growing dermal tumor. We show examples of vessel remodeling caused by local matrix contraction. We also found that fibrillar matrix of the tumor detected with the second harmonic generation is spatially distinct from newly deposited matrix components such as tenascin C. We also showed long-term (12 hours) imaging of T-cell interaction with tumor cells and tumor cells migration along the collagen IV of basement membrane. Taken together, this method uniquely allows for the simultaneous detection of tumor cells, their physical microenvironment and the endogenous tissue immune response over time, which may provide important insights into the mechanisms underlying tumor progression and ultimate success or resistance to therapy.

The extracellular matrix undergoes substantial remodeling during wound healing, inflammation and tumorigenesis. We present a novel intravital immunofluorescence microscopy approach to visualize the dynamics of fibrillar as well as mesh-like matrix components with high spatial and temporal resolution using epifluorescence or two-photon microscopy.

Longo prazo intravital Imunofluorescência imagem do tecido componentes da matriz com epifluorescência e microscopia de dois fótons

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which facilitate the functional assessment of the seeded cells. To that end, microscale cantilever technology offers a platform with which to measure the contractile functionality of a range of cell types, including skeletal, cardiac, and smooth muscle cells, through assessment of contraction induced substrate bending. Application of multiplexed cantilever arrays provides the means to develop moderate to high-throughput protocols for assessing drug efficacy and toxicity, disease phenotype and progression, as well as neuromuscular and other cell-cell interactions. This manuscript provides the details for fabricating reliable cantilever arrays for this purpose, and the methods required to successfully culture cells on these surfaces. Further description is provided on the steps necessary to perform functional analysis of contractile cell types maintained on such arrays using a novel laser and photo-detector system. The representative data provided highlights the precision and reproducible nature of the analysis of contractile function possible using this system, as well as the wide range of studies to which such technology can be applied. Successful widespread adoption of this system could provide investigators with the means to perform rapid, low cost functional studies in vitro, leading to more accurate predictions of tissue performance, disease development and response to novel therapeutic treatment.

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

This protocol describes the use of microscale silicon cantilevers as pliable culture surfaces for measuring the contractility of muscle cells in vitro. Cellular contraction causes cantilever bending, which can be measured, recorded, and converted into readouts of force, providing a non-invasive and scalable system for measuring contractile function in vitro.

Utilização de microscópicos de silício Cantilevers para avaliar a função celular contrátil<em&gt; In Vitro</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Gradiente planar do sistema de difusão para investigar Quimiotaxia numa Matriz de Colagénio 3D

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Irritação dos olhos Test (EIT) para identificação de perigos de olho irritantes químicos usando reconstruída Humano Córnea-like epitelial (RHCE) Modelo Tissue

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

A longo prazo dispositivo de imagens ao vivo para melhor manipulação Experimental de larvas de Zebrafish

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular reactions. However, it is difficult to determine the relation between the size of a nanostructure and the responses of cells owing to the lack of proper screening tools. Here, we show the development of reproducible and cost-effective gradient nanopattern plates for the manipulation of cellular responses. Using anodic aluminum oxide (AAO) as a master mold, gradient nanopattern plates with nanopillars of increasing diameter ranges [120-200&#8239;nm (GP 120/200), 200-280&#8239;nm (GP 200/280), and 280-360&#8239;nm (GP 280/360)] were fabricated by a thermal imprinting technique. These gradient nanopattern plates were designed to mimic the various sizes of nanotopography in the ECM and were used to screen the responses of human endothelial colony-forming cells (hECFCs). In this protocol, we describe the step-by-step procedure of fabricating gradient nanopattern plates for cell engineering, techniques of cultivating hECFCs from human peripheral blood, and culturing hECFCs on nanopattern plates.

Here, we present a protocol for the fabrication of gradient nanopattern plates via thermal nanoimprinting and the method of screening responses of human endothelial progenitor cells to the nanostructures. By using the described technology, it is possible to produce a scaffold that can manipulate cell behavior by physical stimuli.

Fabricação de gradiente Nanopattern pela técnica de Nanoimprinting térmica e rastreio da resposta das células formadoras endoteliais humanas

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes and analysis of complex structural variants. Nanopore platforms perform single-molecule sequencing by directly measuring the current changes mediated by DNA passage through the pores and can generate hundreds of kilobase (kb) reads with minimal capital cost. This platform has been adopted by many researchers for a variety of applications. Achieving longer sequencing read lengths is the most critical factor to leverage the value of nanopore sequencing platforms. To generate ultra-long reads, special consideration is required to avoid DNA breakages and gain efficiency to generate productive sequencing templates. Here, we provide the detailed protocol of ultra-long DNA sequencing including high molecular weight (HMW) DNA extraction from fresh or frozen cells, library construction by mechanical shearing or transposase fragmentation, and sequencing on a nanopore device. From 20-25 &#181;g of HMW DNA, the method can achieve N50 read length of 50-70 kb with mechanical shearing and N50 of 90-100 kb read length with transposase mediated fragmentation. The protocol can be applied to DNA extracted from mammalian cells to perform whole genome sequencing for the detection of structural variants and genome assembly. Additional improvements on the DNA extraction and enzymatic reactions will further increase the read length and expand its utility.

Long-read sequences greatly facilitate the assembly of complex genomes and characterization of structural variation. We describe a method to generate ultra-long sequences by nanopore-based sequencing platforms. The approach adopts an optimized DNA extraction followed by modified library preparations to generate hundreds of kilobase reads with moderate coverage from human cells.

Sequenciamento de leitura ultralonga para análise de DNA genômico completo

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...