Este protocolo permite a inoculação de vetores virais diretamente em plantas de milho que podem ser facilmente aplicadas na maioria das configurações de laboratório sem a necessidade de qualquer equipamento especializado caro. A inoculação direta elimina o uso de um host alternativo como fonte inóculo, economizando tempo e recursos. Este método poderia ser aplicado a vetores virais adicionais, linhas de milho e potencialmente outras espécies monocot.
Comece plantando de 1 a 2 sementes de milho no meio de cultivo à base de turfa em pequenas pastilhas colocadas dentro das bandejas. Coloque as bandejas em uma câmara de crescimento abaixo de 16 horas por dia a 25 graus Celsius e noites de 8 horas a 22 a 25 graus Celsius, ou em uma estufa de 22 a 25 graus Celsius com 16 horas diárias e 8 horas noturnas. Regar regularmente plantas e fertilizar uma vez por semana com 15-5-15 fertilizantes líquidos a 330 partes por milhão de concentração.
Prepare a agrobacterium para injeção, inoculando a cepa de agrobacterium contendo a construção viral desejada em meios LB com antibióticos. Em seguida, incubar o frasco ou tubos a 28 graus Celsius enquanto treme a 225 RPM por 24 horas. No dia seguinte, pelota as bactérias por centrificação a 4.000 vezes G por 10 minutos em temperatura ambiente e descarte o sobrenante.
Em seguida, lave a pelota com um mililitro de água deionizada. Suspenda a pelota em um mililitro de solução de sulfato de magnésio milimão e meça a densidade óptica em 600 nanômetros. Em seguida, ajuste-o para 1.0.
Use mudas de milho de 4 a 7 dias para injetar agrobacterium. Monte a seringa e a agulha. Injete suavemente a suspensão bacteriana 2-3 milímetros acima do nó coleoptilular até que ele encha o coleoptile, ou seja visível na prostituta, pendente no estágio de crescimento das plantas.
Injete todas as mudas e troque a seringa e as agulhas para injetar cada construto. Confirme a infecção fenotípica observando lesões de silenciar os genes de controle, lesão imita 22 ou desaturação de fitoeno nas folhas. Use um dispositivo de imagem de fluorescência para triagem rápida de plantas e microscopia de fluorescência para detectar a presença da expressão GFP.
Realize a análise de expressão genética para detecção molecular de infecção. Extrair RNA total de folhas de plantas infectadas 14 a 21 dias após a infecção, e sintetizar o primeiro ramal de fio, conforme descrito no manuscrito do texto. Realize a transcriptase reversa PCR para confirmar a infecção e determinar a integridade do gene ou fragmento de interesse genético usando primers específicos projetados para diferentes construções virais.
Visualize o produto PCR em um gel de 1%agarose contendo uma mancha de ácido nucleico para determinar a presença ou ausência de vírus e gene ou fragmento genético. Este protocolo foi usado para inserir vírus recombinantes projetados para o gene em mudas de milho. Aproximadamente 12 dias após a injeção, foram observados fenótipos silenciados nas folhas como necrose e fotobleaching.
A presença de construto nas folhas após a infecção foi detectada observando a expressão de proteína fluorescente verde sob uma fluorescência usando um filtro GFP diferente. A expressão de proteína fluorescente verde nas folhas infectadas pelo vírus do mosaico de cauda-raposa foi visualizada como pequenas áreas pontuadas de fluorescência distribuídas pelas folhas e como grandes manchas nas folhas infectadas pelo vírus do mosaico de cana-de-açúcar. Utilizando a análise de expressão genética, foi confirmada a infecção sistêmica pelo vírus do mosaico de cauda de raposa e o silenciamento ou supressão genética da desaturação de fitoeno e da lesão imita 22.
O construto também utilizou eficiência de infecção influenciada. No caso da infecção pelo vírus do mosaico de rabo-de-raposa, o vírus do mosaico de rabo-de-raposa e a lesão do vírus do mosaico foxtail imitam 22 tipicamente as maiores eficiências de infecção em 53% e 54%, respectivamente. O vírus do mosaico foxtail se desatura uma eficiência ligeiramente menor em 39% e a proteína fluorescente verde do vírus do mosaico foxtail, com a menor eficiência em 16% Enquanto isso, a eficiência da infecção da proteína fluorescente verde do vírus do mosaico de cana-de-açúcar foi de 8% O tempo e os sintomas serão baseados no vetor viral e na linha de milho utilizada.
A falta de um fenótipo visual pode não significar falta de silenciamento ou expressão. Este método também pode ser aplicado às tecnologias de edição de genes, melhorando os métodos de entrega para guias RNAs.
