Com a manipulação optogenética de populações neuronais específicas ou regiões cerebrais, o comportamento pode ser modificado com alta resolução temporal e espacial em animais em movimento livre. Usando diferentes ferramentas optogenéticas em combinação com fibras ópticas cronicamente implantadas, uma variedade de modulações neuronais e testes comportamentais podem ser realizados. O objetivo final da optogenética é a modulação de circuitos neuronais com alta resolução temporal e espacial no animal comportado.
Em contraste com as manipulações farmacológicas ou elétricas, a optogenética permite o controle preciso de tipos celulares específicos em circuitos neuronais. A optogenética é a maneira perfeita de atingir tipos de células específicas em regiões especialmente definidas durante o comportamento, e examinar o efeito direto das mudanças nesses microcircuitos. Apresentaremos agora um passo para orientar como preparar e plantar e conduzir a optogenética em um camundongo em movimento livre.
Para a preparação do implante óptico, coloque um lado plano de ferrule de cerâmica em um torno de banco. Retire o código de uma fibra de vidro de 200 micrômetros de diâmetro, com uma ferramenta de descascamento de fibras e corte de dois a três centímetros não peças com um escriba de fibra cerâmica. Coloque o pedaço de fibra de vidro na ferrule cerâmica e coloque uma gota de uma supercola no lado plano com um cannular de injeção.
No lado redondo da ferrule cerâmica, corte a fibra de vidro o mais curto possível e coloque o pré-implante em um disco de polimento de ferrule para polir o lado redondo em quatro artigos de publicação diferentes. Em seguida, corte a fibra de vidro no lado plano da ferrule cerâmica, ao comprimento necessário para a implantação. Use um atlas cerebral do rato para calcular o comprimento do implante.
O implante tem que terminar diretamente acima da região de interesse. Antes da implantação, a anestesia é aplicada. A técnica precisa e estética é descrita no manuscrito.
Quando o mouse atingir um estado profundo de anestesia, coloque-o em uma placa de aquecimento e fixe a cabeça em um quadro estereotático. Conserte o nariz e os dentes na frente e as orelhas de ambos os lados. Aplique uma algesia com um cuprofen subcuntanesamente na parte de trás do mouse e aplique pomada opaca nos olhos em ambos os olhos para protegê-los da secagem.
Umedeça o cabelo no couro cabeludo com uma toalha de papel molhada e depois corte-o usando uma tesoura. Certifique-se de remover todos os cabelos soltos com uma toalha de papel molhada. Use uma vara de algodão para desinfetar o couro cabeludo com uma tintura contendo iodo.
Levante o couro cabeludo sobre a região de interesse com uma pinça e corte um centímetro ao longo da linha média. Para endurecer o crânio para implantação, aplique uma pequena quantidade de ácido fosfórico na cicatriz e deixe-o fazer efeito por 15 segundos. Remova todo o ácido com uma vara de algodão e enxágue a cicatriz com cloreto de sódio duas vezes.
Para uma injeção adequada, calcule o fator F para coordenadas individuais. Coloque um cannular de vidro na estrutura estereoctática e localize-o diretamente acima do bregma. Agora zero o sistema de coordenadas e mova a cânula de vidro para Lambda.
Calcule o fator F com a seguinte fórmula. Bregma menos Lambda dividido por 4,2 é igual ao fator F. Coordenadas exatas são muito importantes para injeção e implantação porque caso contrário, se a estrutura errada é estimulada, então os efeitos comportamentais são inespecíficos.
Todos os ratos têm desvios mínimos no tamanho de seu crânio, portanto, o coeficiente é absolutamente obrigatório. Use as coordenadas ajustadas para encontrar a localização da cicatriz diretamente acima da estrutura de interesse. Use uma cânula de injeção para fazer um buraco no crânio, girando a cânula no local.
Para levar uma solução de vírus para a cânula de vidro conectada à seringa, coloque uma gota de cloreto de sódio no crânio e um pedaço de pirofeno em cima. Coloque uma gota de duas soluçãos de vírus microliter no pirófeno e baixe a ponta da cânula de vidro no vírus. Aplique pressão negativa e espere até que a solução do vírus seja tomada pela cânula.
Zero para essa coordenada quando a ponta do vírus com cânula está no nível do crânio e lentamente abaixa-lo para o furo para a posição mais baixa do lado da injeção. Aplique uma pequena quantidade de pressão positiva com a seringa até que o menisco seja reduzido. Deixe o vírus se espalhar por dois a três minutos antes de mover a cânula de vidro para cima para a próxima posição.
Remova a cânula de vidro muito lentamente e descarte-a após a injeção final. Agora prepare o crânio para implantação. Seque o crânio com ar comprimido, aplique o primer com esta vara correspondente e deixe secar por 15 segundos.
Aplique o vínculo com a mesma vara e cure-o por 20 segundos com luz UV. Coloque o implante no suporte correspondente e posicione a ponta da fibra de vidro diretamente acima do furo e abaixe-o cuidadosamente. Pare de baixar o implante quando a válvula restante da supercola tocar o crânio.
A implantação de fibras ópticas também pode ser feita para estruturas bilaterais como o hipocampo. Isso permite uma leve estimulação em ambos os hemisférios ao mesmo tempo ou permite a estimulação de duas estruturas diferentes. Também é possível injetar o vírus em um local diferente do implante de fibra óptica.
Se a injeção e a implantação estiverem sendo feitas em diferentes regiões, faça todos os orifícios necessários após a aplicação do ácido fosfórico, mas antes da adesão dos dois componentes. Verifique novamente se o crânio ainda está completamente seco, em seguida, aplique cimento dental fluido ao redor do implante e na área circundante, em seguida, cure por 20 segundos com luz UV Aplique mais dois cimento menor em área de crânio completamente livre de peles e seca. Cure cada camada com luz UV.
Para terminar a cirurgia aplique unção de iodo em toda a ferida. Solte a fixação do nariz e da orelha, leve o mouse para uma gaiola fresca e coloque-o sob uma lâmpada de aquecimento para evitar a perda de calor corporal. Verifique seu estado de saúde pelo menos uma vez por dia e ele seguirá o posto operacional e algesia após três dias, se necessário.
Após duas semanas de recuperação, os ratos podem ser usados para experimentos comportamentais. Abra o Software Pulser e selecione a porta USB com na sua origem de luz. Escolha o modo de operação três para permitir que um software externo controle a fonte de luz.
Escolha o ajuste correto para 20 estimulação hertz com pulso de luz de cinco milissegundos. Para localizar a divisão para se comunicar com o pulsador, pressione a sequência inicial. Este status permanecerá até que os experimentos estejam concluídos.
Agora, crie um novo experimento no EthoVision XT, vá para o arquivo, escolha novo do modelo e selecione aplicar um modelo predefinido. Escolha o rastreamento ao vivo e selecione a câmera com origem e confirme a câmera Puslar Gen-Eye conectada. Escolha o mouse como o animal que deve ser gravado.
Selecione o modelo de arena, praça de campo aberto e o centro de modelo de zona, borda, cantos. Confirme um assunto que deve ser rastreado e selecione o ponto central, o ponto do nariz e a base da cauda. Confirme a cor animal em comparação com o fundo é mais escura e a taxa de amostra recomendada para terminar a etapa.
Nomeie o experimento apropriado e escolha um local para salvar. Até encontrar as configurações da arena, a câmera abrirá automaticamente uma imagem de fundo. Adapte as zonas predefinidas à arena real usando a seta e os dois símbolos em seu direito.
Se algumas zonas forem desnecessárias, exclua-as. Pressione a escala de desenho para calibrar e coloque uma linha de um canto do labirinto para o outro. Digite o comprimento da distância real em centímetros.
Repita isso para o outro eixo. Para definir as configurações de controle de ensaio, prepare a regra principal ajustando o tempo de condição para 20 minutos. A condição para Star Trek deve ser, quando o assunto está na arena por dois segundos, para um status automático do rastreamento quando o mouse está na arena.
Para criar uma sub-regra para a estimulação da luz, vá para estruturas, mais e selecione sub-regra. Coloque-o abaixo da regra principal e espalhe as duas caixas. Vá para condições, tempo e dê-lhe um nome como luz em um, ajustar a condição é atendida após cinco minutos.
Coloque a caixa logo atrás da regra Comece a caixa da sub-regra. Vá para ação hardware personalizado e nomeie-o com luz em um. Selecione ação para executar como:Vou colocar uma alta.
Coloque a caixa diretamente atrás da caixa de condição. Repita os passos para programar a luz acesa. Agora vá para estruturas, sub-regra referência e verifique se a referência pertence à sub-regra correta.
Escolha condições de partida sem demora e inicie condições como executar uma vez por condição de partida. Coloque a caixa de referência entre os livros extras um e os livros de condição dois da regra principal. Agora defina as configurações de detecção para mostrar ao sistema o que ele deve rastrear.
Coloque uma milhas de teste na arena e selecione a configuração automatizada. Escolha roedor como tipo animal e use o cursor do mouse para desenhar uma caixa ao redor dos ratos na arena. Confirme os resultados da pergunta de cuidado com sim.
Para o experimento de campo aberto, leve o mouse experimental para a sala de comportamento logo antes do experimento para garantir um nível adequado de ansiedade. Acoplado o rato ser uma fenda da fonte de luz pressionando-o suavemente para a grade da gaiola. Coloque-o em uma gaiola de espera com lixo fresco por 10 minutos para se aclimatar ao cabo de luz.
Inicie a aquisição pressionando o botão stop e você para a visão XT. Transfira o mouse da gaiola de espera para o canto superior esquerdo do campo aberto. Deixe o campo visual do mouse durante o experimento e mantenha a calma. Após 20 minutos, quando o experimento estiver concluído, remova o mouse do labirinto, desconecte o cabo de luz e coloque-o de volta em sua própria gaiola.
Por uma visualização de verificação, as diferenças no tempo central entre a luz desligada e a luz nos rostos podem ser vistas diretamente. O rato passa menos tempo no centro quando a luz está acesa. Para o experimento do labirinto Barnes, traga todos os ratos experimentais para a sala de comportamento cerca de uma hora antes do experimento.
Prepare o labirinto barnes fechando todos os buracos, exceto um, e agora que uma caixa de fuga é colocada. Conecte um rato na fonte de luz em ambos os implantes e coloque-o diretamente no meio do labirinto Barnes. Pressione o start e precisa visitar o próximo T e remover a caixa de caixa.
Esteja preparado para parar o teste manualmente apenas no caso de o software não reconhecer toda a transição. Retire o mouse do labirinto e remova a conexão com o cabo de luz. Ao realizar, aprender e fazer a tarefa de memória, não apenas o efeito imediato da manipulação é investigado, mas também o efeito a longo prazo da manipulação durante a aquisição, consolidação ou recuperação.
Para análise de dados, você encontra a condição de tratamento tratada ou controlada, vai para o ninho e seleciona o estado de controle de ensaio. Escolha o intervalo de estado do elemento de ação Star Trek para o elemento luz de ação que acende um. Coloque a caixa de aninhamento entre o tratamento da caixa do filtro e a caixa de resultado correspondente.
Este intervalo definido é de um. Repita as etapas para intervalos em um de dois e em dois como também para o grupo de controle. Também defina os parâmetros a serem analisados no perfil de análise.
Escolha a variável dependente na zona e selecione o centro da zona, o ponto do corpo, o ponto central e vá para as estatísticas de ensaio. Selecione frequência, duração cumulativa e deixe lá para ver o primeiro. Adicione também o movimento de distância como variável.
Com esse perfil, os dados do tempo gasto no centro, entradas do centro e ditos para a mudança à distância estão disponíveis. Para extrair dados de cada divisão, vá para resultados e selecione estatísticas e gráficos, pressione calcular para ver os dados analisados. Pressione os dados de exportação e selecione as estatísticas de teste e o local a ser salvo.
Os dados exportados são salvos como um arquivo excel e com valores individuais para cada mouse. Além disso, vá para visualização de mapas de calor e pressione mapas de calor do gráfico, selecione testes à direita para ver mapas de calor individuais para cada mouse e teste. Faça um clique com o botão direito do mouse e exporte os mapas de calor como imagens.
Posteriormente, abra o arquivo excel do computador e calcule o SCM médio e padrão de euros para todos os quatro ensaios e cada grupo de condicionamento medido. Para gerar gráficos e plotagem Sigma, copie os meios e o SCM na ordem correta do arquivo extra para o gráfico Sigma. As linhas têm que conter os dados para fora um, em um, e as colunas contêm ensaio, médio e hertz SCM.
Selecione as três colunas e vá para criar gráficos. Selecione a caixa de barras e escolha a caixa não agrupada com seta. Rotule todo o gráfico, vá para casa, selecione a caixa de gráfico e pressione a exportação.
Selecione a pasta de destino e escolha meta arquivo como formato. Para calcular as estatísticas dos dados obtidos, copie os dados certos de Xcel um contra um, etc. e para colunas únicas do plot Sigma. Marque as colunas que deseja comparar e vá para análise, escolha o teste T e pressione.
Finalmente, os dados comportamentais podem ser mostrados divididos em desapontação e em teste com especialização adicional do mapa de calor. No experimento de campo aberto, durante a estimulação leve de Channelrhodopsin2 e neurônios piramidários, a duração central é diminuída, o que indica aumento dos níveis de ansiedade. Através da imunohistoquímica, o local de injeção e a expressão do vírus podem ser determinados, também na especificidade da linha especial de camundongos dependentes de Cre pode ser validado.
Pode-se ver claramente que a estimulação leve de Channelrhodopsin2 melhora os neurônios mentais desta região específica do córtex aumenta os níveis de ansiedade, em comparação com a ansiedade da linha de base antes dessa estimulação. Esse efeito imediato da manipulação do comportamento é a razão pela qual a optogenética é usada hoje em dia para tantas questões de pesquisa sobre o comportamento. Este procedimento pode ser usado para modulação optogenética de qualquer tipo de célula desejada ou circuitos neuronais no cérebro do camundongo.
Ao combinar este procedimento com testes comportamentais adequados para sua pesquisa, uma visão mais profunda dos circuitos neuronais envolvidos em comportamentos e doenças de interesse pode ser adquirida.
